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FITC标记的维生素B12衍生物及其合成方法与应用

FITC标记的维生素B12衍生物及其合成方法与应用

IPC分类号 : C07H23/00,C07H1/00,C09K11/06,A61K49/00,G01N15/14,G01N21/31

申请号
CN201710089234.1
可选规格
  • 专利类型: 发明专利
  • 法律状态: 有权
  • 申请日: 2017-02-17
  • 公开号: 107216363B
  • 公开日: 2017-09-29
  • 主分类号: C07H23/00
  • 专利权人: 南方医科大学南方医院

专利摘要

本发明涉及一种新型的荧光标记的维生素B12衍生物,即异硫氰酸荧光素(FITC)标记的维生素B12衍生物,简称为VB12‑FITC。本发明所述的VB12‑FITC的制备方法包括:在VB12结构的低反应活性‑OH基团上,偶联双氨基,进而与FITC的异硫氰酸根反应,合成VB12‑FITC衍生物。本发明所提供的FITC标记的维生素B12的制备条件温和(可在常温下进行),原料低毒,操作方法简便,合成效率高,反应产物性质稳定,具有良好的荧光显像效果。本发明所提供的FITC标记的维生素B12具有肿瘤摄取靶向性,在VB12吸收代谢途径、肿瘤显像治疗等方面的研究具有重要的价值。

权利要求

1.一种异硫氰酸荧光素(FITC)标记的维生素B12衍生物(VB12-FITC),其特征在于,所述衍生物具有如下的分子结构式:

2.如权利要求1所述的VB12-FITC的制备方法,其特征在于,包括:在VB12结构的低反应活性-OH基团上,偶联双氨基,进而与FITC的异硫氰酸根反应,合成VB12-FITC衍生物。

3.根据权利要求2所述的VB12-FITC的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(A)维生素B12的氨基化:在惰性气体气保护下,将维生素B12溶解于经除水处理的二甲基亚砜(DMSO)中,按照1:1-1:2比例加入活化剂N,N'-羰基二咪唑(CDI),20-25℃下避光活化6-12小时,按照1:2-1:5比例加入二氨基化合物,继续在20-25℃下反应3-12小时;沉淀并分离反应产物,20-25℃下干燥得到氨基化的维生素B12;

(B))FITC与氨基化维生素B12的偶联:将步骤A中反应得到的氨基化维生素B12溶解于经除水处理的二甲基亚砜(DMSO),按照1:1-1:2比例加入催化剂三乙胺,按照1:1.5比例加入异硫氰酸荧光素(FITC),20-25℃下避光反应4-12小时,沉淀并分离反应产物,20-25℃下干燥得到FITC标记的维生素B12。

4.根据权利要求3所述的VB12-FITC的制备方法,其特征在于:所述步骤A中选用的二氨基化合物为1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷。

5.根据权利要求3所述的VB12-FITC的制备方法,其特征在于:所述步骤A和B中,在沉淀时加入丙酮作为沉淀剂。

6.根据权利要求3所述的VB12-FITC的制备方法,其特征在于:所述步骤A和B中,在分离反应产物时,采用离心机在10000r/min条件下离心10min,除去未反应的化合物。

7.根据权利要求3所述的VB12-FITC的制备方法,其特征在于:所述步骤A和B中,所述干燥是真空干燥。

8.如权利要求1所述的VB12-FITC在制备诊断和监测VB12吸收代谢途径以及肿瘤中的显像治疗剂中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种维生素B12衍生物,特别是涉及一种新型的荧光标记的维 生素B12衍生物,简称为VB12-FITC,以及该衍生物的合成方法以及应用。

背景技术

维生素B12,又称甲钴胺,是一种人体必需的水溶性维生素,无法在体内自 身合成,仅能通过食物摄入,并储存于肝脏中。在人体缺乏持续补充外源性维生 素B12的情况下,肝脏中储存的维生素B12总量在3-6个月内即被消耗殆尽。 在人体细胞代谢的甲基化、维护神经髓鞘的代谢与功能、促进红细胞的发育与成 熟、参与脱氧核酸(DNA)的合成、脂肪及碳水化合物的代谢、核酸与蛋白质 的合成等多个重要环节,均离不开维生素B12的参与。随着维生素B12的缺乏, 最终导致恶性贫血、不可逆性神经病变等并发症。

维生素作为参与一碳基团代谢的辅酶,与核酸和蛋白质的合成密切相关。细 胞的增殖和发育过程中,核酸和蛋白质的合成显著加快,因而在快速增殖组织— —肿瘤病灶中,针对维生素B12受体数目显著上调,表现出对维生素摄取的显 著增加,因而肿瘤对VB12有高摄取现象。这一特性使维生素B12本身具有一定 的肿瘤靶向性,在肿瘤吸收代谢途径、肿瘤显像治疗等方面的研究,维生素B12 一定意义。

维生素B12的正常吸收代谢、肿瘤代谢特点日益得到关注,其吸收代谢途 径、及该途径下新型靶向给药,是近年关注研究热点,所以维生素B12的显像、 可视化显得尤为重要。目前VB12的显像标记,主要通过放射性核素Co+、111In、 10B、99mTc或正电子Cu+标记等途径来实现,该类方法需要特殊显像设备、成 本高、操作难度大,另外放射性核素、正电子对人体均有放射性的损害。荧光显 像是目前相对安全、成本低廉、无需借助超大型仪器、操作简便的显像方法,在 维生素B12吸收研究中若能通过荧光标识,可极大降低操作的难度及成本。

然而,维生素B12结构上可反应基团少,难以直接与荧光剂直接反应结合, 必须先在本结构上增加一个“桥梁”,可同时与VB12、荧光剂结合,进而完成 维生素B12的荧光标记。但维生素B12本身结构不稳定,见光、遇热易分解, 在剧烈反应条件下则有降解的可能,因此维生素B12荧光标记有很大难度。本 发明通过偶联二氨基化合物,将维生素B12结构上的-OH转化成反应活性更高 的氨基,在室温下再与FITC的异硫氰酸根反应,从而实现在温和条件下制备 FITC荧光标记VB12。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种FITC标记的维生素B12衍生物,所构建 的荧光标记的VB12在维持VB12原有结构的前提下,常温下活化其低反应活性 基团,从而解决了目前核素、正电子标记的维生素B12显像存在成本高、操作 难度大等难题。

本发明所述的FITC标记的维生素B12衍生物(VB12-FITC),具有如下的 分子结构式:

本发明的第二个目的是提供所述的FITC标记的维生素B12衍生物的制备方 法。

本发明所述的VB12-FITC的制备方法包括:在VB12结构的低反应活性-OH 基团上,偶联双氨基,进而与FITC的异硫氰酸根反应,合成VB12-FITC衍生物。

在一个优选实施例中,本发明所述的VB12-FITC的制备方法包括以下步骤:

(A)维生素B12的氨基化:在惰性气体气保护下,将维生素B12溶解于经 除水处理的二甲基亚砜(DMSO)中,按照1:1-1:2比例加入活化剂N,N'-羰基二 咪唑(CDI),20-25℃下避光活化6-12小时,按照1:2-1:5比例加入二氨基化合 物,继续在20-25℃下反应3-12小时;沉淀并分离反应产物,20-25℃下干燥得 到氨基化的维生素B12;

(B)FITC与氨基化维生素B12的偶联:将步骤A中反应得到的氨基化维 生素B12溶解于经除水处理的二甲基亚砜(DMSO),按照1:1-1:2比例加入催化 剂三乙胺,按照1:1.5比例加入异硫氰酸荧光素(FITC),20-25℃下避光反应4-12 小时,沉淀并分离反应产物,20-25℃下干燥得到FITC标记的维生素B12。

根据本发明所述的VB12-FITC的制备方法的进一步特征,所述步骤A中选 用的二氨基化合物为1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷。

根据本发明所述的VB12-FITC的制备方法的进一步特征,所述步骤A和B 中,在沉淀时加入丙酮作为沉淀剂。

根据本发明所述的VB12-FITC的制备方法的进一步特征,所述步骤A和B 中,在分离反应产物时,采用离心机在10000r/min条件下离心10min,除去未反 应的化合物。

根据本发明所述的VB12-FITC的制备方法的进一步特征,所述步骤A和B 中,所述干燥是真空干燥。

本发明第三个目的在于提供所述的VB12-FITC的应用,也就是所述的 VB12-FITC在制备诊断和监测VB12吸收代谢途径以及肿瘤中的显像治疗剂中 的应用。

基于本发明所述的VB12-FITC所制备的显像治疗剂在评估VB12-FITC衍生 物在诊断和监测VB12吸收代谢新途径以及肿瘤中具有良好的应用前景。

本发明具有如下有益效果:

(1)本发明所提供的FITC标记的维生素B12的制备条件温和(可在常温 下进行),原料低毒,操作方法简便,合成效率高,反应产物性质稳定,具有良 好的荧光显像效果;

(2)本发明所提供的FITC标记的维生素B12具有肿瘤摄取靶向性,在VB12 吸收代谢途径、肿瘤显像治疗等方面的研究具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明所述的FITC标记维生素B12的1HMR质谱图。

图2是本发明所述的FITC标记维生素B12的HPLC图。

图3是本发明所述的FITC标记维生素B12的流式分析结果图。

图4是本发明所述的FITC标记维生素B12的共聚焦显微镜结果图。

图5是本发明所述的FITC标记维生素B12的在体成像图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1:本发明所述的VB12-FITC的制备

(A)氮气保护下将200mg的维生素B12溶解于4ml经除水处理的二甲基 亚砜(DMSO),加入200mg的活化剂N,N'-羰基二咪唑(CDI),20℃下避光活 化12小时,加入400mg二1,8-氨基-3,6-二氧杂辛烷,继续在20℃下反应6小时。 用500ml丙酮沉淀反应产物,并在10000r/min条件下离心10min分离反应产物, 20℃下真空干燥得到氨基化的维生素B12。

(B)将步骤A得到的氨基化维生素B12,称取150ng溶解于4ml经除水处 理的二甲基亚砜(DMSO),加入0.1ml的催化剂三乙胺,按照1:1比例加入FITC, 20℃下避光反应6小时,沉淀并分离反应产物,20℃下真空干燥得到FITC标记 的维生素B12。

实施例2:本发明所述的VB12-FITC的制备

(A)氮气保护下将200mg的维生素B12溶解于4ml经除水处理的二甲基 亚砜(DMSO),加入300mg的活化剂N,N'-羰基二咪唑(CDI),22℃下避光活 化12小时,加入600mg的1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷,继续在22℃下反应6小 时。用500ml丙酮沉淀反应产物,并在10000r/min条件下离心10min分离反应 产物,22℃下真空干燥得到氨基化的维生素B12。

(B)将步骤A得到的氨基化维生素B12,称取150ng溶解于4ml经除水处 理的二甲基亚砜(DMSO),加入0.1ml的催化剂三乙胺,按照1:1.25比例加入 FITC,22℃下避光反应6小时,沉淀并分离反应产物,22℃下真空干燥得到FITC 标记的维生素B12。

实施例3:本发明所述的VB12-FITC的制备

(A)氮气保护下将200mg的维生素B12溶解于4ml经除水处理的二甲基 亚砜(DMSO),加入400mg的活化剂N,N'-羰基二咪唑(CDI),25℃下避光活 化12小时,加入800mg二1,8-氨基-3,6-二氧杂辛烷,继续在25℃下反应6小时。 用500ml丙酮沉淀反应产物,并在10000r/min条件下离心10min分离反应产物, 20℃下真空干燥得到氨基化的维生素B12。

(B)将步骤A得到的氨基化维生素B12,称取150ng溶解于4ml经除水处 理的二甲基亚砜(DMSO),加入0.1ml的催化剂三乙胺,按照1:1.5比例加入 FITC,25℃下避光反应6小时,沉淀并分离反应产物,20℃下真空干燥得到FITC 标记的维生素B12。

实施例4:本发明所述的VB12-FITC的分析

(1)VB12-FITC的合成验证:利用高效液相色谱仪(HPLC)、质谱分析仪, 分别检测VB12、FITC各自的波谱、分子量,验证VB2-FITC的偶联。

(2)VB12-FITC的肿瘤吸收流式分析:培养胃癌细胞(AGS)至70-80% 的密度,加入VB12-FITC,共孵育4h后,PBS重悬两次后,使用流式细胞仪检 测细胞对荧光标记维生素B12的吸收率。

(3)VB12-FITC的肿瘤吸收显像:在共聚焦皿中培养胃癌细胞(AGS)至 70-80%的密度,加入VB12-FITC,在不同时间段固定细胞,用DAPI染细胞核, 并用激光共聚焦观察VB12-FITC的吸收部位及吸收量。

(4)VB12-FITC的在体肿瘤显像:利用慢病毒转染技术,在胃癌细胞(AGS) 中稳定转入表达红光载体片段,进而扩大培养细胞。取1×107细胞,注射入裸 鼠皮下,构建胃癌裸鼠模型。在尾静脉注射VB12-FITC前后,分别用活体成像 仪观察VB12的肿瘤靶向性。

质谱分析结果如图1所示:FITC标记的维生素B12,经过离子化后带上二 价电荷,出现不同质荷比的离子碎片(1007.41、1020.92,1034.42丰度最高)是 因为FITC标记的维生素B12分子结构比较复杂,离子化过程带上不同数量的正 离子(Na+、K+或H+),如1034的离子碎片带上了两个钾离子、三个钾离子和3 个氢离子:1034×2-1918(FITC-VB12)=39(K+)×2+23(Na+)×3+3×1(H+)。

高效液相色谱法分析如图2所示:用荧光检测器FLD,采用FITC的激发波 长490nm,发射波长为520nm,从高效液相的流出曲线看,FITC修饰VB12后, 分子极性发生变化,相比FITC,更快流出柱子,FITC-VB12的流出时间为15.1min, FITC的流出时间为16.8min。从FITC-VB12的流出曲线看,没反应的FITC的 残留非常少,说明标记效率较高。

流式分析结果如图3所示:AGS在FITC通道有90.9%的阳性率,这提示 AGS胃癌细胞对VB12-FITC有高度摄取能力。

共聚焦显微镜结果如图4所示:随着时间增加,FITC标记维生素B12的胃 癌细胞的吸收量逐渐增加。

活体成像结果如图5所示:在胃癌裸鼠模型中,FITC标记维生素B12在肿 瘤部位高度聚集。

FITC标记的维生素B12衍生物及其合成方法与应用专利购买费用说明

专利买卖交易资料

Q:办理专利转让的流程及所需资料

A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。

1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2:按规定缴纳著录项目变更手续费。

3:同时提交相关证明文件原件。

4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q:专利转让变更,多久能出结果

A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。

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