IPC分类号 : B82B3/00,B82B1/00,B82Y30/00,B82Y40/00,B82Y5/00,C12N1/20,C12R1/01
专利摘要
本发明公开了海水嗜冷杆菌合成并进行自组装的生物纳米材料及其制备方法与应用，该制备方法包括将海水嗜冷杆菌(Psychrobacteraquimaris)X3‑1403与至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基接触培养的步骤，培养后，离心去除上清液，即得到生物纳米材料；其中，海水嗜冷杆菌(PsychrobacteraquimarisX3‑1403)，属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCCM2016155。培养海水嗜冷杆菌的过程即为合成纳米羟基磷灰石和生物纳米材料的过程，培养时条件温和，操作简单，清洁无污染，成本低廉，效率高且能大规模推广应用。
权利要求
1.一种生物纳米材料的制备方法，其特征是：该制备方法包括将海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)X3-1403与至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基接触培养的步骤，培养后，离心去除上清液，即得到生物纳米材料；具体方法如下：所述海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)X3-1403在15～30℃，培养基pH值7～8、盐度为0～12％培养条件下得到生物纳米材料；其中，
海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)X3-1403，属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016155；
培养基中磷元素的浓度为0.3mM～1.3mM。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述海水嗜冷杆菌(Psychrobacteraquimaris)X3-1403与至少含有钙、磷、氢和氧元素的培养基接触培养的步骤在于：用该菌株接种所述至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：
(1)将海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)X3-1403在LB培养基中活化，得到活化后的菌液；
(2)然后将步骤(1)中的菌液接种到至少含有钙、磷、氢和氧元素的培养基中进行培养；培养后，离心去除上清液，即得到生物纳米材料。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所述活化的时间为18～30h，活化的培养条件为180～220rpm，15～30℃。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：在步骤(1)后进一步的步骤为：将活化后的菌液离心，去其上清液，然后采用去离子水重置悬菌液，然后离心，再去其上清液采用去离子水重置悬液，备用。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，培养条件为180～220rpm，15～30℃，培养时间为42～56h；所述培养基为LB培养基或海水冲厕废水或模拟海水冲厕废水或生活废水或模拟生活废水。
7.采用权利要求1～6中任一项所述的方法制备得到生物纳米材料。
8.下述中的任一应用：
权利要求7所述的生物纳米材料在去除水中的氟、吸附苯酚、去除铅镉或其它重金属和放射性废物中的应用；
去除权利要求7所述的生物纳米材料中有机物之后的纳米材料在制备药物载体、硬组织修复材料、抗肿瘤药物、人工骨骼和人工牙齿中的应用。
9.一种纳米羟基磷灰石的制备方法，其特征是：将权利要求7所述的生物纳米材料进行提纯分离，即得到纳米羟基磷灰石。
说明书
技术领域
本发明涉及一种海水嗜冷杆菌合成并进行自组装的生物纳米材料及其制备方法与应用。
背景技术
纳米材料是指在三维材料中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料具有表面效应、小尺寸效应、量子效应等一些独特的特性，从而被广泛应用于环保、能源、催化、生物传感器、生物医学等行业。
传统的物理化学合成纳米材料的方法主要有两相法、反相微乳法、光化学合成法、电极电解法以及加热法、超声法等等，但是这些传统的合成方法具有种种难以克服的缺陷，如原料价格高，耗能高，反应条件苛刻或者难于规模化生产，同时化学合成方法往往需要前驱体，然而这些前驱体价格昂贵且可能具有毒性，并且化学合成方法都需要在高饱和度的溶液中进行，需要投加大量化学试剂导致成本较高，这些缺陷都极大的限制了化学方法的应用。与之相比，生物合成材料具有清洁、反应条件温和、成本低、操作简单等优势，且生物合成的纳米材料具有良好的分散性、稳定性、生物相容性及可调节性等优点，现已成为国内外研究热点。
目前已发现的具有合成纳米材料的微生物种类很有限，主要包括原核生物和真核生物，如细菌、酵母菌、某些病毒离子、真菌及植物等具有胞外、胞内合成或纳米自组装的能力，同时也有个别利用植物提取物以及天然多糖海洋多糖等合成纳米材料的报道。
磷是一种有限的重要资源，而磷过度排放到水体中既会引起水体富营养化和赤潮等危害，又会造成磷资源的浪费。同时，陆地上已探明的可用磷资源在未来几十年内将被开采殆尽。因此，磷的循环利用，尤其是从废水中回收磷越来越受到人们的重视。纳米羟基磷灰石作为一种回收磷的有效手段，并将其作为产品应用到环境、生物医药等领域越来越受到人们的关注。目前，纳米羟基磷灰石的制备方法主要有水热法、化学沉淀法、微波固相法、溶胶-凝胶法、自燃烧法和电化学沉积法等。但是这些方法的合成条件苛刻、工艺复杂、成本高昂、原料和能源利用率低，且生产规模也极其有限。因此，寻求一种成本低廉、清洁无污染、合成条件温和、尺寸可控、分散性好、效率高且能大规模生产的新方法迫在眉睫。
与之相比物生物法具有无可比拟的优势，但微生物法的关键是寻找能合成纳米材料并具有自组装功能的特殊功能微生物。海洋微生物由于其特殊的生存环境，往往能在环境中形成特殊的功能。目前已有研究人员探索将特定的海洋菌应用于废水的生物处理技术领域，并取得了一定的进展。
但目前这些研究主要停留在纯菌摇瓶实验阶段或作为生物强化剂，而要应用到实际中仍有许多问题需要克服，如纯菌难沉降和强化菌在体系中的竞争力不足等。同时，这些研究主要集中于如何降解废水中的污染物，并不能充分利用废水中的有用物质，在去除污染物的同时生成新的资源，从而达到变废为宝，资源循环利用的目的。近些年，国外虽已有以菌株为载体、在超饱和状态的特定培养基中合成纳米羟基磷灰石的报道，但仅限于沙雷氏菌属(Serratia sp.)，该沙雷氏菌Serratia sp.能够在不同的培养条件下可以合成不同粒径和特性的羟基磷灰石纳米颗粒。但该沙雷氏菌Serratia sp.只能在高饱和的溶液(P：5mM)以及生物缓冲液中产生钙磷纳米颗粒，并且此类钙磷纳米颗粒的产生并不是严格意义上的生物合成，而是一种生物降解过程。该沙雷氏菌Serratia sp.通过产生一种非典型性酸性磷酸酶来分解基质中的甘油磷酸钠从而释放出大量无机磷酸根离子，高浓度的磷酸根离子与钙离子在细胞表面或者胞外聚合物中形成羟基磷灰石纳米颗粒，然后将之应用于水溶液中放射性核素的去除。海水冲厕废水由于其高磷、高盐度，在处理时具有很大的难度。同时，纳米组装体系、人工组装合成的纳米结构材料体系是近年来纳米材料研究的新热点和难点,生物合成纳米羟基磷灰石并进行自组装对于纳米材料形貌控制具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种生物纳米材料及其制备方法和应用。
本发明为实现上述目的而采用的技术方案是：
本发明的第一个目的是提供一种生物纳米材料的制备方法，其特点是：该制备方法包括将Psychrobacter aquimaris X3-1403(海水嗜冷杆菌X3-1403)与至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基接触培养的步骤，培养后，离心去除上清液，即得到生物纳米材料。
本发明提供的Psychrobacter aquimarisX3-1403(海水嗜冷杆菌X3-1403)，属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016155。
本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)可在15～30℃，培养基pH值7～8、盐度为0～12％(最佳1％～5％)培养条件下生长，菌体形态特征为革兰氏染色呈阴性，电子显微镜下观察为球菌或短杆菌，单独、成双或聚集成团，有荚膜、无鞭毛。菌株固体LB培养24h菌落特征为圆形，光滑，奶油色。
本发明中的盐度是指培养基(或者液体)中溶解物质质量与培养基(或者液体)质量的比值。
优选的，所述海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)与至少含有钙、磷、氢和氧元素的培养基接触培养的步骤在于：用该菌株接种所述中至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基。
优选的，所述培养基的pH值7～8、盐度为1％～5％。
优选的，所述培养基中的磷元素的浓度为0.3mM-1.3mM。
进一步优选的，所述培养基为LB培养基或海水冲厕废水或模拟海水冲厕废水或生活废水或模拟生活废水。所述LB培养基是由海水、蛋白胨和酵母粉制备得到，其中所述蛋白胨的质量分数为1％，酵母粉的质量分数为0.3％。所述模拟海水冲厕废水的配方为表1所示，所述模拟生活废水的配方为表2所示。
本发明中一个较为具体的实施方式，一种生物纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)在LB培养基中活化，得到活化后的菌液；
(2)然后将步骤(1)中的菌液接种到至少含有钙、磷、氢和氧元素的培养基中进行培养；培养后，离心去除上清液，即得到生物纳米材料。
步骤(1)中，所述活化的时间为18～30h(优选24h)，活化的培养条件为180～220rpm，15～30℃，优选为200rpm和25℃。
在步骤(1)后进一步的步骤为：将活化后的菌液离心，去其上清液，然后采用去离子水重置悬菌液，然后离心，再去其上清液采用去离子水重置悬液，备用。
步骤(2)中，培养条件为180～220rpm，15～30℃，优选为200rpm和25℃，培养时间为42～56h，优选48h。
优选的，该步骤所述培养基为LB培养基或海水冲厕废水或模拟海水冲厕废水或生活废水或模拟生活废水。
优选的，所述接种量为8～12％。
优选的，将得到的生物纳米材料进行真空冷冻干燥，并研磨成粉末，保存备用。
本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的生物纳米材料。该生物纳米材料主要包括海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)菌体、该菌体自絮凝、自组装产生纳米羟基磷灰石以及该菌体代谢产生的其它物质。
本发明的第三个目的是提供所述生物纳米材料的应用，其应用主要包括环境领域和生物医药领域的应用。
环境领域：去除水中的氟、吸附苯酚、去除铅镉或其它重金属和放射性废物。
其中，重金属元素可以与氨基酸侧链上的硫原子、氮原子发生作用，具有很高的毒性。随着环境污染事件的发生，环境重金属污染以及修复问题受到广泛关注。环境重金属污染现有修复方法主要有物理修复、化学修复及生物修复的方法。其中化学修复需要向污染环境如土壤、水体等额外投加化学药剂使重金属离子发生吸附、氧化还原反应、沉淀等作用，此方法尽管操作简单效果明显但是易产生二次污染且费用较高。利用含磷材料对环境重金属污染进行修复是一种有效的方法。本发明的生物纳米材料包括由该菌体生成的纳米羟基磷灰石，所以其可以应用于环境重金属污染的修复，具有操作简单及成本较低的优势；并且，该生物纳米材料还包括活性菌体，菌体对重金属做进一步的吸附效果。
生物医药领域：本发明中去除有机物的纳米生物材料(去除有机物后保留纳米羟基磷灰石)在制备药物载体、抗肿瘤药物、硬组织修复材料、人工骨骼、人工牙齿中的应用。
纳米材料在生物医学药学、人类健康等生命科学领域有重大应用，如利用纳米颗粒作为载体输送药物至病灶部位、利用纳米材料做为生物医学检测诊断用材料等。磷酸钙盐如羟基磷灰石是动物及人体骨骼及牙齿的主要无机矿物成分，具有良好的活性与生物相容性，如羟基磷灰石陶瓷，是一种很有前景的人工骨及人工口腔材料。生物合成的纳米磷酸钙材料既具有纳米材料的特性，又具有更好的生物相容性和适应性，如纳米羟基磷灰石在生物医学领域具有广泛的应用前景。
本发明的第四个目的是提供一种纳米羟基磷灰石的制备方法，将上述生物纳米材料提纯分离得到纳米羟基磷灰石，所述提纯分离的具体方法可以采用灼烧上述生物纳米材料，将其中的有机物去除，即可得到纳米羟基磷灰石。
采用上述方法得到的纳米羟基磷灰石材料的粒径分布均匀，通过控制制备方法的条件可以制备得到所需要的粒径大小和形貌尺寸，并且本发明的菌株采用自组装方式得到的纳米羟基磷灰石的成膜性较好，在制备薄膜材料具有较好的应用；在本发明的一个具体实施方式中，得到的纳米羟基磷灰石呈现蜂巢状，结构十分紧凑。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过筛选分离得到一株具有自絮凝、自组装功能的纳米羟基磷灰石合成菌株-Psychrobacter aquimaris X3-1403，经研究发现该菌株可以合成纳米羟基磷灰石，得到的包含纳米羟基磷灰石的生物纳米材料在环境领域具有广泛的应用。
(2)本发明采用微生物Psychrobacter aquimaris X3-1403合成纳米羟基磷灰石，培养海水嗜冷杆菌的过程即为合成纳米羟基磷灰石和生物纳米材料的过程，培养时条件温和，操作简单，清洁无污染，成本低廉，效率高且能大规模推广应用。尤其是海水嗜冷杆菌采用的原料易得，可以采用具有一定盐度的生活废水和海水冲厕废水作为海水嗜冷杆菌X3-1403的原料，所述海水嗜冷杆菌X3-1403能够自絮凝、自组装纳米羟基磷灰石。
(3)本发明所述菌株在去除废水中磷的同时可以利用废水中原料在低饱和度条件下合成钙磷纳米颗粒，且具有纳米自组装的能力，不需要额外投加化学试剂，环境友好成本低。
(4)本发明在合成生物纳米材料及羟基磷灰石时无需高温高压，不需调节PH，亦不需要前驱体，具有操作简单、无二次污染等优点。
(5)本发明的得到的纳米羟基磷灰石材料的粒径分布均匀，通过控制培养菌株条件可以制备得到所需要的粒径大小和形貌尺寸，相比于现有技术中的纳米羟基磷灰石，采用本发明菌株自絮凝、自组装的方式得到的纳米羟基磷灰石材料和生物纳米材料成膜性更好；在本发明的一个具体实施方式中，得到的纳米羟基磷灰石呈现蜂巢状，结构十分紧凑，节约能量。
附图说明
图1是本发明菌株革兰氏染色结果图。
图2是本发明菌株菌体形态AFM图。
图3：Psychrobacter aquimaris X3-1403在模拟海水冲厕废水中对TP、COD、NH4
图4：菌体在模拟海水冲厕废水中的自絮凝的电镜照片。
图5：菌体在模拟海水冲厕废水中的自组装及合成纳米材料的透射电镜照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1本发明所述的菌株Psychrobacter aquimaris X3-1403的筛选
1、筛选过程
⑴将取自于中国南海的464株菌株在海水LB液体培养基中培养24h(200rpm、25℃)，并观察在振荡培养过程中是否有自絮凝颗粒形成。
⑵将能在振荡培养过程中自絮凝的菌株在5000rpm下离心10min，弃去上清液，用去离子水清洗两遍菌体，然后在透射电镜下观察菌体表面是否有纳米级颗粒产生。
⑶将上面筛选得到的能在振荡培养过程中自絮凝且菌体表面产生纳米级颗粒的菌株在光学显微镜观察菌株是否有自组装现象。
⑷筛选得到的能够在振荡培养过程中自絮凝、自组装且菌体表面产生纳米级颗粒的菌株即为本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)。
2、菌株的鉴定：菌落特征及菌体形态
本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)可在15～30℃，pH值7～8，盐度为1％～5％培养条件下生长，菌体形态特征为革兰氏染色呈阴性，如图1所示，电子显微镜下观察为球菌或短杆菌，单独、成双或聚集成团，有荚膜、无鞭毛。菌株固体LB培养24h菌落特征为圆形，光滑，奶油色，如图2所示。
3、菌株的鉴定：16S rDNA序列分析
海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：
将所测16S rDNA核苷酸序列与输入到NCBI网站的GenBank数据库中的进行相似性序列比对后，结果表明：海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)与Psychrobacter同处于一个最小分支上，其16S rDNA序列与Psychrobacter aquimaris的相似性达99.64％。结合菌落形态和16S rDNA序列分析，鉴定为海洋嗜冷杆菌(Psychrobacteraquimaris)。
通过菌株X3-1403的分子鉴定结果，进一步确认菌株Psychrobacter aquimarisX3-1403为海洋嗜冷杆菌属(Psychrobacter aquimaris)，将Psychrobacter aquimarisX3-1403(海水嗜冷杆菌X3-1403)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016155。
实施例2本发明的菌株在含磷盐水处理中的应用
将海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)在LB中培养24h后，以10％的接种量接种到模拟海水冲厕废水中，并按时间点取样测定该菌株对TP、COD、NH4
实施例3本发明菌株在制备纳米材料纳米羟基磷灰石中的应用
本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)在LB培养基中活化24h，其培养条件为200rpm、25℃。然后①在无菌操作台中用事先灭菌的离心管取25mL活化的培养液，10000rpm离心10min；②去其上清液，然后用10mL的灭菌去离子水重悬菌液，10000rpm离心10min；③重复步骤②一次。将重悬的菌液分别接种到模拟海水冲厕废水和模拟生活废水中(接种量10％)，200rpm、25℃培养48h。将培养液在5000rpm下离心10min，弃去上清液，离心管底部的菌体用去离子水清洗两遍，即得含纳米材料的菌体。重悬一部分该菌体，在铜网上固定并染色，最后烘干后用于透射电镜观察。
上述LB培养基配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
表1模拟海水冲厕废水配方为(陈海水配制):
表2模拟生活废水配方为(去离子水配制):
菌体在模拟海水冲厕废水中的自絮凝的电镜照片如图4。菌体在模拟海水冲厕废水中合成纳米材料并进行自组装的透射电镜照片如图5，图4和图5显示该纳米颗粒材料呈现蜂巢状，粒径为纳米级且分布均匀，结构紧凑，易制成层状纳米材料。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
海水嗜冷杆菌合成并进行自组装的生物纳米材料及其制备方法与应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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