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基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法

基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法

IPC分类号 : D01F8/18,D01F8/02,D01F11/00,D01F11/02,C12N5/071,C12N5/09

申请号
CN201611104451.5
可选规格
  • 专利类型: 发明专利
  • 法律状态: 有权
  • 申请日: 2016-12-05
  • 公开号: 108149342B
  • 公开日: 2018-06-12
  • 主分类号: D01F8/18
  • 专利权人: 中国科学院大连化学物理研究所

专利摘要

基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其在制备空腔微纤维的过程中,在微纤维的内腔上引入能够促进细胞贴壁生长的修饰材料,在空腔形成的同时修饰材料贴附在空腔上形成一种修饰涂层,为后期细胞的黏附和培养提供促进作用。本发明利用微流控芯片技术,形成能够生成同轴层流流型的微米级通道,实现对样品流体的流型操控,并最终使样品流体固化成具有特定内涂层结构的微米级空腔纤维材料。所述微纤维材料能模拟人体组织内的微结构,为组织工程和器官再生提供了新的方法和思路。本发明操作方法简单可靠,效率高,技术效果优良;其为微纤维的改性提供了便利条件;内部的修饰涂层均匀稳定简单可控,利于细胞的贴壁生长。

权利要求

1.基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:其在制备空腔微纤维的过程中,在微纤维的内腔上引入能够促进细胞贴壁生长的修饰材料,在空腔形成的同时修饰材料贴附在空腔上形成一种修饰涂层,为后期细胞的黏附和培养提供促进作用。

2.按照权利要求1所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述微流控芯片由上、下两层芯片组成,两层均为聚二甲基硅氧烷材质;芯片具有至少三个平行通道入口、一个总出口;所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法的要求如下:

将微流控芯片平放,芯片出口浸没在接收液中,将注射器联通到微流控芯片入口,利用注射泵推动注射器,形成多层同轴层流流体;通过最外层鞘流流体的固化作用,形成具有空腔结构的微纤维。

3.按照权利要求2所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述微流控芯片为四通道结构或者三通道结构;

当微流控芯片为四通道结构时,其有四个独立的进样入口以及四个独立的通道组成,由内向外的通道依次为惰性流体、内腔修饰流体或者内腔修饰流体与惰性流体的混合液、样品流体和鞘流流体;

当微流控芯片为三通道结构时;相对于四通道结构的微流控芯片而言,三通道结构的微流控芯片有三个独立的进样入口以及三个独立的通道组成,修饰流体和惰性流体混合在一起,被合并成一个中心流体,由内向外的通道依次为惰性流体和修饰流体的混合液、样品流体和鞘流流体。

4.按照权利要求3所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述微流控芯片满足下述要求之一:

其一,微流控芯片为四通道结构时,四个通道的尺寸从小到大依次为:中心惰性流体的通道尺寸<修饰流体的通道尺寸<样品流体的通道尺寸<鞘流流体的通道尺寸;

而当微流控芯片为三通道结构时,三个通道的尺寸从小到大依次为:惰性流体和内腔修饰流体混合液的通道尺寸<样品流体的通道尺寸<鞘流流体的通道尺寸。

5.按照权利要求1-4其中之一所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法满足下述要求之一或其组合:

其一,样品流体为能够被迅速固化的生物材料;

其二,修饰流体是指与样品流体带有相反电荷的分子及其衍生物,或者是能与样品流体有一定相互作用的分子及其衍生物,又或者是黏附性强的分子及其衍生物;

其三,中心惰性流体是指不与样品流体发生作用的惰性水溶性材料及其衍生物;

其四,鞘流流体是指样品流体的交联剂溶液。

6.按照权利要求5所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法满足下述要求之一或其组合:

其一,样品流体是下述几种之一或其组合:海藻酸钠、聚乙二醇双丙烯酸酯、壳聚糖等;

其二,修饰流体可以是下述几种之一或其组合:壳聚糖、甲壳素、聚赖氨酸、聚多巴胺、透明质酸、琼脂糖、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原、血清扩展因子等;

其三,中心惰性流体可以是下述几种之一或其组合:甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等;

其四,鞘流流体可以是下述几种之一或其组合:能够迅速交联海藻酸钠的CaCl2溶液或者Ca2+、Cu2+、Ba2+多价离子的溶液;或者能够交联壳聚糖的三聚磷酸钠溶液;对于不需要溶液固化比如紫外光照就可以固化的聚乙二醇双丙烯酸酯,鞘流流体可以为惰性的缓冲溶液等。

7.按照权利要求5所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述复合空腔微纤维,能够包载多种细胞,具体包括悬浮细胞和贴壁细胞。

8.按照权利要求7所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述复合空腔微纤维能够包载下述贴壁型的细胞中的一种或其某种组合:成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、人肝肿瘤细胞、肺泡上皮细胞、肾细胞、乳腺皮肤神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞。

9.按照权利要求5所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法还满足如下要求:

在复合空腔微纤维制备之前,进行下述工作:

将上层芯片打孔,保证溶液从上层流入芯片;两层聚二甲基硅氧烷通过氧等离子表面处理后封合,封合后通入全氟溶液进行表面疏水处理;封合后的芯片要求切割芯片总出口通道处,切割面与出口通道相垂直,以产生光滑平整的出口聚二甲基硅氧烷截面。

10.按照权利要求3或4所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法还满足如下要求之一或其组合:

其一,所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法制备得到的是空腔内侧被修饰的空腔复合微纤维;空腔复合微纤维的内腔能够作为生物反应体,包载细胞并进行长期培养;空腔内侧的修饰涂层帮助细胞在微纤维的空腔内稳定和生长;

其二,在制备微纤维的过程中,通过对修饰流体的浓度以及流速进行调控,可以精确控制微纤维内部涂层的密度以及厚度,从而能够制备出更适合细胞生长的微环境。

其三,所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法具体用于制备含有细胞的空腔复合微纤维,然后将微纤维内的细胞进行培养,能够得到长条的细胞索,以便为后期组织工程的构建提供力学性能支持;具体要求如下:

预先将含有0.85%NaCl的0.5-5%的海藻酸钠作为样品流体;1-3%的甲基纤维素作为惰性流体;用2.5%的乙酸制备的0.5-5%的壳聚糖作为修饰流体,或者将壳聚糖和甲基纤维素混合,得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体;含有3%蔗糖的1.1%CaCl2作为鞘流流体;

将超净台提前紫外照射2h以上,然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维:将1×107的HepG2细胞,用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液,然后加入相同体积的甲基纤维素溶液,制备出包含细胞密度为5×106的3%甲基纤维素溶液;混合后去除气泡,取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用;

在制备过程中,用气压泵控制CaCl2的流速用精确泵控制其它三条通路的流体流速,在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2;前三者的流速分别在0.1-5μl/min、0.1-5μl/min、1-20μl/min;鞘流流体的气压泵的压力为50-200mbar;

将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在CaCl2的溶液内,然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养。

说明书

技术领域

本发明涉及基于微流控芯片技术的空腔复合微纤维的制备方法和应用技术领域,特别提供了一种基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法。

背景技术

现有技术中,器官移植是目前治疗器官衰竭的理想方法,但器官供应短缺、免疫排斥以及伦理争议等问题严重制约了其临床应用。因此,组织工程作为构筑可植入器官的一条新途径,就成为器官衰竭治疗的重要发展方向。组织工程主要是利用生物相容性的支架材料与细胞复合,制备具有细胞功能的可移植的工程化组织,植入后通过与受体整合以达到修复病损器官、替代器官功能及缓解供体器官短缺的目的[1,2]。因此在组织工程的构建过程中,对体内细胞生长微环境的模拟,实现体外细胞的三维培养,进而改善体外培养的细胞的功能,就尤为重要。

鉴于很多器官本身是一种软组织,因此水凝胶类的软支架就成为组织构建的首选。此类软支架不仅能够为细胞的分裂与分化提供更接近于天然细胞外基质的化学与物理环境,并且还可以通过注射等微创方式植入人体,降低了手术难度。而在所有软支架中,纤维类凝胶支架由于跟细胞外基质有着类似的微结构而受到广泛关注。纤维类凝胶材料不仅具有容易操作、便于组装成需要形状支架的优点,而且还能很好地模拟体内微环境,提供一种能促进细胞生长、改善细胞功能、具有合理构成细胞外基质的结构模式。

海藻酸是从褐藻类海洋生物中提取的一种线型阴离子天然多糖,在常温下能被二价金属离子(如Ca2+)迅速固化成水凝胶。由于具有相当好的生物相容性,所以被认为是一种理想的细胞包埋及三维培养基质材料,因而成为此研究方案制备纤维材料的首选。但是海藻酸钠不利于细胞的黏附以及在体内不够稳定,这些不足极大的限制了它的应用。因此,对现有的海藻酸钠微纤维进行改性,促进细胞在海藻酸钠微纤维里面的黏附,增加海藻酸钠微纤维在体内的稳定性,就显得尤为重要。

在现有技术中,微流控芯片技术在制备微纳功能材料方面具有其他方法无法比拟的优势,它的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和规模集成。这些优势使所制备出的微纳功能材料具有尺寸均一、形貌及组成可控、材料性能稳定以及批次间差异小等优点。基于上述优势,基于微流控技术设计和制备功能材料成为了近几年的研究热点。

人们迫切希望获得一种技术效果优良的基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种技术效果优良的基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,并对其在组织工程领域的应用做了一些探索。本发明提供了一种操作简单、通量高的微流控芯片平台并用于新型的空腔复合微纤维的制备方法。本发明所述的复合空腔微纤维可以用于细胞的包载和培养,为组织工程的构建提供一种思路。

本发明提供了一种基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:其在制备空腔微纤维的过程中,在微纤维的内腔上引入能够促进细胞贴壁生长的修饰材料,在空腔形成的同时修饰材料贴附在空腔上形成一种修饰涂层,为后期细胞的黏附和培养提供促进作用。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,还要求保护下述优选内容:

所述微流控芯片由上、下两层芯片组成,两层均为聚二甲基硅氧烷材质;芯片具有至少三个平行通道入口、一个总出口;所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法的要求如下:

将微流控芯片平放,芯片出口浸没在接收液中,将注射器联通到微流控芯片入口,利用注射泵推动注射器,形成多层同轴层流流体;通过最外层鞘流流体的固化作用,形成具有空腔结构的微纤维。

所述微流控芯片为四通道结构或者三通道结构;

当微流控芯片为四通道结构时,其有四个独立的进样入口以及四个独立的通道组成,由内向外的通道依次为惰性流体(流体1)、内腔修饰流体或者内腔修饰流体与惰性流体的混合液(流体2)、样品流体(流体3)和鞘流流体(流体4);

当微流控芯片为三通道结构时;相对于四通道结构的微流控芯片而言,三通道结构的微流控芯片有三个独立的进样入口以及三个独立的通道组成,修饰流体和惰性流体混合在一起,被合并成一个中心流体,由内向外的通道依次为惰性流体和修饰流体的混合液(流体1)、样品流体(流体2)和鞘流流体(流体3)。

所述微流控芯片满足下述要求之一:

其一,微流控芯片为四通道结构时,四个通道的尺寸从小到大依次为:中心惰性流体的通道尺寸<修饰流体的通道尺寸<样品流体的通道尺寸<鞘流流体的通道尺寸;即修饰流体的通道尺寸比中心惰性流体的通道尺寸大,样品流体的通道比修饰流体的通道尺寸大,鞘流流体的通道尺寸比样品流体的通道尺寸大;

而当微流控芯片为三通道结构时,三个通道的尺寸从小到大依次为:惰性流体和内腔修饰流体混合液的通道尺寸<样品流体的通道尺寸<鞘流流体的通道尺寸;即样品流体的通道比惰性流体和修饰流体混合液的通道尺寸大,鞘流流体的通道尺寸比样品流体的通道尺寸大。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法满足下述要求之一或其组合:

其一,样品流体为能够被迅速固化的生物材料;

其二,修饰流体是指与样品流体带有相反电荷的分子及其衍生物,或者是能与样品流体有一定相互作用的分子及其衍生物,又或者是黏附性强的分子及其衍生物;

其三,中心惰性流体是指不与样品流体发生作用的惰性水溶性材料及其衍生物;

其四,鞘流流体是指样品流体的交联剂溶液。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法满足下述要求之一或其组合:

其一,样品流体可以是下述几种之一或其组合:海藻酸钠、聚乙二醇双丙烯酸酯、壳聚糖等;

其二,修饰流体可以是下述几种之一或其组合:壳聚糖、甲壳素、聚赖氨酸、聚多巴胺、透明质酸、琼脂糖、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原、血清扩展因子等;

其三,中心惰性流体可以是下述几种之一或其组合:甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等;

其四,鞘流流体可以是下述几种之一或其组合:能够迅速交联海藻酸钠的CaCl2溶液或者Ca2+、Cu2+、Ba2+多价离子的溶液;或者能够交联壳聚糖的三聚磷酸钠溶液;对于不需要溶液固化比如紫外光照就可以固化的聚乙二醇双丙烯酸酯,鞘流流体可以为惰性的缓冲溶液等。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述复合空腔微纤维,能够包载多种细胞,包括悬浮细胞和贴壁细胞,特别是贴壁细胞。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述复合空腔微纤维能够包载下述贴壁型的细胞中的一种或其某种组合:成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、人肝肿瘤细胞、肺泡上皮细胞、肾细胞、乳腺皮肤神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法还满足如下要求:

在复合空腔微纤维制备之前,进行下述工作:

将上层芯片打孔,保证溶液从上层流入芯片;两层聚二甲基硅氧烷通过氧等离子表面处理后封合,封合后通入全氟溶液进行表面疏水处理;封合后的芯片要求切割芯片总出口通道处,切割面与出口通道相垂直,以产生光滑平整的出口聚二甲基硅氧烷截面。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法还满足如下要求之一或其组合:

其一,所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法制备得到的是空腔内侧被修饰的空腔复合微纤维;空腔复合微纤维的内腔能够作为生物反应体,包载细胞并进行长期培养;空腔内侧的修饰涂层帮助细胞在微纤维的空腔内稳定和生长;

其二,在制备微纤维的过程中,通过对修饰流体的浓度以及流速进行调控,可以精确控制微纤维内部涂层的密度以及厚度,从而能够制备出更适合细胞生长的微环境。

其三,所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法具体用于制备含有细胞的空腔复合微纤维,然后将微纤维内的细胞进行培养,能够得到长条的细胞索,以便为后期组织工程的构建提供力学性能支持;具体要求如下:

预先将含有0.85%NaCl的0.5-5%的海藻酸钠作为样品流体;1-3%的甲基纤维素作为惰性流体;用2.5%的乙酸制备的0.5-5%的壳聚糖作为修饰流体,或者将壳聚糖和甲基纤维素混合,得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体;含有3%蔗糖的1.1%CaCl2作为鞘流流体;

将超净台提前紫外照射2h以上,然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维:将1×107的HepG2细胞,用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液,然后加入相同体积的甲基纤维素溶液,制备出包含细胞密度为5×106的3%甲基纤维素溶液;混合后去除气泡,取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用;

在制备过程中,用气压泵控制CaCl2的流速用精确泵控制其它三条通路的流体流速,在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2;前三者的流速分别在0.1-5μl/min、0.1-5μl/min、1-20μl/min;鞘流流体的气压泵的压力为50-200mbar;

将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在CaCl2的溶液内,然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法基于具有能够形成同轴层流流型的微米级通道结构的微流控芯片来实现;芯片的基本特点是具有能够形成同轴层流流型的三个通道结构;

有选择地在某个特定的惰性流体内混合修饰流体,能够在同一条微纤维内同时得到含有修饰涂层的内腔和不含有修饰涂层的内腔,从而实现在一条微纤维上即能够观察修饰涂层对细胞培养的影响。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法基于具有能够形成同轴层流流型的微米级通道结构的微流控芯片来实现;芯片的基本特点是具有能够形成同轴层流流型的四个或者三个通道结构;

在不同的空腔内培养不同的细胞,还能够观察到细胞间的相互作用等;值得注意的是,如果修饰流体的浓度过高,会使空腔完全被修饰材料占据,从而影响腔体对细胞的有效包埋,因此浓度控制是此种实现方式的关键。

本发明制备的微纤维材料,能够满足细胞培养的需求,实现细胞在微纤维空腔内的贴附和生长;同时,修饰涂层的存在,一方面能够促进细胞在微纤维内的黏附及生长,阻止细胞在操作及培养过程中从微纤维内滑出;另外一方面,内侧涂层的存在,能够增强微纤维在体内的稳定性;

在细胞生长成细胞索的时候,如果将外层的微纤维材料溶掉时,有修饰涂层的微纤维其修饰涂层的存在可以使细胞索保持完好的形状,从而为其在组织工程上的应用提供更加便利的条件。而没有修饰涂层的细胞索则散落在溶液内,无法进行后期组织工程的构建。

本发明提供了一种基于微流控芯片技术的空腔复合微纤维的制备方法,以及其在细胞培养及组织工程构建方面的应用。该类芯片的特点是有多条同轴层流通道,对应着独立的流体入口。通过将通道由内到外依次引入惰性流体、修饰流体、样品流体和鞘流流体,就可以得到空腔被修饰的微纤维。细胞培养实验表明,有修饰涂层的空腔微纤维有利于细胞的贴附,而没有修饰涂层的空腔完全不贴附细胞。将外层的样品材料溶掉后,在没有修饰涂层的微纤维内,形成的条形细胞索散落在溶液里,而在有修饰涂层的微纤维内,条形细胞索的外层还保留有一薄层样品材料和修饰材料的络合物,从而保持条形细胞索的结构和形状,方便后期组织工程的构建工作。本发明所述制备方法简单,制备出的材料结构新颖,所制备的空腔微纤维更利于细胞黏附和生长,因此相信此种制备方法在组织工程构建上有巨大的潜在应用价值。

本发明通过利用微流控芯片技术,通过设计微流控通道,形成能够生成同轴层流流型的微米级通道,实现对样品流体的流型操控,并最终使样品流体固化成具有特定结构的微米级纤维材料。通过选择合适的样品流体、修饰流体以及惰性流体,制备出适合细胞长期培养和功能性组织形成的空腔复合新纤维体系。其中修饰溶液的引入,可以调整细胞在海藻酸钠微纤维内部的生长状态,最终赋予这种新型微纤维材料一定的生物学性能。这种通过制备功能性的新纤维材料模拟人体组织内的微结构,为组织工程和器官再生提供了新的方法和思路。相信这种新型的功能性微纤维材料在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。

本发明有以下优点:

(1)一步法制备含有空腔的复合微纤维材料,操作方法简单可靠,效率高,为微纤维的改性提供了便利条件,有利于微纤维的大批量制备。

(2)内部的修饰涂层,均匀稳定简单可控,利于细胞的贴壁生长。

(3)内部的修饰涂层,还可以增强微纤维的机械性能,为后期组织工程的构建提供力学性能支持。

附图说明

下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明:

图1为四通道结构的微流控芯片结构示意简图;

图2为三通道结构的微流控芯片结构示意简图;

图3为空腔复合微纤维的形貌图;

图4为图3的局部放大图;

图5为包埋细胞的空腔复合微纤维(没有壳聚糖涂层的微纤维)形貌图之一(1d);

图6为包埋细胞的空腔复合微纤维(没有壳聚糖涂层的微纤维)形貌图之二(5d);

图7为包埋细胞的空腔复合微纤维(没有壳聚糖涂层的微纤维)形貌图之三(10d);

图8为图5的局部放大图;

图9为图6的局部放大图;

图10为图7的局部放大图;

图11为包埋细胞的空腔复合微纤维(有壳聚糖涂层的微纤维)形貌图之一(1d);

图12为包埋细胞的空腔复合微纤维(有壳聚糖涂层的微纤维)形貌图之二(5d);

图13为包埋细胞的空腔复合微纤维(有壳聚糖涂层的微纤维)形貌图之三(10d);

图14为图11的局部放大图;

图15为图12的局部放大图;

图16为图13的局部放大图;

图17为微纤维培养14天后,溶去外层海藻酸钠后细胞索的形成图之一(没有壳聚糖涂层);

图18为图17的局部放大图;

图19为微纤维培养14天后,溶去外层海藻酸钠后细胞索的形成图之二(有壳聚糖涂层);

图20为图19的局部放大图。

具体实施方式

实施例1

一种基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其在制备空腔微纤维的过程中,在微纤维的内腔上引入能够促进细胞贴壁生长的修饰材料,在空腔形成的同时修饰材料贴附在空腔上形成一种修饰涂层,为后期细胞的黏附和培养提供促进作用。

所述微流控芯片由上、下两层芯片组成,两层均为聚二甲基硅氧烷材质;芯片具有至少三个平行通道入口、一个总出口;所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法的要求如下:

将微流控芯片平放,芯片出口浸没在接收液中,将注射器联通到微流控芯片入口,利用注射泵推动注射器,形成多层同轴层流流体;通过最外层鞘流流体的固化作用,形成具有空腔结构的微纤维。

所述微流控芯片为四通道结构其有四个独立的进样入口以及四个独立的通道组成,由内向外的通道依次为惰性流体(流体1)、内腔修饰流体或者内腔修饰流体与惰性流体的混合液(流体2)、样品流体(流体3)和鞘流流体(流体4);

所述微流控芯片满足下述要求:微流控芯片为四通道结构,四个通道的尺寸从小到大依次为:中心惰性流体的通道尺寸<修饰流体的通道尺寸<样品流体的通道尺寸<鞘流流体的通道尺寸;即修饰流体的通道尺寸比中心惰性流体的通道尺寸大,样品流体的通道比修饰流体的通道尺寸大,鞘流流体的通道尺寸比样品流体的通道尺寸大;

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法满足下述要求之一或其组合:

其一,样品流体为能够被迅速固化的生物材料;样品流体可以是下述几种之一或其组合:海藻酸钠、聚乙二醇双丙烯酸酯、壳聚糖等;

其二,修饰流体是指与样品流体带有相反电荷的分子及其衍生物,或者是能与样品流体有一定相互作用的分子及其衍生物,又或者是黏附性强的分子及其衍生物;修饰流体可以是下述几种之一或其组合:壳聚糖、甲壳素、聚赖氨酸、聚多巴胺、透明质酸、琼脂糖、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原、血清扩展因子等;

其三,中心惰性流体是指不与样品流体发生作用的惰性水溶性材料及其衍生物;中心惰性流体可以是下述几种之一或其组合:甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等;

其四,鞘流流体是指样品流体的交联剂溶液;鞘流流体可以是下述几种之一或其组合:能够迅速交联海藻酸钠的CaCl2溶液或者Ca2+、Cu2+、Ba2+多价离子的溶液;或者能够交联壳聚糖的三聚磷酸钠溶液;对于不需要溶液固化比如紫外光照就可以固化的聚乙二醇双丙烯酸酯,鞘流流体可以为惰性的缓冲溶液等。

所述复合空腔微纤维,能够包载多种细胞,包括悬浮细胞和贴壁细胞,特别是贴壁细胞。述复合空腔微纤维能够包载下述贴壁型的细胞中的一种或其某种组合:成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、人肝肿瘤细胞、肺泡上皮细胞、肾细胞、乳腺皮肤神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法还满足如下要求:

在复合空腔微纤维制备之前,进行下述工作:

将上层芯片打孔,保证溶液从上层流入芯片;两层聚二甲基硅氧烷通过氧等离子表面处理后封合,封合后通入全氟溶液进行表面疏水处理;封合后的芯片要求切割芯片总出口通道处,切割面与出口通道相垂直,以产生光滑平整的出口聚二甲基硅氧烷截面。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法,其特征在于:所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法还满足如下要求之一或其组合:

其一,所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法制备得到的是空腔内侧被修饰的空腔复合微纤维;空腔复合微纤维的内腔能够作为生物反应体,包载细胞并进行长期培养;空腔内侧的修饰涂层帮助细胞在微纤维的空腔内稳定和生长;

其二,在制备微纤维的过程中,通过对修饰流体的浓度以及流速进行调控,可以精确控制微纤维内部涂层的密度以及厚度,从而能够制备出更适合细胞生长的微环境。

其三,所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法具体用于制备含有细胞的空腔复合微纤维,然后将微纤维内的细胞进行培养,能够得到长条的细胞索,以便为后期组织工程的构建提供力学性能支持;具体要求如下:

预先将含有0.85%NaCl的0.5-5%的海藻酸钠作为样品流体;1-3%的甲基纤维素作为惰性流体;用2.5%的乙酸制备的0.5-5%的壳聚糖作为修饰流体,或者将壳聚糖和甲基纤维素混合,得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体;含有3%蔗糖的1.1%CaCl2作为鞘流流体;

将超净台提前紫外照射2h以上,然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维:将1×107的HepG2细胞,用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液,然后加入相同体积的甲基纤维素溶液,制备出包含细胞密度为5×106的3%甲基纤维素溶液;混合后去除气泡,取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用;

在制备过程中,用气压泵控制CaCl2的流速用精确泵控制其它三条通路的流体流速,在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2;前三者的流速分别在0.1-5μl/min、0.1-5μl/min、1-20μl/min;鞘流流体的气压泵的压力为50-200mbar;

将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在CaCl2的溶液内,然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法基于具有能够形成同轴层流流型的微米级通道结构的微流控芯片来实现;芯片的基本特点是具有能够形成同轴层流流型的三个通道结构;

有选择地在某个特定的惰性流体内混合修饰流体,能够在同一条微纤维内同时得到含有修饰涂层的内腔和不含有修饰涂层的内腔,从而实现在一条微纤维上即能够观察修饰涂层对细胞培养的影响。

所述基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法基于具有能够形成同轴层流流型的微米级通道结构的微流控芯片来实现;芯片的基本特点是具有能够形成同轴层流流型的四个或者三个通道结构;

在不同的空腔内培养不同的细胞,还能够观察到细胞间的相互作用等;值得注意的是,如果修饰流体的浓度过高,会使空腔完全被修饰材料占据,从而影响腔体对细胞的有效包埋,因此浓度控制是此种实现方式的关键。

本发明制备的微纤维材料,能够满足细胞培养的需求,实现细胞在微纤维空腔内的贴附和生长;同时,修饰涂层的存在,一方面能够促进细胞在微纤维内的黏附及生长,阻止细胞在操作及培养过程中从微纤维内滑出;另外一方面,内侧涂层的存在,能够增强微纤维在体内的稳定性;

在细胞生长成细胞索的时候,如果将外层的微纤维材料溶掉时,有修饰涂层的微纤维其修饰涂层的存在可以使细胞索保持完好的形状,从而为其在组织工程上的应用提供更加便利的条件。而没有修饰涂层的细胞索则散落在溶液内,无法进行后期组织工程的构建。

本发明提供了一种基于微流控芯片技术的空腔复合微纤维的制备方法,以及其在细胞培养及组织工程构建方面的应用。该类芯片的特点是有多条同轴层流通道,对应着独立的流体入口。通过将通道由内到外依次引入惰性流体、修饰流体、样品流体和鞘流流体,就可以得到空腔被修饰的微纤维。细胞培养实验表明,有修饰涂层的空腔微纤维有利于细胞的贴附,而没有修饰涂层的空腔完全不贴附细胞。将外层的样品材料溶掉后,在没有修饰涂层的微纤维内,形成的条形细胞索散落在溶液里,而在有修饰涂层的微纤维内,条形细胞索的外层还保留有一薄层样品材料和修饰材料的络合物,从而保持条形细胞索的结构和形状,方便后期组织工程的构建工作。本发明所述制备方法简单,制备出的材料结构新颖,所制备的空腔微纤维更利于细胞黏附和生长,因此相信此种制备方法在组织工程构建上有巨大的潜在应用价值。

本发明通过利用微流控芯片技术,通过设计微流控通道,形成能够生成同轴层流流型的微米级通道,实现对样品流体的流型操控,并最终使样品流体固化成具有特定结构的微米级纤维材料。通过选择合适的样品流体、修饰流体以及惰性流体,制备出适合细胞长期培养和功能性组织形成的空腔复合新纤维体系。其中修饰溶液的引入,可以调整细胞在海藻酸钠微纤维内部的生长状态,最终赋予这种新型微纤维材料一定的生物学性能。这种通过制备功能性的新纤维材料模拟人体组织内的微结构,为组织工程和器官再生提供了新的方法和思路。相信这种新型的功能性微纤维材料在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。

本实施例有以下优点:

(1)一步法制备含有空腔的复合微纤维材料,操作方法简单可靠,效率高,为微纤维的改性提供了便利条件,有利于微纤维的大批量制备。

(2)内部的修饰涂层,均匀稳定简单可控,利于细胞的贴壁生长。

(3)内部的修饰涂层,还可以增强微纤维的机械性能,为后期组织工程的构建提供力学性能支持。

实施例2

本实施例与实施例1内容基本相同,其不同之处主要在于:

所述微流控芯片为三通道结构;相对于四通道结构的微流控芯片而言,三通道结构的微流控芯片有三个独立的进样入口以及三个独立的通道组成,修饰流体和惰性流体混合在一起,被合并成一个中心流体,由内向外的通道依次为惰性流体和修饰流体的混合液(流体1)、样品流体(流体2)和鞘流流体(流体3)。

而当微流控芯片为三通道结构时,三个通道的尺寸从小到大依次为:惰性流体和内腔修饰流体混合液的通道尺寸<样品流体的通道尺寸<鞘流流体的通道尺寸;即样品流体的通道比惰性流体和修饰流体混合液的通道尺寸大,鞘流流体的通道尺寸比样品流体的通道尺寸大。

实施例3

所用芯片为PDMS芯片,通过氧等离子表面处理后封接,然后通入全氟液体20min以修饰通道表面。真空抽干全氟液体后用80℃烘箱内烘干备用。芯片结构图如图1所示。

含有0.85%NaCl的2%的海藻酸钠(粘度240mPa·s)作为样品流体,3%的甲基纤维素(粘度4000cP)作为惰性流体,用2.5%的乙酸制备的5%的壳聚糖(粘度>400mPa·s)作为修饰流体,含有3%蔗糖的1.1%CaCl2作为鞘流流体。修饰流体还可以是将5%的壳聚糖和3%的甲基纤维素以不同比例混合,得到含有不同壳聚糖浓度(1%,3%)的甲基纤维素溶液。将甲基纤维素高温灭菌半小时,然后放入4℃冰箱内溶解备用。用0.22μm的无菌过滤器将海藻酸钠溶液过滤后备用。

将超净台提前紫外照射2h以上,然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维。将1x107的HepG2细胞,用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液,然后加入相同体积6%的甲基纤维素溶液,制备出包含细胞密度为5x106的3%甲基纤维素溶液。用1ml注射器混合后,在1000rpm下离心5min去除气泡,取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用。

在本例中用四通道芯片制备空腔复合微纤维。在制备过程中,用气压泵控制CaCl2的流速,气压泵的压力为50-200mbar。用精确泵控制其它三条通路的流体流速,在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体(甲基纤维素)、修饰流体(壳聚糖,或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液)、样品流体(海藻酸钠)以及鞘流流体(CaCl2),前三者的流速分别为0.1-5μl/min、0.1-5μl/min、1-20μl/min。成功制备出包载有细胞的空腔海藻酸钠/壳聚糖复合微纤维。将制备出的微纤维材料浸泡在CaCl2的溶液内至少半个小时,然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养。每隔两天进行一次换液。同时观察细胞在不同空腔微纤维内的生长状况。培养两周后,取出微纤维,加入缓冲溶液PBS(pH7.4)。过夜后观察,外层的海藻酸钠被溶掉,内层的细胞索被裸露出来(如图17-20所示)。用壳聚糖修饰过的微纤维内的细胞索被一层透明的壳聚糖/海藻酸钠层保护,得到长条的细胞索,而没有壳聚糖修饰的微纤维内的细胞索则在外层海藻酸钠被溶掉后,散落在溶液内,很难进行后期的操作。说明修饰涂层的存在对于组织工程的构建还是非常有利的。

基于微流控技术的复合空腔微纤维的制备方法专利购买费用说明

专利买卖交易资料

Q:办理专利转让的流程及所需资料

A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。

1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2:按规定缴纳著录项目变更手续费。

3:同时提交相关证明文件原件。

4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q:专利转让变更,多久能出结果

A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。

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