专利摘要

本发明公开了一种茶油储存历史的预测方法，采用核磁共振技术结合动力学分析建立了茶油货架期预测模型。采用本发明的测定方法，通过1HNMR可以较好地检测到不同植物油中1,3‑DGs(4.10‑3.98ppm)和1,2‑DGs(3.76‑3.68ppm)信号；31PNMR可以检测到茶油和特级初榨橄榄油中的1,2‑DGs、1,3‑DGs、游离甾醇(主要是β‑谷甾醇)、游离脂肪酸(FFA)、以及少量的1‑单油甘酯(1‑MGs)等信号，NMR结合动力学方程可较好地对茶油货架期做出预测。

权利要求

1.一种茶油储存历史的预测方法，其特征在于：采用的是核磁共振技术，结合动力学分析建立茶油储存历史的预测模型，具体包括以下步骤：

A:31P NMR的测定：

(1)配制25mL吡啶和CDCl3的混合溶液以体积比为1.6:1.0，加入36μL环己醇作为内标，1.44mg的乙酰丙酮铬作为缓和剂，4A分子筛干燥，上述储备液置于4℃冰箱中；

(2)称取150mg油样于2mL离心管中，加入400μL上述储备液，再加入30μL衍生试剂，涡旋10min，衍生化反应30min后转移至5mm核磁管，直接测定31P NMR；

(3)31P NMR谱图测定参数：为了抑制NOE效应，采用反门控去耦技术处理，共振频率202.2MHZ，采集时间0.45s，160次扫描，90°脉冲宽度，弛豫延迟25s；探头温度25℃，以内标峰即磷酸酯化环己醇δ＝145.2ppm为基准校正化学位移，谱图范围为100-200ppm；

B:1H NMR的测定：

(1)称取200μL油样与800μL CDCl3混合，涡旋30s，室温下静至5min,取600μL转移至5mm核磁管中，温度平衡5min至室温后进行1H NMR测量；

(2)1H NMR谱测定参数：温度298K；质子共振频率为600.38MHz，时域为32K，脉冲为90，时间为11μs，谱宽为13ppm，恢复时间为2s，信号检测时间为2.73s，每次自由感应衰减扫描次数为32，虚拟扫描次数为4，化学位移以ppm为单位，以TMS，δ＝0.00ppm为内标，化学位移在δ＝7.6-6.9ppm归属于溶剂峰CDCl3的信号；

C:数据处理与分析:

(1)NMR图谱数据处理在MestReNova软件上操作，将测得的自由感应衰减信号进行傅里叶变换，自动调整相位和基线；

(2)在31PNMR图谱中，以内标即磷酸酯化环己醇的峰面积为100，将各31PNMR峰面积除以磷酸酯化环己醇峰面积，然后乘以加入环己醇的摩尔数13.47mM/25mL*30μL＝16.164μM，得到各化合物的摩尔数，进而算出单位质量内相应化合物的摩尔数，单位为μM/g；

(3)1H NMR图谱手动积分，将酰基链上α-亚甲基氢-OCO-CH2-，2.40-2.20ppm的积分面积标准化为1000，1,3-DGs(4.10-3.98ppm)和1,2-DGs(3.76-3.68ppm)信号峰积分值以此为参考标准。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种茶油储存历史的预测方法。

背景技术

茶油中含有较多不饱和脂肪酸，储存过程容易发生氧化酸败，致使茶油营养价值降低。茶油储存历史是关乎其新鲜度品质的一个关键指标，建立茶油储存时间和货架寿命预测模型对于茶油品质评价体系十分重要。

新鲜的植物油中主要含有甘油三酯(TGs)，随着储存时间的延长，TGs被降解为sn-1,2-甘油二酯(1,2-DGs)，并释放出游离脂肪酸，1,2-DGs又进一步逐渐转变成更稳定的sn-1,3-甘油二酯(1,3-DGs)，所以1,2-DGs在植物油中的浓度会不断下降,三者为动态平衡的关系。而D值(1,2-DGs/总DGs)与甘油三酯的水解无关，因此D值在评定植物油储存时间方面是个非常重要的参数。已有许多文献表明通过 31P NMR能够较好地检测到1,2-DGs和1,3-DGs信号。其中，Spyros 等通过31P NMR，检测到了橄榄油中的1,2-DGs、1,3-DGs、以及游离酸等信号，并且基于D值，成功建立了预测橄榄油储存历史10-12 个月的动力学模型。最近，Salvo等通过1H NMR监测了橄榄油中 1,2/1,3-DGs的变化趋势，其结果与31P NMR检测结果一致，表明基于1H NMR，也可以较好地预测橄榄油货架期。

但是，很少有研究报道采用核磁共振技术结合动力学分析建立茶油货架期预测模型，本实验基于1H NMR和31P NMR，定期检测D 值随储存时间的变化趋势，结合动力学分析，建立快速预测茶油货架期模型，为监测茶油的安全指标提供更加先进、准确和快捷的检测方法。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种茶油储存历史的预测方法，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种茶油储存历史的预测方法：采用的是核磁共振技术，结合动力学分析建立茶油储存历史的预测模型，具体包括以下步骤：

A:31P NMR的测定：

(1)配制25mL吡啶和CDCl3的混合溶液以体积比为1.6:1.0，加入 36μL环己醇作为内标，1.44mg的乙酰丙酮铬作为缓和剂，4A分子筛干燥，上述储备液置于4℃冰箱中；

(2)称取150mg油样于2mL离心管中，加入400μL上述储备液，再加入30μL衍生试剂，涡旋10min，衍生化反应30min后转移至5 mm核磁管，直接测定31P NMR；

(3)31P NMR谱图测定参数：为了抑制NOE效应，采用反门控去耦技术处理，共振频率202.2MHZ，采集时间0.45s，160次扫描，90°脉冲宽度，弛豫延迟25s；探头温度25℃，以内标峰即磷酸酯化环己醇δ＝145.2ppm为基准校正化学位移，谱图范围为100-200ppm；

B:1H NMR的测定：

(1)称取200μL油样与800μL CDCl3混合，涡旋30s，室温下静至5min,取600μL转移至5mm核磁管中，温度平衡5min至室温后进行1H NMR测量；

(2)1H NMR谱测定参数：温度298K；质子共振频率为600.38MHz，时域为32K，脉冲为90，时间为11μs，谱宽为13ppm，恢复时间为 2s，信号检测时间为2.73s，每次自由感应衰减扫描次数为32，虚拟扫描次数为4，化学位移以ppm为单位，以四甲基硅烷-TMS，δ＝0.00 ppm为内标，化学位移在δ＝7.6-6.9ppm归属于溶剂峰CDCl3的信号； C:数据处理与分析:

(1)NMR图谱数据处理在MestReNova软件上操作，将测得的自由感应衰减信号进行傅里叶变换，自动调整相位和基线；

(2)在31PNMR图谱中，以内标即磷酸酯化环己醇的峰面积为100，将各31PNMR峰面积除以磷酸酯化环己醇峰面积,然后乘以加入环己醇的摩尔数13.47mM/25mL*30μL＝16.164μM，得到各化合物的摩尔数，进而算出单位质量内相应化合物的摩尔数，单位为μM/g；

(3)1H NMR图谱手动积分，将酰基链上α-亚甲基氢-OCO-CH2-， 2.40-2.20ppm的积分面积标准化为1000，1,3-DGs(4.10-3.98ppm) 和1,2-DGs(3.76-3.68ppm)信号峰积分值以此为参考标准。

本发明的有益效果

(1)通过1H NMR可以较好地检测到不同植物油中1,3-DGs(4.10-3.98 ppm)和1,2-DGs(3.76-3.68ppm)信号；

(2)通过31P NMR可以检测到茶油和特级初榨橄榄油中的1,2-DGs、 1,3-DGs、游离甾醇(主要是β-谷甾醇)、游离脂肪酸(FFA)、以及少量的1-单油甘酯(1-MGs)等信号；

(3)NMR结合动力学方程可较好地对茶油货架期做出预测。

附图说明

图1新鲜毛茶油(a)、精炼茶油(b)、特级初榨橄榄油(c)的31P NMR 谱；

图2新鲜毛茶油、精炼茶油、特级初榨橄榄油的1H NMR谱(4.10-3.70 ppm)；

图3不同氧化阶段下不同植物油1H NMR信号变化图；

图4基于31P NMR检测到的3种植物油中1,2-DGs、1,3-DGs、总DGs 变化；

图5不同植物油D值变化：(a)31P NMR得到的数据；(b)1H NMR 得到的数据。

具体实施方式

实施例1

原料与试剂：压榨毛茶油(金寨，江西省南昌市)由江西省南昌市质检局提供，压榨精炼茶油(绿海，江西省吉安市)和特级初榨橄榄油 (欧丽薇兰，西班牙)均购自当地商场(南昌天虹)；三种油样的生产期为2017年2月-2017年4月。将上述油样分装在干净透明的20mL 顶空进样瓶中，每个进样瓶所装油样均为18.00g(精确到0.00g)，总计36个样品，室温见光自然放置，每隔30天测其1HNMR和31PNMR。

氘代氯仿(CDCl3,99.8％+0.03％TMS)和4A分子筛：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；环己醇(≥98.5％，CAS No.44113)、乙酰丙酮铬(97％，CAS No.202231-5G)、吡啶(≥99.9％，CAS No.270407) 和2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(95％,CAS No.447536-1G)：美国Sigma-Aldrich公司。

仪器与设备：

BrukerAV 600MHz核磁共振波谱仪：瑞士布鲁克公司；5mm核磁共振样品管：美国Wilmad公司；QL-861型涡旋仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DragonLab移液器：北京大龙实验室仪器有限公司。

实验步骤与过程：

一种茶油储存历史的预测方法：采用的是核磁共振技术，结合动力学分析建立茶油储存历史的预测模型，具体包括以下步骤：

A:31P NMR的测定：

(1)配制25mL吡啶和CDCl3的混合溶液以体积比为1.6:1.0，加入 36μL环己醇作为内标，1.44mg的乙酰丙酮铬作为缓和剂，4A分子筛干燥，上述储备液置于4℃冰箱中；

(2)称取150mg油样于2mL离心管中，加入400μL上述储备液，再加入30μL衍生试剂，涡旋10min，衍生化反应30min后转移至5 mm核磁管，直接测定31P NMR；

(3)31P NMR谱图测定参数：为了抑制NOE效应，采用反门控去耦技术处理，共振频率202.2MHZ，采集时间0.45s，160次扫描，90°脉冲宽度，弛豫延迟25s；探头温度25℃，以内标峰即磷酸酯化环己醇δ＝145.2ppm为基准校正化学位移，谱图范围为100-200ppm；

B:1H NMR的测定：

(1)称取200μL油样与800μL CDCl3混合，涡旋30s，室温下静至 5min,取600μL转移至5mm核磁管中，温度平衡5min至室温后进行1H NMR测量；

(2)1H NMR谱测定参数：温度298K；质子共振频率为600.38MHz，时域为32K，脉冲为90，时间为11μs，谱宽为13ppm，恢复时间为 2s，信号检测时间为2.73s，每次自由感应衰减扫描次数为32，虚拟扫描次数为4，化学位移以ppm为单位，以四甲基硅烷(TMS，δ＝0.00ppm)为内标，化学位移在δ＝7.6-6.9ppm归属于溶剂峰CDCl3的信号； C:数据处理与分析:

(1)NMR图谱数据处理在MestReNova软件上操作，将测得的自由感应衰减信号进行傅里叶变换，自动调整相位和基线；

(2)在31P NMR图谱中，以内标即磷酸酯化环己醇的峰面积为100，将各31PNMR峰面积除以磷酸酯化环己醇峰面积,然后乘以加入环己醇的摩尔数13.47mM/25mL*30μL＝16.164μM，得到各化合物的摩尔数，进而算出单位质量内相应化合物的摩尔数，单位为μM/g；

(3)1H NMR图谱手动积分，将酰基链上α-亚甲基氢-OCO-CH2-， 2.40-2.20ppm的积分面积标准化为1000，1,3-DGs(4.10-3.98ppm) 和1,2-DGs(3.76-3.68ppm)信号峰积分值以此为参考标准。

31P NMR结果分析：

说明书附图1为3种新鲜植物油的31P NMR指纹图谱，通过31P NMR可以检测到茶油和特级初榨橄榄油中的1,2-甘油二酯(1,2-DGs)、1,3-甘油二酯(1,3-DGs)、游离甾醇(主要是β-谷甾醇)、游离脂肪酸 (FFA)、以及少量的1-单油甘酯(1-MGs)。新鲜油样中各化合物具体含量见表1，其中D值为1,2-DGs与总DGS之比。特级初榨橄榄油中1,3-DGs含量为0.35％(＜0.4％)，Total DGs×1,3-DGs＜1.0％，Total DGs/1,3-DGs＞5.0％，符合新鲜特级初榨橄榄油的标准要求，进一步分析可知新鲜毛茶油和特级初榨橄榄油中1,2-DGs含量均高于1,3-DGs 含量，而新鲜精炼茶油则相反。此外，新鲜精炼茶油中总DGs含量 (7.67％)远高于新鲜毛茶油(2.47％)和特级初榨橄榄油(2.83％)。 D值和FFA在定量评定油脂氧化方面是重要的参数。新鲜的特级初榨橄榄油中D值接近1(0.88)，FFA含量(0.05％)，说明仅有极少量的油脂发生了降解氧化。新鲜毛茶油中D值和FFA分别为0.72和 0.71％，而精炼茶油中二者分别为0.32和0.05％，其值均低于毛茶油中，原因可能是精炼促使甘油三酯水解以及甘油二酯的异构化。甾醇信号强度在毛茶油和橄榄油中较高，但精炼茶油中很低，之前已有文献表明橄榄油中β-甾醇含量(850-1700mg/kg)大约是精炼茶油中β- 甾醇含量(189.88-361.29mg/kg)的4-9倍，与我们的结果一致，进一步表明31P NMR在定量描述多种不同化合物的适用性和准确性。

表1新鲜植物油中甘油二酯组成、游离脂肪酸(FFA)含量以及D值

1H NMR分析

由说明书附图2可知，通过1H NMR可以较好地检测到不同植物油中1,3-DGs(4.10-3.98ppm)和1,2-DGs(3.76-3.68ppm)。其中， 1,3-DGs在新鲜精炼茶油中信号强度最高，而在新鲜毛茶油中的信号强度最低，该结果与31P NMR结果类似。由说明书附图3可知，通过对毛茶油、精炼茶油和特级初榨橄榄油连续12个月的监测可以看出，随着储存时间的延长，1,3-DGs信号在三种植物油中逐渐增强。当储存时间达到1个月时，1,3-DGs信号在精炼茶油中已有明显的改变。当储存时间达到3个月时，可以看出1,3-DGs信号在毛茶油和特级初榨橄榄油中的增强趋势。

动力学模型分析

基于31P NMR，对检测到的1,2-DGs和1,3-DGs进一步结合动力学分析。如说明书附图4所示，随着储存时间的延长，1,2-DGs在所有植物油中先下降，尤其在1-5个月下降明显，而在10个月之后，趋于稳定。此外，进一步分析可以看出随着储存时间的延长，1,3-DGs 和总DGs在毛茶油和特级初榨橄榄油中逐渐增加，当达到10个月时，趋于稳定；而在精炼茶油中，1,3-DGs和总DGs整体呈下降趋势，原因可能是1,3-DGs进一步水解成甘油单酯。

由说明书附图5(a)可知，氧化初期三种植物油D值最大，随着储存时间的延长，毛茶油和特级初榨橄榄油的D值逐渐减小，且变化趋势较规律。当储存时间达到10个月时，二者D值趋于稳定；当储存时间达到12个月时，毛茶油D值由最初的0.72降至0.31，特级初榨橄榄油的D值由0.88降至0.31。相比毛茶油和特级初榨橄榄油，精炼茶油的D值变化规律不是很明显，整体呈先下降后上升的趋势。氧化初期D值最大，为0.32；当储存时间为5个月时，D值最小，为0.27；当储存时间达到12个月时，D值又升至0.31。为了进一步探索D值变化规律，针对D值变化建立动力学方程，如表2 所示。毛茶油和特级初榨橄榄油拟合方程中的R2分别为0.97782和 0.98618，说明基于31P NMR结合动力学方程能够较好地预测货架期。

表2毛茶油和橄榄油的动力学拟合方程参数

同时，基于1H NMR数据，建立了D值随储存时间变化的动力学曲线，如图5(b)所示。毛茶油和特级初榨橄榄油的D值随着储存时间的延长，逐渐减小，呈规律变化，但精炼茶油的D值变化不明显，这一结果与基于31P NMR数据得到的D值变化曲线相类似。进一步建立动力学方程可以看出，毛茶油和特级初榨橄榄油拟合方程中的R2分别为0.96223和0.98236，线性较好。说明1H NMR结合动力学方程也能较好地预测茶油货架期。

一种茶油储存历史的预测方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。