专利摘要

本发明提供了一种从核糖核酸酶B中分离制备糖肽异构体的方法及糖肽异构体，其主要的成分是肽段序列为NLTK的糖肽异构体。将核糖核酸酶B通过胰蛋白酶酶解后，离心浓缩，浓缩液用一维色谱柱去除酶解液中的盐、多肽及残余蛋白，收集目标馏分。将收集到的馏分离心浓缩，将浓缩液通过二维色谱柱，与质谱联用，在质谱监测指导下，进行分离制备，得到两个高纯度的核糖核酸酶B中分子量为1852.75的糖肽异构体。

权利要求

1.从核糖核酸酶B中制备糖肽异构体的方法，其特征在于：

1）蛋白变性：核糖核酸酶B中加入尿素的缓冲溶液进行反应，反应产物中加入二硫苏糖醇进行反应，产物中加入碘代乙酸，避光反应得到变性蛋白溶液；

2）酶解：向步骤1）得到的变性蛋白溶液中加入酶，进行酶解反应，得到酶解反应产物；酶解反应之前，变性蛋白溶液用碳酸氢铵缓冲溶液稀释5－10倍后再加入酶，上述碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30－80 mM；酶解反应pH值为7－9，温度为35－40℃，反应时间为10－24小时；酶解后得到的酶解液在沸水中煮5－10分钟使酶失活得到酶解反应产物；所述酶是胰蛋白酶；酶和初始核糖核酸酶B的质量比为1:10－1:50；

3) 酶解反应产物进行亲水/反相二维液相色谱分离制备，收集的组分干燥后得到糖肽异构体；

步骤（3）以硅胶为基质的键合材料为色谱柱填料，Mal，XAmide，XIon为一维亲水填料，石墨化碳（PGC）为二维反相填料；

步骤（3）所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的硅胶基质键合材料的粒径为2－20微米，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈中的一种或二种与水混合，其中甲醇或乙腈为有机相，不含或含有0.1 v%甲酸；水相中不含或含有0.1 v%甲酸，或者含有盐，盐的浓度在1－20 mM，上述盐为甲酸铵或乙酸铵；洗脱条件按照有机相体积分数50－80%等度或5－70分钟水相体积分数由5%提高到60%梯度进行；柱温为25－40℃，洗脱液总流速为0.2－1.0 mL/min，在保留时间为30－70 min，按照色谱峰收集馏分；二维制备采用PGC色谱柱，粒径为3－10微米，乙腈作为有机相，不含或含有0.1 v%甲酸，水为水相，不含或含有0.1 v%甲酸，洗脱条件按有机相体积分数10－50%等度或经5－30分钟有机相体积分数由0－5%提高到20－50%梯度进行，柱温为25－40℃，洗脱液总流速为0.2－1.0 mL/min，收集保留时间为10－30的组分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述一维制备，最佳流动相为乙腈与含有5mM甲酸铵的水混合，采用梯度方式，0到35分钟，水相比例由40%线性提高到50%，35到70分钟，水相比例保持在50%；二维制备最佳流动相为含有0.1 v%甲酸的乙腈与含有0.1 v%甲酸的水混合，采用梯度条件，含有或不含有0.1 v%甲酸的乙腈体积浓度为0，保持5分钟，再经5－20分钟，其体积浓度梯度增加到35%－45%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：一维制备采用紫外检测器；二维制备采用紫外检测为主要检测器，质谱监测为辅助手段，对于含量非常小的异构体，确定异构体出峰时间，按照时间收集异构体馏分。

说明书

技术领域

本发明涉及从蛋白中分离制备糖肽异构体的分离制备方法，具体的说是从核糖核酸酶B中酶解分离制备得到肽段为NLTK的糖肽异构体，含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，分子量为1852.75。

背景技术

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在真核生物，尤其是哺乳动物中约有一半以上的蛋白质是被糖基化的(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On thefrequency of protein glycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROTdatabase.Biochim Biophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化作为一种主要的蛋白质翻译后修饰形式，对蛋白质的结构和功能有着重要影响，糖蛋白的糖链在细胞间的识别、黏附、通信联络以及免疫应答等方面均起着重要作用。除此之外，蛋白质糖基化的异常与肿瘤、发育、免疫异常以及感染等疾病的发生发展和诊断治疗也有密切关系。目前，已知肿瘤、类风湿等疾病会引起糖链结构的异常改变，因此，糖链被认为是一种潜在的疾病标志物和新疫苗的靶点(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms ofhealth and disease.Cell 2006,126,855-867；Svarovsky SA,Joshi L,Cancer glycanbiomarkers and their detection-past,present and future.Analytical Methods2014,6,3918-3936.)。由于糖肽仅占所有酶解后肽段的小部分(2－5％)，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽抑制。同时，由于糖链的微观不均一性，一个糖基化位点上的糖链类型可能多达几十种，进一步降低了糖链的相对量而使得它们很难被检测到。随着研究的不断深入，人们发现，在纷繁复杂的糖链里，由于异构体的存在，即相同分子量的糖链，其聚糖单元、连接顺序、连接方式的不同，使糖链的结构和种类变得更加复杂。(Hua S,Nwosu CC,Strum JS,Site-specific protein glycosylation analysis with glycan isomerdifferentiation.Analytical and Bioanalytical Chemistry 2012,403,1291-1302.)。

对于糖肽的分离，目前发展的方法有反相色谱法、亲和色谱法、亲水色谱法以及二维色谱法例如强阳离子交换/反相色谱法、反相色谱/石墨化碳法，但是目前这些方法仅是与质谱联用，通过质谱特定分子量的提取对糖肽或糖肽异构体进行鉴定，不能对糖肽异构体进行分离制备。为了能够在高纯度糖肽基础上，得到糖肽异构体，从而能够获得更加准确的疾病标志物信息，同时为了能够得到糖肽异构体的标准品，需要发展一种高效、高通量的糖肽异构体分离制备方法。

发明内容

本发明提供了一种利用二维液相色谱法从核糖核酸酶B中高效分离制备糖肽异构体的方法，其主要的成分是肽段为NLTK的糖肽异构体，含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，分子量为1852.75，纯度大于80％。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)蛋白变性：核糖核酸酶B中样品中加入尿素的缓冲溶液进行反应，反应产物中加入二硫苏糖醇进行反应，产物中加入碘代乙酸，避光反应得到变性蛋白溶液；

2)酶解：向步骤(1)得到的变性蛋白溶液中加入酶，进行酶解反应得到酶解反应产物；

3)对步骤(2)得到的酶解反应产物进行二维液相色谱分离制备，收集的组分干燥后得到两个分子量为1852.75的糖肽异构体。。

步骤(1)中核糖核酸酶B中样品在尿素的缓冲溶液中进行反应的条件为20－30℃温育，缓冲溶液pH值为7－9，反应时间为1－5小时；加入二硫苏糖醇后反应条件为35－40℃温育，反应时间为1－5小时；加入碘代乙酸后的反应条件为避光20－30℃温育，反应时间为10－60分钟。

步骤(1)缓冲溶液中尿素的浓度为4－10M；所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30－80mM；缓冲溶液中加入的核糖核酸酶B中与尿素的质量比为1:1－1:40。

所述二硫苏糖醇，加入后其在体系中的终浓度为30－100mM，初始核糖核酸酶B中质量与二硫苏糖醇的质量比为14:1－140:1；

所述碘代乙酸，加入后其在体系中的终浓度为30－100mM，初始核糖核酸酶B质量与碘代乙酸的质量比为18:1－180:1。

步骤(2)酶解反应之前，变性蛋白溶液用碳酸氢铵缓冲溶液稀释5－10倍后再加入酶，上述碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30－80mM；酶解反应pH值为7－9，温度为35－40℃，反应时间为10－24小时；酶解后得到的酶解液在沸水中煮5－10分钟使酶失活得到酶解反应产物。

在步骤(2)中所述酶是胰蛋白酶；酶和初始核糖核酸酶B的质量比为1:10－1:50。

步骤(3)以硅胶为基质的键合材料为色谱柱填料，Mal，XAmide或XIon(华谱新创有限公司)为一维亲水填料，PGC(Thermo Fisher)为二维色谱填料。

步骤(3)所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的硅胶基质键合材料的粒径为2－20微米，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈中的一种或二种与水混合，其中甲醇或乙腈为有机相， 不含或含有0.1v％甲酸；水相中不含或含有0.1v％甲酸，或者含有盐，盐的浓度在1－20mM，上述盐为甲酸铵或乙酸铵。洗脱条件按照有机相体积分数50－80％等度或5－70分钟水相体积分数由5％提高到60％梯度进行；柱温为25－40℃，洗脱液总流速为0.2－1.0mL/min，收集保留时间为30－70min的组分；二维制备采用PGC色谱柱，粒径为3－10微米，采用乙腈作为有机相，不含或含有0.1v％甲酸，水作为水相，不含或含有0.1v％甲酸，洗脱条件按有机相体积分数10－50％等度或经5－30分钟有机相体积分数由0－5％提高到20－50％梯度进行，柱温为25－40℃，洗脱液总流速为0.2－1.0mL/min，收集保留时间为10－30的组分。

所述一维制备，最佳流动相为乙腈与含有5mM甲酸铵的水混合，采用梯度方式，0－35分钟，水相比例由40％线性提高到50％，35到70分钟，水相比例保持在50％；二维制备最佳流动相为含有0.1v％甲酸的乙腈与含有0.1v％甲酸的水混合，采用梯度条件，含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈体积浓度为0，保持5分钟，再经5－20分钟，其体积浓度梯度增加到35％－45％。

按照上述方法制备的糖肽异构体其主要成分是4个氨基酸肽段的糖肽异构体，其肽段序列为NLTK，含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，分子量为1852.75，纯度大于80％。

本发明的优点：

1.采用二维液相色谱分离技术，通过选用合适的色谱分离模式和色谱分离制备条件，对从核糖核酸酶B的酶解液进行除杂质蛋白、多肽、非糖肽，从核糖核酸酶B中得到了糖肽异构体。

2.得到的糖肽异构体组分纯度高，可以达到80％以上。

3.本发明所涉及的从核糖核酸酶B中制备高纯度糖肽异构体的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模制备的需要。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：

称取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,货号R7884)1mg，加入167μL的4M尿素的30mM碳酸氢铵缓冲溶液中，20℃温育1小时，缓冲溶液的pH为7。变性后的核糖核酸酶B蛋白加入15μL的30mM二硫苏糖醇水溶液，35℃温育1小时，还原变性后蛋白的二硫键，然后加入10μL的30mM的碘代乙酸水溶液，避光条件下30℃温育10分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的核糖核酸酶B加入960μL浓度为0.1M的碳酸氢铵缓冲溶液；加入0.1mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为7，酶解反应温度为35℃，酶解时间为10小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩3倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。用粒径2微米的XAmide(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径3mm，柱长250mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用50％有机相等度洗脱，柱温25℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，按照色谱峰收集30－35分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径3微米的PGC色谱柱，柱径4.6mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相采用乙腈(含0.1v％甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用10％有机相等度洗脱，柱温35℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，收集27－28和28－30分钟两个洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即为分子量为1852.75的核糖核酸酶B糖肽异构体，分别含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，纯度为70％。

实施例2：

称取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,货号R7884)10mg，加入100μL的8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，30℃温育5小时，缓冲溶液的pH为9。变性后的核糖核酸酶B加入15μL的30mM二硫苏糖醇水溶液，40℃温育5小时，还原变性后核糖核酸酶B的二硫键，然后加入6μL的50mM的碘代乙酸水溶液，避光条件下20℃温育60分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的核糖核酸酶B加入1210μL的碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为0.5M，加入0.2mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为9，酶解反应温度为40℃，酶解时间为24小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮10分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩10倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。

用粒径20微米的XIon(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径4.6mm，柱长150mm，流动相选择甲醇(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，含有5mM的甲酸铵，采用梯度洗脱方式：有机相体积浓度由5％经70分钟提高到60％，柱温40℃，流动相流速为1.0mL/min，280nm紫外检测，收集65－70分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径20微米的PGC色谱柱，柱径3mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用50％有机相等度洗脱，柱温40℃，流动相流速为0.7mL/min，280nm紫外检测，收集10－13和13－15分钟两个洗脱组 分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即为分子量为1852.75的核糖核酸酶B糖肽异构体，分别含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，纯度为60％。

实施例3：

称取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,货号R7884)30mg，加入100μL的10M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，25℃温育2小时，缓冲溶液的pH为7。变性后的核糖核酸酶B加入10μL的100mM二硫苏糖醇水溶液，37℃温育5小时，还原变性后核糖核酸酶B的二硫键，然后加入25μL的100mM的碘代乙酸水溶液，避光条件下30℃温育20分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的核糖核酸酶B加入1500μL的碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为5M，加入1mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为8，酶解反应温度为37℃，酶解时间为24小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩5倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。

用粒径5微米的Mal(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径4.6mm，柱长250mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用80％有机相等度洗脱，柱温25℃，流动相流速为1mL/min，280nm紫外检测，收集55－60分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径5微米的PGC色谱柱，柱径4.6mm，柱长250mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用梯度洗脱方式：有机相浓度由0％经30分钟提高到50％，柱温30℃，流动相流速为1.0mL/min，280nm紫外检测，收集15－16和17－18分钟两个洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即为分子量为1852.75的核糖核酸酶B糖肽异构体，分别含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，纯度为90％。

实施例4：

称取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,货号R7884)10mg，加入200μL的8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，25℃温育2小时，缓冲溶液的pH为8。变性后的核糖核酸酶B加入40μL的400mM二硫苏糖醇50mM碳酸氢铵缓冲溶液，35℃温育1小时，还原变性后核糖核酸酶B的二硫键，然后加入10μL的100mM的碘代乙酸50mM碳酸氢铵缓冲溶液，避光条件下25℃温浴10分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的核糖核酸酶B加入9000μL的碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为0.05M，加入0.25mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为8，酶解反应温度为37℃，酶解时间为20小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩 10倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。

用粒径5微米的XIon(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径3.0mm，柱长150mm，流动相选择乙腈(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，含有10mM乙酸铵，采用梯度洗脱方式：水相浓度由30％经30分钟提高到50％，柱温30℃，流动相流速为0.4mL/min，280nm紫外检测，收集12－15分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径3微米的PGC色谱柱，柱径2.1mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用梯度洗脱方式：有机相浓度由0％经5分钟提高到20％，柱温30℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，收集18－20和20－22分钟两个洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即为分子量为1852.75的核糖核酸酶B糖肽异构体，分别含有2个N-乙酰葡萄糖胺和5个甘露糖，纯度为65％。

从核糖核酸酶B中制备糖肽异构体的方法及糖肽异构体专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。