专利摘要

本发明公开了一种布雷菲德菌素A酯类衍生物及其制备与应用，本发明所述布雷菲德菌素A酯类衍生化合物具有抗氧化活性和抗肿瘤活性，其中布雷菲德菌素A酯类衍生物式(Ⅰ‑1)、(Ⅰ‑3)、(Ⅰ‑5)或(Ⅰ‑7)所示化合物有好的抗氧化效果，能够清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O2‑)，且化合物(Ⅰ‑7)清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O2‑)能力均优于维生素E；式(Ⅰ‑1)、(Ⅰ‑3)、(Ⅰ‑5)或(Ⅰ‑7)所示化合物对人肺癌细胞A549有较好的抑制活性。因此，结果显示衍生物在药物开发体系中具有广阔的应用前景，为合成和筛选BFA衍生药物提供了新的更广阔的思路，以期为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。

权利要求

1.一种式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备抗氧化药物、抗中国仓鼠肺细胞CHL活性药物或抗人肺癌细胞A549活性药物中的应用，

式(Ⅰ)中R₁为H或 R₂为 R₁、R₂中R₃同时为下列之一：

当制备抗中国仓鼠肺细胞CHL活性药物或抗人肺癌细胞A549活性药物时，R₃为呋喃基除外。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A酯类衍生物为下列之一：

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-5)或式(Ⅰ-7)所示化合物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A酯类衍生物按如下方法制备：以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A和式(Ⅲ)所示化合物为原料，以二氯甲烷为溶剂，在碳二酰亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的作用下，通氮气，于40～50℃、150W微波辅助条件下反应，反应结束后，反应液后处理制得式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A酯类衍生物；

式(Ⅲ)中R₃为下列之一：

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与式(Ⅲ)所示化合物投料物质的量之比为1：4；所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与碳二酰亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶投料物质的量之比为1：4：3.3；所述二氯甲烷体积用量以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A物质的量计为60-150ml/mmol。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应液后处理方法为：反应结束后，反应液中加入二氯甲烷进行萃取，收集有机层先进行水洗，后用饱和NaCl水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析，得到式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A酯类衍生物。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-5)所示化合物。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及布雷菲德菌素A酯类衍生化合物制备与应用。

(二)背景技术

布雷菲德菌素A((+)-Brefeldin A，简称BFA)，是一种新型的抗生素，由一种大环内酯类真菌产生的次级代谢产物，也可称之为斜卧菌素或壳二孢素，具有多种生物学活性，包括抗真菌、抗病毒、抗线虫、抗有丝分裂，另外还可以分子工具的作用应用于哺乳动物信号传导途径的研究中。但是，因为布雷菲德菌素A存在水溶性差，半衰期短，靶向性低和生物利用度低等问题，使得它在诸多方面的应用受到限制，因此对BFA进行结构修饰来克服其本身存在的不良因素，使它能够尽快应用于临床研究已经成为新的科学研究热点。本发明正是通过对BFA的4-OH，7-OH的化学修饰得到BFA衍生物，实现增加BFA水溶性，改善药代动力学性质的目的，使其更易进入人体。

前药是指一些在体外活性较小或者无活性的化合物，在体内经过酶的催化或者非酶作用，释放出活性物质从而发挥其药理作用的化合物。酯类前体药物为前药中最常见的类型，进入体内后在酯酶催化下水解出原药，含有羧基或羟基的药物可通过与醇或羧酸反应制成酯类前药。BFA的酯类物质有着以下几个理论优势：①可提高药物的稳定性；②改善药物的溶解性；③改善药物的吸收；④延长药物的作用时间；⑤降低药物的毒副作用；⑥消除药物的不良臭味；⑦发挥药物的配伍作用等，对BFA的羟基位点进行修饰，使其生成酯类衍生物是目前一个研究热点。

本发明正是通过对BFA的4-OH，7-OH的化学修饰，得到BFA单酯和双酯类衍生物，检测了其抗氧化活性，以及通过检测其对人肺癌细胞系(A549)、中国仓鼠肺细胞(CHL)的抑制能力，研究BFA酯类衍生物的抗肿瘤活性和构效关系，预测了这些衍生物的吸收、分布、代谢、消除和毒性等药代动力学性质以及验证了是否以前药的形式释放BFA发挥抗肿瘤活性，为抗肿瘤新药筛选提供了研究基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种布雷菲德菌素A酯类衍生化合物及其制备方法，以及该类化合物在制备抗氧化和抗肿瘤活性药物中的应用，该类化合物合成工艺简单，具有较好的抗氧化活性和抗肿瘤活性以及较好的研究价值。

本发明采用的技术方案是：

本发明所述布雷菲德菌素A(BFA)的结构式为式(Ⅱ)

式(Ⅱ)中：3-，11-碳碳双键，4-OH，7-OH以及15-CH₃均为BFA本身可修饰基团，用以合成不同的BFA衍生物，以改变其性质。本发明优选的修饰基团为4-OH，7-OH，修饰所用化合物包括不同的酸类化合物，以合成酯类化合物。

本发明提供一种式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A酯类衍生物，

式(Ⅰ)中R₁为H或 R₂为 R₁、R₂中R₃同时为下列之一：

本发明优选所述布雷菲德菌素A酯类衍生物为下列之一：

本发明所述布雷菲德菌素A酯类衍生物最优选为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-5)或式(Ⅰ-7)所示化合物。

本发明还提供一种所述布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法，所述方法为：以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A和式(Ⅲ)所示化合物为原料，以二氯甲烷为溶剂，在碳二酰亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的作用下，通氮气，于40～50℃、150W微波辅助条件下反应，反应结束后，反应液后处理制得式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A酯类衍生物；

式(Ⅲ)中R₃为下列之一：

进一步，所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与式(Ⅲ)所示化合物投料物质的量之比为1：4；所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与碳二酰亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶投料物质的量之比为1：4：3.3；所述二氯甲烷体积用量以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A物质的量计为60-150ml/mmol，优选80-135ml/mmol。

本发明所述布雷菲德菌素A酯类衍生物的制备方法中，首先将式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A用二氯甲烷溶解制成式(Ⅱ)溶液，式(Ⅲ)所示化合物用二氯甲烷溶解成式(Ⅲ)溶液，然后将式(Ⅲ)溶液缓慢加入式(Ⅱ)溶液中，再加入碳二酰亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，通氮气，于40～50℃、150W微波辅助条件下反应。

本发明所述反应液后处理方法为：反应结束后，反应液中加入二氯甲烷进行萃取，收集有机层先进行水洗，后用饱和NaCl水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v为展开剂)，收集Rf＝0.5～0.65的组分，得到式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A酯类衍生物。

本发明还提供一种所述布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备抗氧化药物中的应用，具体优选所述布雷菲德菌素A酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-5)或(Ⅰ-7)所示化合物，所述布雷菲德菌素A酯类衍生物能够清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O₂^-)。

本发明提供一种所述布雷菲德菌素A酯类衍生物在制备抗肿瘤活性药物中的应用，具体优选所述布雷菲德菌素A酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-5)所示化合物，优选中国仓鼠肺细胞CHL和人肺癌细胞A549。。

本发明所述的制备BFA酯类化合物的反应式为：

式(Ⅲ)中R₃为下列之一：

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明通过酸类化合物分别与布雷菲德菌素A发生亲电加成反应，制备了两类新的布雷菲德菌素A酯类衍生化合物；(2)本发明提供了一种新的布雷菲德菌素A酯类衍生物，研究它们的构效关系，从而有新的研究方向和新的药物开发思路；(3)该类BFA衍生物具有抗氧化活性和抗肿瘤活性，其中布雷菲德菌素A酯类衍生物式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-5)或(Ⅰ-7)所示化合物有好的抗氧化效果，能够清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O₂^-)，且化合物(Ⅰ-7)清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O₂^-)能力均优于维生素E。式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-5)或(Ⅰ-7)所示化合物对人肺癌细胞A549有较好的抑制活性。因此，结果显示衍生物在药物开发体系中具有广阔的应用前景，为合成和筛选BFA衍生药物提供了新的更广阔的思路，以期为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：4’7-2-(3-(三氟甲基)苯氧基)-布雷菲德菌素A乙酸双酯(Ⅰ-1)的制备

反应式如下：

称取布雷菲德菌素A(Ⅱ)(1eq，0.3mmol，84mg)，溶于20mL无水二氯甲烷制成(Ⅱ)溶液，取2-(3-(三氟甲基)苯氧基)乙酸(Ⅲ-1)(4eq，1.2mmol，0.264g)溶于20ml无水二氯甲烷中制成(Ⅲ-1)溶液，并将(Ⅲ-1)溶液缓慢地加入到(Ⅱ)溶液中，再依次加入EDC·HCl(4eq，1.2mmol，0.230g)和DMAP(3.3eq，1mmol，0.122g)，通氮气，于44℃条件下微波辅助反应6.5h，微波功率为150W，反应过程中以薄层层析检测反应是否完全(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)。反应结束后，加入20ml水淬灭，再加入2×30ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×50ml，饱和NaCl水溶液洗涤2×50ml。收集有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v为展开剂)，收集Rf＝0.65的组分，得到4’7-2-(3-(三氟甲基)苯氧基)-布雷菲德菌素A乙酸双酯(Ⅰ-1)。

4’7-2-(3-(三氟甲基)苯氧基)-布雷菲德菌素A乙酸双酯(Ⅰ-1)(产率55％)：MS(ESI)m/z 646(M+H)⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.46–7.36(m,2H),7.27(d,J＝9.8Hz,2H),7.13(d,J＝6.2Hz,1H),7.05(s,3H),5.66(d,J＝15.6Hz,2H),5.37(d,J＝10.1Hz,1H),5.25(s,1H),5.01(dd,J＝15.2,9.6Hz,1H),4.86(d,J＝4.8Hz,1H),4.73(s,1H),4.64(s,2H),2.44(s,1H),2.38–2.26(m,1H),1.94(t,J＝15.2Hz,2H),1.88–1.81(m,2H),1.72(s,1H),1.62(s,4H),1.50(s,1H),1.24(d,J＝6.1Hz,3H),0.87(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ167.75,167.34,165.21,157.75,145.67,135.11,132.20,131.50,130.27,130.20,124.83,120.52,119.00,118.69,118.24,117.91,111.70,111.19,77.28,77.06,77.03,76.78,76.67,71.94,65.37,65.11,49.68,43.86,39.71,38.18,34.09,31.69,26.36,20.66。

IRν_max(cm^-1):2977.98,2927.23,2861.10，2842.63,1753.36,1701.42,1592.66,1435.71,1329.03,1199.73，1174.12,1140.45,1100.74,1077.95,1064.61,1014.70，985.02,866.99。

实施例2：7-2-呋喃-布雷菲德菌素A甲酸单酯(Ⅰ-2)和4’7-2-呋喃-布雷菲德菌素A甲酸双酯(Ⅰ-3)的制备

反应式如下：

称取布雷菲德菌素A(Ⅱ)(1eq，0.3mmol，84mg)，溶于20mL无水二氯甲烷制成(Ⅱ)溶液，取2-呋喃甲酸(Ⅲ-2)(4eq，1.2mmol，0.135g)溶于20ml无水二氯甲烷中制成(Ⅲ-2)溶液，并将(Ⅲ-2)溶液缓慢地加入到(Ⅱ)溶液中，再依次加入EDC·HCl(4eq，1.2mmol，0.230g)和DMAP(3.3eq，1mmol，0.122g)，通氮气，于44℃条件下微波反应7h，微波功率为150W，反应过程中以薄层层析检测反应是否完全(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)。反应结束后，向反应液加入20ml水淬灭，再加入2×30ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×50ml，饱和NaCl水溶液洗涤2×50ml。收集有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v为展开剂)，收集R_f＝0.5的组分得到7-2-呋喃-布雷菲德菌素A甲酸单酯(Ⅰ-2)，收集R_f＝0.65的组分得到4’7-2-呋喃-布雷菲德菌素A甲酸双酯(Ⅰ-3)。

7-2-呋喃-布雷菲德菌素A甲酸单酯(Ⅰ-2)(产率20％)：MS(ESI)m/z 375(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.60(d,J＝15.5Hz,1H),7.37–7.21(m,2H),6.52(d,J＝14.4Hz,1H),5.83–5.67(m,2H),5.49(d,J＝10.4Hz,1H),5.31(dt,J＝23.8,11.9Hz,1H),4.84(dd,J＝10.8,5.8Hz,1H),4.33(s,1H),2.53–2.40(m,1H),2.38–2.19(m,2H),2.00(d,J＝8.8Hz,2H),1.85(t,J＝9.1Hz,2H),1.80–1.64(m,2H),1.54(d,J＝6.7Hz,2H),1.24(d,J＝5.8Hz,3H),0.89(dd,J＝19.8,14.0Hz,2H)。

4’7-2-呋喃-布雷菲德菌素A甲酸双酯(Ⅰ-3)(产率50％)：MS(ESI)m/z467(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.57(d,J＝9.9Hz,2H),7.35–7.10(m,1H),6.54–6.46(m,2H),5.76(ddd,J＝14.7,12.8,2.7Hz,2H),5.52(d,J＝9.5Hz,2H),5.40–5.21(m,1H),4.83(dd,J＝9.9,6.0Hz,2H),2.63–2.50(m,1H),2.48–2.36(m,1H),2.35–2.17(m,1H),2.07–1.94(m,2H),1.95–1.66(m,1H),1.52(dd,J＝18.8,11.9Hz,6H),1.22(d,J＝6.0Hz,1H),1.00–0.73(m,3H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.47,158.12,157.39,146.80,146.57,146.28,144.79,135.56,131.30,118.72,118.65,117.80,111.94,111.75,77.29,77.03,76.78,71.84,49.94,44.12,40.04,38.37,34.06,31.76,26.48,20.68。

实施例3：7-6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-布雷菲德菌素A甲酸单酯(Ⅰ-4)和4’7-6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-布雷菲德菌素A甲酸双酯(Ⅰ-5)的制备

反应式如下：

称取布雷菲德菌素A(Ⅱ)(1eq，0.3mmol，84mg)，溶于20mL无水二氯甲烷制成式(Ⅱ)溶液，取6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-甲酸(Ⅲ-3)(4eq，1.2mmol，0.3834g)溶于20ml无水二氯甲烷中制成式(Ⅲ-3)溶液，并将式(Ⅲ-3)溶液缓慢加入式(Ⅱ)溶液中，再依次加入EDC·HCl(4eq，1.2mmol，0.230g)和DMAP(3.3eq，1mmol，0.122g)，通氮气，于44℃条件下微波反应7h，微波功率为150W，反应过程中以薄层层析检测反应是否完全(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)。反应结束后，向反应液加入20ml水淬灭，再加入2×30ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×50ml，饱和NaCl水溶液洗涤2×50ml。收集有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2为展开剂，v/v)，收集Rf＝0.5的组分得到7-6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-布雷菲德菌素A甲酸单酯(Ⅰ-4)，收集Rf＝0.65的组分，得到4’7-6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-布雷菲德菌素A甲酸双酯(Ⅰ-5)。

7-6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-布雷菲德菌素A甲酸单酯(Ⅰ-4)(产率20％)：MS(ESI)m/z 582(M+H)⁺。

4’7-6-氯-2-(2,6-二氟苯基)喹啉-4-布雷菲德菌素A甲酸双酯(Ⅰ-5)(产率40％)：MS(ESI)m/z 883(M+H)⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.46–7.35(m,2H),7.27(d,J＝9.6Hz,3H),7.19–7.02(m,5H),5.73–5.62(m,2H),5.37(d,J＝10.2Hz,1H),5.25(s,1H),5.01(dd,J＝15.1,9.6Hz,1H),4.86(dd,J＝10.5,6.1Hz,1H),4.73(s,2H),4.64(s,2H),2.43(dd,J＝14.9,8.9Hz,1H),2.37–2.27(m,1H),2.03–1.78(m,5H),1.78–1.68(m,1H),1.64(d,J＝18.4Hz,5H),1.52(d,J＝12.2Hz,1H),1.26(t,J＝12.1Hz,4H),0.87(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ167.74,167.33,165.20,157.88,157.73,145.68,135.09,132.16,132.08,131.90,131.83,131.47,130.25,130.18,124.84,124.81,122.67,122.65,118.96,118.68,118.65,118.62,118.59,118.49,118.46,118.43,118.39,118.21,117.88,111.68,111.65,111.20,111.17,77.28,77.03,76.77,76.65,71.93,65.34,65.08,49.66,43.82,39.68,38.15,34.06,31.66,26.34,20.63。IRν_max(cm^-1):3727.07,2977.75,2926.95,2842.95，

1753.34,1701.37,1592.75,1494.33,1407.42,1329.30,1268.84,1249.88，1199.85,1173.91,1140.49,1100.79,1064.67,1014.62,846.10,741.6。

实施例4：7-布雷菲德菌素A-天然维生素E琥珀酸单酯(Ⅰ-6)和4’7-布雷菲德菌素A-天然维生素E琥珀酸双酯(Ⅰ-7)的制备

反应式如下：

称取布雷菲德菌素A(Ⅱ)(1eq，0.5mmol，140mg)溶于20mL无水二氯甲烷制成式(Ⅱ)溶液，取天然维生素E琥珀酸(Ⅲ-4)(4eq，2mmol，1.026g)溶于20ml无水二氯甲烷中制成式(Ⅲ-4)溶液，并将式(Ⅲ-4)溶液缓慢加入式(Ⅱ)溶液中，再依次加入EDC·HCl(4eq，2mmol，0.383g)和DMAP(2eq，1mmol，0.122g)，通氮气，于44℃条件下微波反应7h，微波功率为150W，反应过程中以薄层层析检测反应是否完全(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)。反应结束后，加入20ml水淬灭，再加入2×30ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×50ml，饱和NaCl水溶液洗涤2×50ml。收集有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v为展开剂)，收集Rf＝0.5的组分，得到7-布雷菲德菌素A-天然维生素E琥珀酸单酯(Ⅰ-6)，收集Rf＝0.65的组分，得到4’7-布雷菲德菌素A-天然维生素E琥珀酸双酯(Ⅰ-7)。

7-布雷菲德菌素A-天然维生素E琥珀酸单酯(Ⅰ-6)(产率10％)：MS(ESI)m/z 793(M+H)⁺。

4’7-布雷菲德菌素A-天然维生素E琥珀酸双酯(Ⅰ-7)(产率55％)：MS(ESI)m/z1306(M+H)⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(s,1H),5.72(d,J＝15.7Hz,2H),5.32(s,1H),5.18(d,J＝18.2Hz,2H),4.85(s,1H),2.95–2.89(m,3H),2.81(d,J＝7.9Hz,1H),2.71(s,2H),2.58(s,4H),2.44(s,1H),2.32(s,1H),2.17–1.92(m,22H),1.78(dd,J＝13.5,6.5Hz,7H),1.61(s,5H),1.56–1.46(m,7H),1.38(s,4H),1.33–1.19(m,26H),1.15(d,J＝6.8Hz,6H),1.07(s,7H),0.86(t,J＝7.7Hz,25H)。IRν_max(cm^-1):3849.82,2926.88,2866.64，1751.54,1718.94,1459.97，

1413.20,1377.22,1252.75,1143.28,1108.93,1077.61,1006.07,972.21。

实施例5各样品抗氧化活性的测定

(1)样品配制

分别称量样品BFA、Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-7、VE(维生素E)各3mg，将其溶于无水甲醇中，配制样品浓度为300μg/mL。分别进行清除DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力的测定、总还原力能力的测定、超氧自由基(O₂^-)清除率的测定以及清除ABTS自由基能力的测定。每个实验组都进行三组平行实验，取平均值。

(2)清除DPPH自由基能力的测定

测定过程中分为实验组、对照组、空白调零组。取1mmol/L的DPPH甲醇溶液200μL加入试管中，再加入800μL的甲醇进行稀释，制成浓度为0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液。实验组(OD值记为A_i)每试管加入2mL样品液与2mL、0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液；对照组(OD值记为A_j)每试管加入2mL样品液与2mL无水甲醇；空白调零组(OD值记为A₀)每试管加入2mL、0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液与2mL无水甲醇。25℃下避光反应60min，测定样品在紫外波长为517nm时的吸光度。

样品对DPPH自由基清除能力的计算公式为：

R％＝[1-((A_i-A_j)/A₀)]×100％

(3)总还原力能力的测定

测定过程仅需实验组即可。每试管中，2mL的样品液与2mL的0.2mol/L的pH＝6.6的PBS缓冲液以及2mL的质量浓度1％的铁氰化钾缓冲液混匀后，在50℃水浴中反应30min，再分别加入2mL的质量浓度10％的TCA溶液，3000rpm离心10min。取上清液2mL与2mL无水甲醇以及0.4mL质量浓度0.1％的FeCl₃水溶液混匀。避光反应10min，测定样品在紫外波长为700nm时的吸光度。OD₇₀₀值越大，说明其还原力即抗氧化能力越强。

(4)超氧自由基(O₂^-)清除率的测定

测定过程中分为实验组、对照组、空白调零组。取0.2mol/L的PBS缓冲液(用NaOH(1M)调pH到8.0)1mL，加入99mL的无水甲醇，定容稀释为2mmol/L，pH＝8.35，再取此缓冲液4.5mL加入每试管，在25℃即室温下预热20min。实验组(OD值记为A_x)每试管加入0.1mL样品液与0.4mL的25mmol/L邻苯三酚水溶液混匀；对照组(OD值记为A_i)每试管加入0.1mL样品液与0.4mL的无水甲醇混匀；空白调零组(OD值记为A₀)每试管加入0.1mL无水甲醇与0.4mL的25mmol/L邻苯三酚水溶液混匀；25℃下反应5min，每试管滴一滴浓盐酸(物质浓度：12mol/L)以终止反应。测定样品在紫外波长为325nm时的吸光度。

超氧自由基(O₂^-)清除率的计算公式为：

R％＝[(A₀-(A_x-A_i))/A₀]×100％

(5)清除ABTS自由基能力的测定

测定过程中分为实验组、对照组。5mL ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)试剂与过硫酸钾88μL避光反应12-16h后，使用PBS缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)将反应液稀释至其在紫外波长为734nm时的吸光度为0.70±0.02，获得ABTS自由基储备液，备用。实验组(OD值记为A_x)每试管加入1mL样品溶液和3mL ABTS自由基储备液；对照组(OD值记为A₀)每试管加入1mL无水甲醇和3mL ABTS自由基储备液。25℃下避光反应5min，测定样品在紫外波长为734nm时的吸光度。

样品对ABTS自由基清除能力的计算公式为：

R％＝[(A₀-A_x)/A₀]×100％

各实验结果见表1和表2。

表1各样品清除DPPH自由基能力测定与总还原力测定

注：1)*表示样品对DPPH自由基清除能力过小，无法计算；

2)清除DPPH自由基能力测定实验中A₀值为0.303。

从表1可以看出，化合物Ⅰ-5、Ⅰ-7对DPPH自由基具有较好的清除能力，其中化合物Ⅰ-7有较强的清除能力，且高于VE的清除率。

表2各样品清除超氧自由基(O₂^-)能力测定与ABTS自由基能力测定

注：清除超氧自由基(O₂^-)能力测定实验中A₀值为0.344。

从表2可以看出，化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-7对清除超氧自由基(O₂^-)能力较强，高于VE的清除能力。化合物Ⅰ-1、Ⅰ-7的清除ABTS自由基能力总体能力强，总还原力比VE高。化合Ⅰ-3、Ⅰ-5的总还原力比VE差。

实施例6各样品对细胞生长抑制能力的测定

(1)人肺癌(A549)细胞培养

培养条件：RPMI1640培养液+10％/牛血清，37℃，5％CO₂培养箱。

冻存条件：RPMI1640培养液+10％/胎牛血清+10％DMSO。

传代方法：细胞在培养瓶中生长到80-90％并仍为单层时进行传代。弃去旧液，向培养瓶中加入2mL PBS缓冲液(7.2±0.1)，清洗一下，弃掉，重复两次。加入消化液(0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA)1mL消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成3-5个抱团细胞后加入2mL培养液终止消化，吹打细胞至显微镜下呈单细胞状态，细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，RPMI1640培养液重悬细胞重复两次。培养液重悬细胞混匀后分装到T25培养瓶中，补加(RPMI1640培养液+10％/牛血清)培养液至4-5mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)中国仓鼠肺细胞(CHL)培养

培养条件：RPMI1640培养液+10％/牛血清，37℃，5％CO₂培养箱。

冻存条件：RPMI1640培养液+10％/胎牛血清+10％DMSO。

传代方法：细胞在培养瓶中生长到80-90％并仍为单层时进行传代。弃去旧液，向培养瓶中加入2mL PBS缓冲液(7.2±0.1)，清洗一下，弃掉，重复两次。加入消化液(0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA)1mL消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成3-5个抱团细胞后加入2mL培养液终止消化，吹打细胞至显微镜下呈单细胞状态，细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，RPMI1640培养液重悬细胞重复两次。培养液重悬细胞混匀后分装到T25培养瓶中，补加(RPMI1640培养液+10％/牛血清)培养液至4-5mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(3)抗肿瘤活性实验(MTT法)

A549细胞贴壁至T25瓶约90％时，经消化制成细胞悬浮液，均匀铺于96孔板，浓度为1.6-2×10⁴个/孔。实验设6个浓度梯度加药组，1个对照组，1个调零组，每组3个平行，对照组以助溶剂代替药物，调零组加同体积培养基，96孔板边缘加PBS缓冲液。细胞于37℃，5％CO₂培养箱培养24h，至细胞贴壁分裂生长至占瓶壁70-80％后，加药组分别加入终浓度2.5μM，1.875μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.15625μM的药物溶液200μL(所述药物溶液是将实施例1-4制备的化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-7分别用含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液溶解制成)，对照组加入含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液200μL，调零组则加入200μL的RPMI1640培养液；于37℃、5％CO₂培养箱培养24h。加药组，对照组和调零组分别加入20μL MTT(5mg/mL，PBS现配过膜使用)作用4h，小心吸出培养液，再分别加200μLDMSO，平板振荡器摇匀10min左右至沉淀充分溶解；使用酶标仪于570nm处测量吸光度，计算各自的抑制率，利用SPSS20.0软件计算IC50值。

(4)抗肿瘤活性对照实验(MTT法)

CHL细胞贴壁至T25瓶约90％时，经消化制成细胞悬浮液，均匀铺于96孔板，浓度为1.6-2×10⁴个/孔。实验设6个浓度梯度加药组，1个对照组，1个调零组，每组3个平行，对照组以助溶剂代替药物，调零组加同体积培养基，96孔板边缘加PBS缓冲液。细胞于37℃，5％CO₂培养箱培养24h，至细胞贴壁分裂生长至占瓶壁70-80％后，加药组分别加入终浓度为2.5μM，1.875μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.15625μM的药物溶液200μL(所述药物溶液是将实施例1-4制备的化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-7分别用含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液溶解配制而成)，对照组加入含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液200μL，调零组则加入RPMI1640培养液200μL，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h。加药组，对照组和调零组分别加入20μL MTT(5mg/mL，PBS现配过膜使用)作用4h，小心吸出培养液，再分别加200μLDMSO，平板振荡器摇匀10min左右至沉淀充分溶解；使用酶标仪于570nm处测量吸光度，计算各自的抑制率，利用SPSS20.0软件计算IC50值。

样品实验结果见表3。

表3 BFA硒酯类衍生化合物的对A549和CHL细胞抑制活性

注：1)、SI＝IC50(A549)/IC50(CHL)，SI越小，药物对肿瘤细胞的选择性越高。

如表3所示，BFA双酯类衍生物对A549细胞表现出抗肿瘤活性，其中单酯化合物Ⅰ-1、Ⅰ-5活性最好，相比于BFA本身活性略有下降；双酯化合物Ⅰ-3的活性比BFA本身活性有所下降，侧链R基团含有杂环的BFA衍生物呈现抗肿瘤活性能力下降。除却化合物Ⅰ-7，BFA双酯类衍生物对A549细胞的抑制性远远大于CHL细胞抑制性，这种选择性对比与BFA本身都有一定的提高。

化合物Ⅰ-7在抗肿瘤活性和选择性都下降可能的原因是化合物因结构较大能透过细胞膜发挥抗肿瘤作用的化合物量较少。

布雷菲德菌素A酯类衍生物及其制备与应用专利购买费用说明

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