专利摘要

本发明提供一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，采用如下步骤：（1）制备藻液：培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；（2）积累虾青素：先将西红柿洗净、消毒，在无菌环境下去皮，加等质量无菌水匀浆，用四层灭菌纱布除去碎渣，10000r/min离心10min，取上清制成母液。将母液添加到已培养好的藻液中至西红柿汁最终含量为0.025±0.005L/L藻液；然后将藻液在28±2℃、光强4800±200lx、光暗比为24h/0h及营养盐饥饿的复合胁迫条件下培养18±1d。本发明简单易行、成本低廉、环保安全、能大幅提高虾青素产量，从而显著提高雨生红球藻生产虾青素的效率。

权利要求

1.一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于采用如下步骤：

(1)制备藻液：培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；

(2)积累虾青素：先将西红柿洗净、表面消毒，在无菌环境下去皮，加等质量无菌水匀浆，用四层灭菌纱布除去碎渣，10000r/min离心10min，取上清制成待用西红柿汁母液；将西红柿汁母液添加到上述已培养好的藻液中至西红柿汁最终含量为0.025±0.005L/L藻液；然后将上述添加了西红柿汁的藻液与空白对照组藻液同时在28±2℃、光强4800±200lx、光暗比为24h/0h及营养盐饥饿的复合胁迫条件下培养18±1d。

2.根据权利要求1所述的一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：步骤(1)中，采用BBM培养基，在温度20±2℃，光强1800±200lx，光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，此时细胞浓度达2.85×105个/mL。

3.根据权利要求1所述的一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：西红柿汁来自于市场上销售的普通西红柿。

4.根据权利要求1所述的一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：雨生红球藻采用712藻株。

说明书

技术领域

本发明提供一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，属于生物技术领域。

背景技术

天然虾青素（3，3'-二羟基-4，4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素，C40H52O4）是一种具有极强着色和抗氧化作用的红色类胡萝卜素，它在医药、化妆品、食品及养殖工业中有广泛应用（Guerin M et al, 2003）。与其它类胡萝卜素一样，它有一个很长的共轭双键，但该双键末端还含有不饱和的α-羟基酮，这种结构使得虾青素比普通类胡萝卜素具有一些特殊的生理功能（Kamath et al, 2008）。主要体现在两个方面：首先，具有超强的抗氧化活性。有研究显示虾青素抗氧化活性显著高于β-类胡萝卜素（10倍以上）、玉米黄素、角黄质、维生素C和维生素E（550倍）等常见抗氧化物质；其次，大量研究表明，虾青素能大幅提高人和动物的免疫力，还能防治癌症，有被开发成为抗肿瘤药物的潜能（Hussein et al, 2005）。对天然虾青素生物学功能和药理药效研究表明它是安全健康的天然色素，在日本、美国、欧盟、加拿大已被批准为安全的人类食品添加剂，用于食品的着色、保鲜、营养补充及用作珍贵鱼类和甲壳类动物和家禽的饲料添加剂（Hussein et al, 2006）。

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）在多种胁迫条件下，如强光、高温、营养盐（氮、磷）饥饿、高盐等，能够迅速合成并大量积累虾青素，其积累量最高可达藻细胞干重的4.0%，远远高于从水产品废弃物（虾蟹等甲壳）提取和利用红发夫酵母（Phaffia rhodoxyma）发酵生产虾青素的产量（0.15%—0.4%），因此被公认是目前自然界中生产天然虾青素最理想的工具（Boussiba, 2000）。

过去关于刺激雨生红球藻积累虾青素的诱导因子研究大多集中在物理因子和化学因子。添加含有虾青素前体的天然生物质诱导雨生红球藻高效合成虾青素的应用还未见报道，同上述诱导因子相比较，含有虾青素前体的天然生物质具有制备简单、效益高、无毒无激素类物质残留等优势。西红柿（Lycopersicon esculentum Mill）别名番茄、洋柿子，是全世界栽培最为普遍的果菜之一，富含大量的番茄红素（Lycopene），分子式为C40 H56 ，是由11个共轭及两个非共轭碳- 碳双键组成的高度不饱和直链型碳氢化合物。这一过程中有两分子的β-紫罗酮生成，其在细胞膜上经番茄红素环化酶催化环化生成β-类胡萝卜素，是形成天然虾青素的前体物质。这个过程可由两条路径产生：一条是β-胡萝卜素经羟基化反应在 C-3，3'位形成β-隐黄质和玉米黄素两种中间产物，C-4再氧化形成3-二羟基-2-酮-β-胡萝卜素，进一步氧化形成虾青素；另一条路径是β-胡萝卜素在 C-4,4'位经过氧化反应生成海胆酮和角黄质，以两种物质为中间产物，经过羟基化，形成4-二酮-3-羟基-β-胡萝卜素，进一步在C-3'羟基化位形成虾青素（Margalith et al, 1999）。

目前，国内已经有一些生产虾青素的相关专利技术，如宁波大学的“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”（200610154678.0）公开了一种大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及方法，整个培养装置由设置在固定架上的光生物反应器系统、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置组成，固定架上设置浮沉控制装置。中山大学的“光生物反应器促进雨生红球藻生长增殖及调控虾青素合成和积累的方法”（CN02134387.X），涉及几种可调控的全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器培养和促进雨生红球藻生长增殖及提高种群密度、调控细胞内次生代谢产物虾青素合成和积累的方法。“从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素和蛋白质的方法”（CN200510047267.7），主要是从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素，虽然能变废为宝，但是虾青素的提取效率较低。“产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法”（CN03105314.9），公开了一种产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法，该方法是在装有特定培养基的反应器内，同时接种包括雨生红球藻和包括红发夫酵母进行混合培养发酵生产虾青素。“一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法（CN02138827.X）公开了一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法，包括培养基配方、一步法生产工艺、培养基的循环使用和用二氧化碳调节培养液pH值诱导红球藻孢子的形成及虾青素积累的方法。DSMIP资产公司研究的“利用补料分批发酵法通过Phaffia rhodozyma制备虾青素”（CN1692159），在虾青素生产期，根据虾青素生产速率补充营养培养基，同时在整个发酵期中保持发酵培养液中的葡萄糖浓度为接近0g/L。上述相关专利技术虽然先进，但均涉及造价高昂的生物反应器等专业设施、对设备要求比较高、技术工艺比较复杂、操作繁琐、而且费用很高、产量没有保障、这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。但它们均未涉及利用造价低廉，来源广泛的含虾青素前体物的天然物质诱导雨生红球藻高效积累虾青素的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中存在的缺陷，技术工艺简单易行、廉价高效且能显著提高雨生红球藻生产虾青素的产量。利用添加纯天然的西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其具体的技术方案为：

添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于采用如下步骤：

（1）制备藻液：培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；

（2）积累虾青素：积累虾青素：先将西红柿洗净、表面消毒，在无菌环境下去皮，加等质量无菌水匀浆，用四层灭菌纱布除去碎渣，10000r/min 离心10min，取上清制成待用西红柿汁母液。将该母液添加到上述已培养好的藻液中至西红柿汁最终含量为0.025±0.005L/L藻液；然后将上述添加了西红柿汁的藻液与空白对照组藻液同时在28±2℃、光强4800±200lx、光暗比为24h /0h及营养盐饥饿的复合胁迫条件下培养18±1d。

所述的添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，步骤（1）中，采用BBM培养基（华汝成 1986），在温度20±2℃，光强1800±200lx，光暗比为12h /12h的条件下培养，日光灯下培养至培雨生红球藻细胞达到对数生长期，此时细胞浓度达2.85×105个/mL。

所述的添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，西红柿汁来自于市场上销售的普通西红柿。

本发明是一种较为理想的提高雨生红球藻中虾青素产量的方法。与现有技术相比，其优点是：本发明的原材料雨生红球藻细胞实验室可以按常规方法自行培养，采用“添加西红柿汁诱导与复合胁迫培养”相结合的方法，西红柿来源广泛且造价低廉，该工艺不仅简单易行，成本低廉，无毒无残留，而且能大幅提高雨生红球藻积累虾青素的产量，从而显著提高生产效率。结果表明添加0.025±0.005L/L藻液的西红柿汁处理组雨生红球藻细胞虾青素产量为5.40±0.18 mg/L，是空白对照组产量的2.93~3.09倍。

具体实施方式

实施例 1：

步骤1、制备藻液：采用BBM培养基（华汝成，1986），在温度19℃、2000lx光强、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达2.85×105个/mL，即获得诱导培养的藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：先将西红柿洗净、表面消毒，在无菌环境下去皮，加等质量无菌水匀浆，用四层灭菌纱布除去碎渣，10000r/min 离心10min，取上清制成待用西红柿母液。将西红柿汁母液添加到上述已培养好的藻液中至西红柿汁最终含量为0.030L/L；然后将上述添加了西红柿汁的藻液与空白对照组藻液同时在28℃、光强4900lx、光暗比为24h /0h及营养盐饥饿的复合胁迫条件下培养20d。

实施例 2：

步骤1、制备藻液：采用BBM培养基（华汝成，1986），在温度21℃、光强1800lx、光暗比为12h /12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达2.85×105个/mL，即获得诱导培养的藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：先将西红柿洗净、表面消毒，在无菌环境下去皮，加等质量无菌水匀浆，用四层灭菌纱布除去碎渣，10000r/min 离心10min，取上清制成待用西红柿母液。将西红柿汁母液添加到上述已培养好的藻液中至西红柿汁最终含量为0.029L/L；然后将上述添加了西红柿汁的藻液与空白对照组藻液同时在30℃、光强5000lx、光暗比为24h /0h及营养盐饥饿的复合胁迫条件下培养19d。

实施例 3：

步骤1、制备藻液：采用BBM培养基（华汝成，1986），在温度22℃、光强2000lx、光暗比为12h /12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达2.85×105个/mL，即获得诱导培养的藻液；

步骤2、先将西红柿洗净、表面消毒，在无菌环境下去皮，加等质量无菌水匀浆，用四层灭菌纱布除去碎渣，10000r/min 离心10min，取上清制成待用西红柿母液。将西红柿汁母液添加到上述已培养好的藻液中至西红柿汁最终含量为0.032L/L；然后将上述添加了西红柿汁的藻液与空白对照组藻液同时在27℃、光强4700lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿（诱导培养样过程中不添加营养盐，下同）的复合胁迫条件下进行培养18d。

采用以下方法对本发明中含有西红柿汁的藻液及空白对照组藻液定期进行显微观察，具体是每天取少量藻液样品在光学显微镜下观察藻细胞的颜色变化以及虾青素积累情况，在显微镜底下发现细胞完全变红时即可测定虾青素含量，测定步骤参照（Boussibaet al, 1991）具体如下：

①取对照和处理藻液各5ml，5000r/min离心5min，弃上清得到藻细胞沉淀；

②分别向两种藻细胞沉淀加入3mL含5%KOH和30%甲醇破坏叶绿素5min后，5000r/min离心收集沉淀；

③在收集的沉淀中分别加入3ml二甲亚砜，利用超声波破壁后（3次15 sec破壁/5sec间歇，输出功率40W），于70℃水浴中处理10min，抽提至藻体发白；

④然后10000r/min离心10min，分别取上清于492nm下测定OD值；

⑤按公式C（mg/L）= （4.5×A×Va）/Vb计算两种上清中的虾青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亚砜的体积，Vb表示藻液体积。

结果表明：添加0.025±0.005L/L西红柿汁处理组雨生红球藻细胞虾青素产量为5.40±0.18 mg/L，是空白对照组产量的2.93~3.09倍。说明添加西红柿汁处理组能大幅提高雨生红球藻积累虾青素的产量，从而显著提高生产效率。

一种添加西红柿汁诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。