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一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法

一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法

IPC分类号 : C07J1/00I,C07J5/00I

申请号
CN201811653139.0
可选规格
  • 专利类型: 发明专利
  • 法律状态: 有权
  • 申请日: 2018-12-29
  • 公开号: 110372769B
  • 公开日: 2019-10-25
  • 主分类号: C07J1/00I
  • 专利权人: 浙江工业大学 ; 浙江绿创生物科技有限公司 ;

专利摘要

本发明涉及一种甾体发酵后提取新方法,其包括以下工艺步骤:发酵液升温灭活;初始膜水通量的测定,发酵液进行膜过滤收集截留液,再进行膜的清洗,洗至初始膜水通量;所得截留液继续用甲醇萃取,分层得到甾体产品甲醇萃取液,再继续浓缩至粘稠状加水分散过滤得粗品;粗品再用第一种溶剂升温打浆,降温过滤得一精,一精再用第二种溶剂溶解、脱色、重结晶即得成品。本发明设计合理,工艺简单,可操作性强,工作环境毒害性小,不仅避免了传统工艺全萃法的的乳化难分离现象,而且提供了一种新型的分离方法,避免了有毒萃取有机溶剂的使用,解决了废水处理问题。该法成本低,收率高,最终产品符合市场品质要求。

权利要求

1.一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于包括以下工艺步骤:

(1)含油量2~25%的甾体发酵液升温至50~80℃,维持1~3h灭活后,降至室温;

(2)记录膜过滤料液前的水通量,灭活后的发酵液进行膜过滤,滤液量为发酵液量的3/4~9/10时,停止过滤,收集最后的截留液,再进行膜的清洗,洗至过滤料液前记录的水通量;

(3)根据截留液即油相的量,加入2~4倍体积的甲醇萃取,20~70℃搅拌0.5~3h,静置0.5~3h,分出上层甲醇相,下层油相继续按同样方法,加入2~4倍体积的甲醇,萃取2~5次,合并甲醇萃取液,浓缩至粘稠状加水分散,过滤、烘干得粗品;

(4)根据粗品的量,加入2~8倍第一种溶剂升温至50~80℃打浆1~4h,降至室温,过滤、烘干得一精;所述第一种溶剂选自正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚、甲苯中的一种或多种;

(5)根据一精的量,加入2~10倍第二种溶剂升温至50~80℃,加入相对于溶解液w/v0.2~2%的活性炭,脱色1~4h,过滤除去活性炭,滤液即脱色液再浓缩1~3倍后,降至室温,过滤、烘干得成品;所述第二种溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种;

其中,所述的甾体产品是雄烯二酮、 21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮或 9羟基雄烯二酮;

所述的膜是孔径50nm的陶瓷膜。

说明书

技术领域

本发明属于甾体系列产品的发酵后提取工艺技术领域,具体涉及一种通过膜分离技术使含培养基的水相和含菌体、油及甾体产品的油相得到有效分离的方法,并解决了行业领域油水分离难的问题,同时使废水也便于处理。

背景技术

甾体化合物是动植物中广泛存在并在生命过程中起重要作用的一类天然产物,如甾醇、维生素D、胆汁酸、许多性激素、肾上腺皮质激素、某些致癌烃、甾族皂素以及甾族生物碱等。“甾”字形象地表现了甾体分子的结构特征,下部分的“田”字代表A、B、C、D四个稠合环,上部分的“〈〈〈”则表示连接的三个侧链。下式显示了甾体化合物的结构通式,甾体主要由A、B、C三个六元环和一个五元环D组成,形成了刚性的甾体骨架。其中R1、R2位通常是甲基、羟基、醛基等,R3位通常是一些碳链的结构,或者含氮、含氧的取代基。

由于侧链的不同以及其取代基如双键、羟基的立体化学差异,决定了其结构多样性和特异的生物学功能,引起人们对这类化学物研究的极大兴趣。甾体类化合物也是重要的医药工业基本原料,采用半合成的方法,经结构改造进行合成,用于生产多种甾体类药物。

4AD、BA、9αOH-AD等主要用来合成许多性激素、孕激素、皮质激素等甾体类药物,是目前市场上最主要的甾体类药物上游中间体。结构如下:

陶瓷膜是以氧化铝、氧化锆等经高温烧结而成的具有多孔结构的精密陶瓷过滤材料,其多孔支撑层、过滤层及微滤膜层呈非对称分布,建立于无机材料科学基础上的无机陶瓷膜具有比板框、离心机、硅藻土等传统分离介质及聚合物膜无法比拟的一些优点:

·耐高温、耐有机溶剂;

·分离精度高,透过液澄清透明,大大减轻后续处理难度;

·孔径分布的误差小,孔的直径均一;

·较高的过滤精度,较高的空隙率;

·化学稳定性极佳,能耐酸、耐碱、耐氧化;

·机械强度大,耐磨性好;

·易清洗,可在线药剂或高温消毒,可反向冲洗。

陶瓷膜分离技术是基于多孔陶瓷介质的筛分效应而进行的物质分离技术,采用与传统“死端过滤”“滤饼过滤”等过滤方式截然不同的动态“错流过滤”方式:即在压力驱动下,原料液在膜管内侧膜层表面以一定的流速高速流动,小分子物质(液体)沿与之垂直方向透过微孔膜,大分子物质(或固体颗粒)被膜截留,使流体达到分离浓缩和纯化的目的。

在甾体系列油发酵后提取中,由于发酵体系主要为菌体、油、甾体产品、培养基、水等,所以如何使含培养基的水相和含菌体、油及甾体产品的油相得到有效分离,是后提取工艺的关键技术所在。随着发酵法在甾体行业的日益发展,4AD、 BA、9αOH-AD等这一类的上游中间体市场需求量越来越大,而这一类的中间体,基本都是通过油发酵获得,因此,如何有效快速的分离并提纯得到满足市场要求的这一类中间体成品,是市场所需,也是行业技术发展的重要方向。

目前,市场上这一类产品已经规模化生产的油水分离工艺主要有以下几种:

(1)静置分层:发酵液先静置分层,分出大部分油层,下层为水层、菌体、产品的乳化体系,下层再通过沉降获得菌体和产品的混合物,和前面的油层合并再进一步提纯。该法缺点静置时间长,下层沉降不仅耗时、而且产品沉降不完全,因此收率较低,最后的废水含油和产品。

(2)全萃:有些发酵液静置后根本就无法分层,所以很难得到油层,所以就通过乙酸乙酯或氯仿类的非水溶性溶剂对发酵液进行多次萃取,最后的萃取液再浓缩回收溶剂进一步提纯。该法缺点是萃取后的废水含有机溶剂,生化废水系统很难处理,而且乳化层较多,有些甚至根本无法分层。所以工艺不稳定,废水处理问题严重。

(3)蒸馏:有些采用蒸馏的方法,直接加热蒸出发酵液中的水,最后的浓缩液再去进一步提纯,该法虽然拿走了水,但是蒸馏能耗高,而且拿走的只是水和一些挥发性物质,其它水溶性不挥发的物质还是和油相在一起,对后面的进一步提纯工艺提出了更高的要求。因此,该法能耗成本高,后续提纯工艺复杂。

发明内容

针对现有生产技术中存在的问题,本发明通过膜分离技术使含培养基的水相和含菌体、油及甾体产品的油相得到有效分离,该法操作简单,避免了油水分层难、乳化难分离的问题,能耗也低,产生的废水也可直接进入生化系统进行处理。

所述的一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于包括以下工艺步骤:

(1)含油量2~25%的甾体发酵液升温至50~80℃,维持1~3h灭活后,降至室温;

(2)记录膜过滤料液前的水通量,灭活后的发酵液进行膜过滤,滤液量为发酵液量的3/4~9/10时,停止过滤,收集最后的截留液,再进行膜的清洗,洗至过滤料液前记录的水通量;

(3)根据截留液(下称油相)的量,加入2~4倍体积的甲醇萃取,20~70℃搅拌 0.5~3h,静置0.5~3h,分出上层甲醇相,下层油相继续按同样方法,加入2~4倍体积的甲醇,萃取2~5次,合并甲醇萃取液,浓缩至粘稠状加水分散,过滤、烘干得粗品;

(4)根据粗品的量,加入2~8倍第一种溶剂升温至50~80℃打浆1~4h。降至室温,过滤、烘干得一精;

(5)根据一精的量,加入2~10倍第二种溶解升温至50~80℃,加入0.2~2%(相对于溶解液w/v)活性炭,脱色1~4h,过滤除去活性炭,滤液即脱色液再浓缩 1~3倍后,降至室温,过滤、烘干得成品。

所述的一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于步骤(1)中甾体发酵液的含油量2~25%,灭活温度50~80℃,灭活时间1~3h,甾体产品可以是4AD(雄烯二酮,CAS号63-05-8)、BA(21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮,CAS号 60966-36-1)、9αOH-AD(9羟基雄烯二酮或CAS号560-62-3)等。

所述的一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于步骤(2)中膜过滤料液前需要记录水通量,膜过滤后的透过液量为发酵液量的3/4~9/10,膜可以是孔径50nm的陶瓷膜、孔径200nm的陶瓷膜等。

所述的一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于步骤(3)中萃取甲醇用量为上一步膜截留液量的2~4倍,萃取温度20~70℃,搅拌0.5~3h,静置0.5~3h,萃取2~5次。

所述的一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于步骤(4)中第一溶剂用量为粗品量的2~8倍,打浆温度为50~80℃,时间1~4h;所述第一溶剂选自正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚、甲苯中的一种或多种。

所述的一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法,其特征在于步骤(5)中第二溶剂用量为一精量的2~10倍,活性炭用量为0.2~2%(相对于溶解液w/v),脱色温度 50~80℃,脱色时间1~4h,滤液浓缩倍数1~3倍;所述第二溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种。

本发明设计合理,工艺简单,可操作性强,工作环境毒害性小,不仅避免了传统工艺全萃法的乳化难分离现象,相对于蒸馏法能耗低、水溶性杂质也得到有效分离。而且,该法在行业中也是一种新型的分离方法,避免了有毒萃取有机溶剂的使用,解决了废水处理问题。该法成本低,收率高,最终产品也符合市场品质要求。

具体实施方法

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。

甾体系列油发酵液及后提取物料中的甾体产品,含量用HPLC检测,收率以产出合格成品量与发酵底物甾醇的量之比进行计算。

实施例1

35L4AD发酵液(油4.8L,底物甾醇加入量1.75kg)80℃灭活1h后,降至室温。记录膜(陶瓷膜:孔径50nm、过滤面积0.12㎡,符合海洋行业技术标准) 初始水通量500L/㎡·h,将灭活后的发酵液进行膜过滤,接收透过液27L后,停止过滤,收集截留液(即油相)约8L,膜再用药剂清洗至水通量为400~500L/ ㎡·h。

8L截留液加16L甲醇60℃萃取4次,合并甲醇萃取液浓缩至粘稠状加7L 水分散,过滤,滤饼烘干得1.5kg4AD粗品。

1.5kg4AD粗品加5.5L正己烷升温至60℃,搅拌2h,降至室温,过滤,滤饼烘干得1kg4AD一精。

1kg4AD一精加9L甲醇升温至60℃溶解,加30g活性炭,脱色1h,过滤,滤液浓缩至4.5L,降至室温,过滤,滤饼烘干得0.88kg4AD成品(纯度99.5%,含量98.7%),收率50.28%。

实施例2

35LBA发酵液(油4.8L,底物甾醇加入量1.75kg)80℃灭活1h后,降至室温。记录膜(陶瓷膜:孔径50nm、过滤面积0.12㎡,符合海洋行业技术标准) 初始水通量500L/㎡·h,将灭活后的发酵液进行膜过滤,接收透过液27L后,停止过滤,收集截留液(即油相)约8L,膜再用药剂清洗至水通量为400~500L/ ㎡·h。

8L截留液加16L甲醇60℃萃取4次,合并甲醇萃取液浓缩至粘稠状加7L 水分散,过滤,滤饼烘干得1.3kgBA粗品。

1.3kgBA粗品加5.5L正庚烷升温至60℃,搅拌2h,降至室温,过滤,滤饼烘干得0.9kgBA一精。

0.9kgBA一精加9L甲醇升温至60℃溶解,加30g活性炭,脱色1h,过滤,滤液浓缩至4.5L,降至室温,过滤,滤饼烘干得0.8kgBA成品(纯度99.5%,含量98.9%),收率45.71%。

实施例3

35L9αOH-AD发酵液(油4.8L,底物甾醇加入量1.75kg)80℃灭活1h后,降至室温。记录膜(陶瓷膜:孔径50nm、过滤面积0.12㎡,符合海洋行业技术标准)初始水通量500L/㎡·h,将灭活后的发酵液进行膜过滤,接收透过液27L 后,停止过滤,收集截留液(即油相)约8L,膜再用药剂清洗至水通量为400~500L/ ㎡·h。

8L截留液加16L甲醇60℃萃取4次,合并甲醇萃取液浓缩至粘稠状加7L 水分散,过滤,滤饼烘干得1.2kg9αOH-AD粗品。

1.3kg9αOH-AD粗品加7L甲苯升温至60℃,搅拌2h,降至室温,过滤,滤饼烘干得1kg9αOH-AD一精。

1kg9αOH-AD一精加9L乙醇升温至60℃溶解,加30g活性炭,脱色1h,过滤,滤液浓缩至4.5L,降至室温,过滤,滤饼烘干得0.85kg9αOH-AD成品(纯度99.5%,含量98%),收率48.57%。

一种从甾体发酵液中提取甾体产品的方法专利购买费用说明

专利买卖交易资料

Q:办理专利转让的流程及所需资料

A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。

1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2:按规定缴纳著录项目变更手续费。

3:同时提交相关证明文件原件。

4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q:专利转让变更,多久能出结果

A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。

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