专利摘要

本发明公开了具有抗惊厥活性和抗心肌细胞缺氧活性的异海松烷型二萜化合物。该化合物从琥珀分离得到，结构式如下。斑马鱼惊厥模型实验表明，本发明提供的异海松烷型二萜化合物具有抗惊厥的作用；体外抗缺氧损伤活性表明，本发明提供的异海松烷型二萜化合物具有保护心肌细胞抗缺氧的能力。

权利要求

1.具有抗惊厥活性和保护心肌细胞抗缺氧活性的异海松烷型二萜化合物，其特征在于，其结构式为:

2.一种治疗癫痫、惊厥疾病和心血管疾病药物，其特征在于，包括权利要求1所述的异海松烷型二萜化合物或其盐。

3.根据权利要求2所述的治疗癫痫、惊厥疾病和心血管疾病药物，其特征在于，所述的药物剂型为喷雾剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂。

4.权利要求1所述的异海松烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取琥珀，粉碎后以乙酸乙酯提取，提取液浓缩，得到乙酸乙酯部位；

(2)取步骤(1)的乙酸乙酯部位采用AB-8大孔树脂柱色谱分离，先以50％甲醇溶液洗脱，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，回收甲醇后得甲醇洗脱部位；

(3)取步骤(2)得到的甲醇洗脱部位，用乙腈溶解，采用高压制备液相分离得到异海松烷型二萜化合物；所述的高压制备液相分离条件为：SEPAX GP-C18，规格10×250mm,5μm色谱柱，40％乙腈等度洗脱，流速3mL/min，检测波长227nm。

5.根据权利要求4所述的异海松烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)提取方法为冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法或回流提取法。

6.权利要求1所述的异海松烷型二萜化合物在制备抗癫痫、抗惊厥药物中的应用。

7.权利要求1所述的异海松烷型二萜化合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病为心绞痛、心肌梗塞、心肌缺血、心力衰竭以及心律失常。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种异海松烷型二萜化合物及其在制备治疗惊厥及心血管疾病药物方面的应用。

背景技术

在公元前2000年,已有关于癫痫的记载，在不同人类文明的发作史中也均有癫痫的记载。作为神经系统疾病中的常见病之一，癫痫在神经系统疾病中发病率仅次于脑血管疾病。全球约有7000万癫痫患者，癫痫疾病的发生不仅会引起健康问题，使患者整体健康状况低下、智能及身体机能受损、发生意外及受伤的风险较高，而且伴随癫痫产生的情绪、家庭、职业等一系列社会心理问题，对患者的整体生活质量造成巨大影响。此外，癫痫直接医疗花费以及因生活质量和生产工作能力丧失而导致的间接花费巨大，造成了较为沉重的财政负担。

心血管疾病，又称为循环系统疾病，是指循环系统的一系列疾病；循环系统指人体内运送血液的器官和组织，主要包括心脏、血管(动脉、静脉、微血管)，可以细分为急性和慢性，一般均与动脉粥样硬化有关。最常见的心血管疾病有心律失常、心肌缺血、心绞痛、心肌梗死等。心血管疾病是人类最主要的死亡原因之一，也是消耗巨大医疗资源的疾病之一。全球每年死于心血管疾病的人数约有1700万。中国心血管病患病率处于持续上升阶段，《中国心血管病报告2017》推算心血管疾病现患病人数2.9亿，其中脑卒中1300万人，冠心病1100万人，高血压2.7亿人。

琥珀系古代松科松属植物的树脂埋藏在地下经久年转化而成的树脂化石。主要有镇静安神，活血散瘀，利尿通淋的作用。用于心悸失眠，惊风抽搐，癫痫，小便不利，尿血，尿痛。据本草纲目记载：气味甘平、无毒。主治安五脏，定魂魄，杀精魅邪鬼，消瘀血，通五淋、壮心，明目磨翳，止心痛癫邪，疗蛊毒，破结瘕，治产后血枕痛，止血生肌。主治补心安神，破血生肌，治妇人症瘕，小儿带之辟恶，磨滴目翳赤障。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题提供一种异海松烷型二萜新化合物，本通过大量实验筛选出其在治疗惊厥及心血管疾病药物方面的应用，本发明另外一个目的是提供其制备方法。

技术方案，为解决以上的技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种异海松烷型二萜化合物，其具有下式(1)所示的结构：

本发明的另一技术方案是：一种治疗惊厥及心血管疾病药物，该药物包括式(1)所示的异海松烷型二萜化合物或其盐。

优选的，一种药物制剂，其为式(1)所示的异海松烷型二萜化合物与药学上可接受的药用辅料制成临床适用的喷雾剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或注射剂等。

异海松烷型二萜在制备抗惊厥药物的用途，所述神经性疾病包括惊厥、癫痫。

异海松烷型二萜在制备治疗心血管疾病药物的用途，所述心血管疾病包括心绞痛、心肌梗塞、心肌缺血、心力衰竭以及心律失常。特别优选心血管疾病为心肌缺血。

本发明提供的异海松烷型二萜化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)取琥珀，粉碎后以乙酸乙酯提取，提取液浓缩，得到乙酸乙酯部位；

(2)取步骤(1)的乙酸乙酯部位采用AB-8大孔树脂柱色谱分离，先以50％甲醇溶液洗脱，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，回收甲醇后得甲醇洗脱部位；

(3)取步骤(2)得到的甲醇洗脱部位，用乙腈溶解，采用高压制备液相分离得到异海松烷型二萜化合物。

作为优选方案，本发明提供的异海松烷型二萜化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)取琥珀100g，粉碎后以10倍量的乙酸乙酯提取两次，每次2小时，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位；

(2)取步骤(1)的乙酸乙酯部位采用AB-8大孔树脂柱层析，先以50％甲醇溶液洗脱3个柱体积，再用甲醇洗脱5个体积，收集甲醇洗脱部位，回收甲醇后得甲醇部位；

(3)取步骤(2)得到的甲醇部位用体积浓度40％乙腈溶解，采用高压制备液相分离得到异海松烷型二萜化合物。

作为优选所述的高压制备条件为：SEPAX GP-C₁₈(10×250mm,5μm)色谱柱，40％乙腈等度洗脱，流速3mL/min，检测波长227nm。

以上制备方法中，步骤(1)提取方法可以是冷浸、渗漉、微波提取、超声提取、回流提取等。

有益效果：

本发明通过对琥珀药材化学成分进行系统深入研究，经过波谱、质谱和x单晶衍射分析表明从琥珀药材中分离得到一个异海松烷型二萜，经检索其为新化合物。

且经过体内和体外活性研究表明，本发明提供的异海松烷型二萜具有显著的抗癫痫和括惊厥作用，且对缺血性心肌细胞也具有很好的保护作用。

且经过毒性实验研究表明，本发明提供的具有抗癫痫及抗心肌缺血活性的异海松烷型二萜化合物毒性低，安全性好。

附图说明

图1是琥珀新酸的结构示意图。

图2是琥珀新酸的¹HNMR谱图。

图3是琥珀新酸的¹³C NMR谱图。

图4是琥珀新酸对戊四氮诱发的斑马鱼惊厥的抑制作用；图中A是缩短游泳距离，B是降低高速游泳比例。

图5是琥珀新酸增加H9C2抗缺氧能力。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1异海松烷型二萜化合物的制备，包括以下步骤：

(1)取琥珀100g，粉碎后以10倍量的乙酸乙酯提取两次，每次2小时，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位。

(2)取步骤(1)的乙酸乙酯部位，采用AB-8大孔树脂柱层析，先以50％甲醇溶液洗脱3个柱体积，再用甲醇洗脱5个体积，收集乙醇洗脱部位，浓缩；

(3)取步骤(2)的甲醇部位，用40％乙腈复溶，采用高压制备液相分离得到异海松烷型二萜化合物(命名为琥珀新酸)，结构式如图1。高压制备液相具体条件为：：SEPAX GP-C₁₈(10×250mm,5μm)色谱柱，40％乙腈等度洗脱，流速3mL/min，检测波长227nm。

琥珀新酸的结构解析：针状结晶(乙腈)。紫外光谱在λmax 227nm处有特征吸收。HR-ESI-MS m/z:353.2153[M+H]⁺(calcd for C₂₀H₃₃O₃S⁺，353.2150；Δ＝0.85ppm)，Ω＝6。

如图2，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)谱显示高场区三个甲基信号δ_ppm 1.10(3H,s,H-17)，1.08(3H,s,H-19)，0.86(3H,s,H-20)；

如图3，¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)谱和DEPT谱信息揭示化合物含有20个碳，其中包括3个甲基碳：δ_ppm23.1(C-17)，16.8(C-19)和0.86(C-20)；8个亚甲基碳δ_ppm 37.9(C-1)，17.6(C-2)，23.8(C-6)，33.2(C-7)，19.7(C-11)，32.0(C-12)，40.4(C-15)和48.5(C-16)；5个次甲基碳δ_ppm 46.3(C-4)，48.9(C-5)，32.6(C-8)，51.1(C-9)和84.2(C-14)；3个季碳：δ_ppm44.80(C-4)，35.8(C-10)和42.6(C-13)；1个羰基碳：δ_ppm 180.4(C-18)以及一个亚硫酰基。

X单晶衍射：

在BrukerAPEX-II CCD衍射仪上，使用经过石墨单色器单色化的MoKα射线(wavelengthλ＝0.71073A)作为入射辐射。在2.01<θ<27.50deg.范围内，以w-20扫描方式，在296(2)K下共采集18426个反射点，其中4482个为独立可观测点[I>2\s(I)]，R(int)＝0.0305，全部强度数据均用SADABS程序校正。该晶体属于正交晶系，空间群为Pnma，a＝11.2366(8)，b＝11.4228(8)，c＝14.8442(10)，α＝90deg.，β＝90deg.，γ＝90deg.，V＝1905.3(2)，Z＝4，Dc＝1.229Mg/m³。晶体结构由直接法(SHELXL-97)解出，经多轮Fourier合成获得全部非氢原子，氢原子由理论计算后直接加氢而得。全部非氢原子坐标及各项异性热参数采用全矩阵最小二乘法修正至收敛。最终的偏离因子为R＝0.0287，wR＝0.0800。分子结构图利用SHELXl-97程序包绘制。

实施例2斑马鱼抗惊厥实验

AB品系斑马鱼，实验分组及给药分为6组：对照组(Control)、模型组(戊四氮干预)、阳性药组(苯巴比妥，PB)、实施例1制备得到的琥珀新酸化合物高、中、底3个浓度(10、5、1μM)剂量组，每组10条4-7dpf幼鱼，各药物组均先给药物72小时候，再加6mM戊四氮干预10分钟，然后采集10分钟的录像，利用Matlab 2018a自编程序进行进行图像处理，统计总游泳距离，速度，游泳区域分布等信息。

统计学方法：计算数据资料以 表示，应用SPSS统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用T检验，检验水准为p＝0.05。

如图4所示：图4A琥珀新酸在5μM、10μM的剂量下可以显著缩短斑马鱼的游泳总距离，图4B能显著降低斑马鱼高速游泳的比例。(对照组Control、模型组model、阳性药组PB、琥珀新酸化合物低剂量组C₃N₁-1μM、琥珀新酸化合物中剂量组C₃N₁-5μM、琥珀新酸化合物高剂量组C₃N₁-10μM)

以上实验结果表明本发明分离得到的新化合物琥珀新酸具有很好的抗惊厥的作用。

实施例3抗心肌细胞H9C2缺氧实验

选取大鼠心肌细胞(H9C2)。实验分组及给药分为8组：空白组、模型组(600μmCoCl₂干预)、实施例1制备得到的琥珀新酸化合物6个浓度(50、15、5、1.5、0.5、0.15μm)剂量组。各药物组均先给药物48小时候，再加CoCl₂干预24h。通过MTT法检测细胞活性。

统计学方法：计算数据资料以表示，应用SPSS统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用T检验，检验水准为p＝0.05。

如图5实验结果：琥珀新酸化合物的5～50μM浓度可以提高大鼠心肌细胞H9C2缺氧情况下的存活率。特别是浓度为015μM时可以显著提高大鼠心肌细胞H9C2缺氧情况下的存活率。P<0.05。

以上实验结果表明本发明分离得到的琥珀新酸具有保护心肌细胞的作用。

一种异海松烷型二萜化合物及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。