专利摘要

本发明公开了一种提高γ‑氨基丁酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除大肠杆菌基因组上ADP‑L‑甘油‑D‑甘露‑庚糖‑6‑差向异构酶RfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，GABA产量达到0.6415g/L，是野生菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍；且重组菌WJW00发酵产物中，副产物有机酸的含量均降低，如发酵24h时，丙酮酸、乙酸、乳酸的含量相对于野生菌W3110分别降低65.1％、38.9％、56.6％。本发明提供了一种新的提高GABA合成的方法，对于进一步提高GABA的合成具有十分重大的意义。

权利要求

1.一种高效合成γ-氨基丁酸(GABA)的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD基因得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110或大肠杆菌DH5α。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。

5.根据权利要求4所述的方法，所述发酵具体是：将所述重组菌的种子液转接至发酵培养基，并加入卡那霉素和诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后进行发酵。

6.根据权利要求5所述的方法，所述种子液是将所述重组菌接种至LB培养基中，并添加卡那霉素，37℃培养至对数中期得到。

7.根据权利要求4所述的方法，所述发酵培养基的组成为：15-25g/L葡萄糖，15-20g/LNa2HPO4·12H2O，1-5g/L KH2PO4，0.2-0.8g/L NaCl，添加1-3mM MgSO4，0.1-0.3mM CaCl2，0-10mg/mL维生素B1。

8.根据权利要求7所述的方法，所述发酵培养基的组成具体为：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，10mg/mL维生素B1。

9.权利要求1～8任一所述方法在食品、药品制备或动物饲料领域的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药品制备是将生产得到的GABA用于制备可舒肝解虑、宁心安神、降血压或降低血糖的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高γ-氨基丁酸产量的方法，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是一种游离氨基酸，在食品、药品、动物饲料等方面有良好的应用价值和前景。GABA是人体中枢神经系统中一种抑制性神经递质，对神经元的活动及相互联系具有抑制性调控作用，可舒肝解虑、宁心安神、降血压、降低血糖等，对多种疾病有较好的疗效。在饲料中添加GABA对猪、牛、鸡等的养殖都有促进作用。在植物中，GABA与植物生长发育密切相关。为了满足多种需求，GABA的生产是必要的。微生物发酵法生产GABA和化学合成法相比，具有生产过程和产品的安全性好、环境友好的优点；和植物提取相比，具有产量高不受季节和地域限制的优点；因而利用微生物生产GABA是发酵工程领域近年来的一个研究热点。

目前生产GABA主要通过微生物合成法，添加谷氨酸或谷氨酸钠发酵生产，利用此工艺生产GABA的菌株主要有乳酸菌、霉菌、酵母和大肠杆菌。其中霉菌和酵母生产GABA产量很低，多以乳酸菌和大肠杆菌尤为常见，但是乳酸菌合成GABA需要添加大量的谷氨酸和谷氨酸钠才能实现，虽然以L-Glu和谷氨酸钠前体生物合成GABA的研究已经取得了较高的产量，但以葡萄糖等糖类物质为起始底物直接生产GABA的研究，有助于GABA合成成本的进一步降低；且反应pH为4.5-5.0(采用50％硫酸调节pH)，大量使用硫酸对发酵罐的耐腐蚀性和生产操作的安全性都提出很高要求；此外，乳酸菌的分子改造工具不成熟，很难实现进一步的改造。而大肠杆菌的基因工程手段和工具成熟，分子操作成熟、背景清晰，且可以利用葡萄糖直接发酵生产GABA。基因工程改造的大肠杆菌在发酵生产多种产品中表现出优良的特性，因而以大肠杆菌出发菌株构建可直接合成GABA的研究具有可操作性和应用前景。

目前改造野生大肠杆菌合成GABA，一般以其代谢改造途径出发。但是这些方法使得GABA产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高GABA合成的方法，对于进一步提高GABA的合成具有十分重大的意义。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，意外的发现rfaD基因的敲除可以显著改善大肠杆菌合成GABA的能力，GABA产量达到0.6415g/L，是野生对照菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成γ-氨基丁酸(GABA)的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD基因得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110或大肠杆菌DH5α。

在一种实施方式中，所述ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵具体是：将所述重组菌的种子液转接至发酵培养基，并加入卡那霉素和诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后进行发酵。

在一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种至LB培养基中，并添加卡那霉素，37℃培养至对数中期得到。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成为：15-25g/L葡萄糖，15-20g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1-5g/L KH₂PO₄，0.2-0.8g/L NaCl，添加1-3mM MgSO₄，0.1-0.3mM CaCl₂，0-10mg/mL维生素B1。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成具体为：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1。

本发明还提供所述方法在食品、药品制备或动物饲料领域的应用。

在一种实施方式中，所述药品制备是将生产得到的GABA用于制备可舒肝解虑、宁心安神、降血压或降低血糖的药物。

本发明的有益效果：

(1)本发明敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00后，利用WJW00进行发酵生产GABA，GABA产量达到0.6415g/L，是野生菌W3110(0.0135g/L)的47.52倍。

(2)重组菌WJW00发酵产物中，副产物有机酸的含量均降低，如发酵24h时，丙酮酸、乙酸、乳酸的含量相对于野生菌W3110分别降低65.1％、38.9％、56.6％。

(3)敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因得到重组菌WJW00，其外膜关键分子脂多糖(LPS)被改造为Kdo2-lipid A结构，重组菌WJW00中外膜关键分子的去除可以有效改善细胞特性，减少大肠杆菌某些外膜关键分子带来的安全隐患。

生物材料

野生型大肠杆菌W3110购买自ATCC，保藏编号为ATCC39936。

附图说明

图1：工程菌WJW00的构建。

图2：48小时发酵后W3110和WJW00细胞胞外氨基酸和GABA水平的比较；Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Asn，天冬酰胺；Ser，丝氨酸；Gln，谷氨酰胺；His，组氨酸；Gly，甘氨酸；Thr，苏氨酸；Arg，精氨酸；Ala，丙氨酸；GABA，γ-氨基丁酸；Tyr，酪氨酸；Cys，半胱氨酸；Val，缬氨酸；Met，蛋氨酸；Trp，色氨酸；Phe，苯丙氨酸；Ile，异亮氨酸；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸。

图3：发酵24小时和48小时后W3110和WJW00细胞中的乙酸，乳酸和丙酮酸水平。

具体实施方式

氨基酸的测定方法：

(1)样品制备

①对于每个时间点的样品，采取10000rpm离心20min，弃菌体，取1mL上清。

②按1:1的比例加入三氯乙酸溶液，放置在4℃冰箱过夜备用。沉淀蛋白。

③过夜三氯乙酸和上清混合样品在10000rpm离心20min，去除发酵液中蛋白残留，防止堵塞色谱柱。

④用注射器小心吸出上清，接上水相或有机相滤膜0.22μm过滤，去除尽量多的杂质，直接取出200μL注入带有内衬管的液相小瓶，盖上盖子密封备用。

(2)HPLC测定

高效液相色谱系统采用安捷伦1200/岛津Prominence LC-20A/沃特世e2696，检测器采用紫外检测器。色谱柱为碳-18柱，主要包括Diamonsil AAA柱/Hypersil ODS柱/Shim-pack VP-ODS C18柱/AdvanceBio AAA C18柱等。安捷伦1260和1200系统是四通道系统，A相为水相、B相为有机相、C相为纯水、D相为纯甲醇。A相成分为，无水乙酸钠4.52g，三乙胺200μl/L，四氢呋喃5mL/L；B相成分为无水乙酸钠4.52g/L，甲醇400mL，乙腈400mL。ABCD相连接系统前均需超声除气，待基线平稳后再跑样，需要每次跑液相之前检查氘灯。ABCD相配制后需要使用有机膜或水相膜抽滤2次后并超声后方可使用，压力设定为0.1帕。色谱柱温度设置为40℃。具体液相进样程序和梯度洗脱程序见表1和表2。

表1柱前衍生程序设置

表2洗脱程序设置线性梯度的方法

实施例1工程菌WJW00的构建

工程菌WJW00已经在SCI论文《Construction and Characterization of anEscherichia coli Mutant Producing Kdo₂-Lipid A》中公开(公开日：2014年3月13日)。具体构建过程如下：

(1)rfaD基因敲除片段的获得

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得rfaD基因敲除片段，其两端为rfaD基因上下游同源臂、中间为带有FRT位点的kan片段。rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。将rfaD基因敲除片段克隆到质粒pBlueScriptIISK(+)，获得重组质粒pBlueScript IISK(+)-rfaDU-Fkan-rfaDD。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段rfaDU-Fkan-rfaDD。

(2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46(DatsenkoKA,Wanner BL.One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌W3110(ATCC39936)于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。

将500-1000ng的rfaD敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证，将得到的菌株命名为WJW00-Fkan。

(3)突变株抗性标记的去除

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110△rfaD::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pCP20质粒(CherepanovPP,WackernagelW.Genedisruption in Escherichia coli:Tc R and Km Rcassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.Gene,1995,158(1):9-14)，42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Flp重组酶的表达，介导FRT位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。结果见图1，在大肠杆菌WJW00，WJW00-Fkan和W3110染色体中rfaD区域周围扩增的DNA片段大小分别为552，1854和889bp。

将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，对两种抗生素均敏感的菌株即为E.coli W3110△rfaD，将其命名为WJW00并保藏。

实施例2工程菌WJW00发酵生产GABA

LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L。

M9G培养基：20g/L葡萄糖(Glucose)，17.1g/L十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，3g/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.5g/L氯化钠(NaCl)，添加1mM硫酸镁(MgSO₄)，0.1mM氯化钙(CaCl₂)，10mg/mL维生素B1(VB₁)。

(1)种子液培养

分别挑取野生菌W3110和实施例1中构建得到的工程菌WJW00环菌苔至25mL LB培养基中，并添加30μg/mL卡那霉素，37℃、200rpm培养5h至对数中期。

(2)发酵合成GABA

培养方法：将种子液(OD₆₀₀＝1.8左右)按照初始OD₆₀₀＝0.25转接至发酵培养基M9G，并加入卡那霉素使其终浓度为30μg/mL，37℃、200rpm，发酵48h。

结果表明：工程菌WJW00所合成氨基酸中较W3110变化最大的为GABA，提高46.5倍，达到0.6415g/L，在不引入强化GABA合成途径的条件下其产量已经较高了。rfaD基因的敲除对其他氨基酸的合成也有一些影响，其中丙氨酸Ala降低87％，Ala在多数氨基酸发酵时为副产物，因此Ala的降低有利于GABA的合成；其中谷氨酰胺Gln和亮氨酸Leu分别提高3.9和2.8倍，说明在大肠杆菌W3110中敲除rfaD基因也可促进Gln和Leu的合成；其他氨基酸变化较小。最终数据表明rfaD基因的敲除可以有效提高GABA的合成，但并没有使得所有氨基酸合成提高。

同时，测定有机酸发现，工程菌WJW00的丙酮酸、乙酸和乳酸均有所降低，发酵24h后，三者分别降低65.1％，38.9％和56.6％。

表3工程菌WJW00发酵生产GABA

表4工程菌WJW00发酵生产GABA的副产物有机酸的含量

实施例3改造其它大肠杆菌发酵生产GABA

(1)工程菌WJD00的构建

参照与实施例1中工程菌WJW00的构建方法，敲除大肠杆菌DH5α中rfaD基因，获得rfaD突变株WJD00。

(2)菌株发酵生产GABA

参照实施例2相同的发酵方法，将步骤(1)中得到的重组菌进行发酵生产GABA。对重组菌株的摇瓶发酵进行发酵参数测定。

结果表明：工程菌WJD00的GABA较野生菌DH5α提高1.6倍，达到0.454g/L。rfaD基因的敲除对其他氨基酸的合成也有一些影响，其中丙氨酸Ala降低74.7％，Ala在多数氨基酸发酵时为副产物，因此Ala的降低有利于GABA的合成；其中半胱氨酸Cys-s提高134倍，蛋氨酸提高10倍，赖氨酸提高17.9倍，说明在大肠杆菌DH5α中敲除rfaD基因也可促进Gln和Leu的合成；其他氨基酸变化较小。最终数据表明rfaD基因的敲除可以有效提高GABA的合成，但并没有使得所有氨基酸合成提高。

表5敲除大肠杆菌DH5α中rfaD基因对发酵生产GABA的影响

虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高γ-氨基丁酸产量的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ile Ile Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val

1 5 10 15

Lys Ala Leu Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asp Ile Leu Val Val Asp Asn

20 25 30

Leu Lys Asp Gly Thr Lys Phe Val Asn Leu Val Asp Leu Asn Ile Ala

35 40 45

Asp Tyr Met Asp Lys Glu Asp Phe Leu Ile Gln Ile Met Ala Gly Glu

50 55 60

Glu Phe Gly Asp Val Glu Ala Ile Phe His Glu Gly Ala Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Thr Glu Trp Asp Gly Lys Tyr Met Met Asp Asn Asn Tyr Gln Tyr

85 90 95

Ser Lys Glu Leu Leu His Tyr Cys Leu Glu Arg Glu Ile Pro Phe Leu

100 105 110

Tyr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Tyr Gly Gly Arg Thr Ser Asp Phe Ile

115 120 125

Glu Ser Arg Glu Tyr Glu Lys Pro Leu Asn Val Tyr Gly Tyr Ser Lys

130 135 140

Phe Leu Phe Asp Glu Tyr Val Arg Gln Ile Leu Pro Glu Ala Asn Ser

145 150 155 160

Gln Ile Val Gly Phe Arg Tyr Phe Asn Val Tyr Gly Pro Arg Glu Gly

165 170 175

His Lys Gly Ser Met Ala Ser Val Ala Phe His Leu Asn Thr Gln Leu

180 185 190

Asn Asn Gly Glu Ser Pro Lys Leu Phe Glu Gly Ser Glu Asn Phe Lys

195 200 205

Arg Asp Phe Val Tyr Val Gly Asp Val Ala Asp Val Asn Leu Trp Phe

210 215 220

Leu Glu Asn Gly Val Ser Gly Ile Phe Asn Leu Gly Thr Gly Arg Ala

225 230 235 240

Glu Ser Phe Gln Ala Val Ala Asp Ala Thr Leu Ala Tyr His Lys Lys

245 250 255

Gly Gln Ile Glu Tyr Ile Pro Phe Pro Asp Lys Leu Lys Gly Arg Tyr

260 265 270

Gln Ala Phe Thr Gln Ala Asp Leu Thr Asn Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

275 280 285

Asp Lys Pro Phe Lys Thr Val Ala Glu Gly Val Thr Glu Tyr Met Ala

290 295 300

Trp Leu Asn Arg Asp Ala

305 310

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt 60

gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg 120

tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat 180

tccgcacgac cagtaccgag attgaagatg ccggaaacgc cattttccag gaaccacaga 240

ttcacatcag ccacgaattc gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 300

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa 360

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc 420

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct 480

gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt 540

ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg 600

gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt 660

ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat 720

gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 780

catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 840

ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag 900

ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt 960

cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 1020

gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 1080

gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 1140

acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg 1200

gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag 1260

ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa 1320

gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc 1380

agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc 1440

gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct 1500

ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg 1560

gaattaattc tcatgtttga cagcttatca ctgatcagtg aattaatggc aagctttact 1620

tgccgtccca ctcggtggtg gaagagcacg cgccttcgtg gaaaatcgct tcgacatcgc 1680

cgaactcttc gccagccata atctggatca ggaagtcttc cttatccata tagtctgcga 1740

tattcagatc caccaggttc acaaacttgg tgccgtcttt caggttgtcc accaccagaa 1800

tatcggtgat gcctttatca ttcagggctt taacgatgtt gctgccgata aagc 1854

一种提高γ-氨基丁酸产量的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。