专利摘要

本发明公开了一株壁芽孢杆菌G1及其制备方法和应用，该菌株保藏编号为CGMCCNo.10189，于2014年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；旨在提供一株兼具高效解磷、产生长素、产氨功能，能有效促进种子发芽，促进植物生长的G1菌；属于微生物菌种技术领域。 CGMCCNo.10189 20141217

权利要求

1.一株壁芽孢杆菌G1，保藏编号CGMCC No.10189，于2014年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述壁芽孢杆菌G1，其特征在于，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1，其特征在于，所述的壁芽孢杆菌G1是从广东省广州市火炉山土壤中分离纯化所得。

4.制备权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1的方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：

(1)分离

称取广东省广州市火炉山的土壤10.0g，放入装有80-100ml生理盐水的瓶中，振荡使细胞充分分散，静置，取10ml上清液置于三角瓶中，88-91℃加热10-12分钟，取500μL水浴后上清液加入至30-35ml难溶无机磷培养基，进行富集培养，富集培养周期为5-7d，第一次富集培养结束后取500μL培养液各自加入到新的难溶无机磷培养基中进行第二次富集培养，两次富集培养结束后，取上清液置于离心管中，离心后再取上清液，测定上清液中水溶性磷含量，保留水溶性磷含量达30mg/L以上的培养液进行第三次富集，三次富集结束后采用同样的方法进行第四次富集培养，培养结束后测定培养液中水溶性磷含量，G1菌水溶性磷含量220.4μg/mL，采用甘油保藏法保存该菌株；

(2)纯化

将筛选出的G1菌利用平板划线法纯化后，保存于牛肉膏蛋白胨培养基所制斜面，置于4℃冰箱备用，经分子生物学鉴定和生理生化鉴定后，确定G1菌株为壁芽孢杆菌。

5.根据权利要求4所述的的壁芽孢杆菌G1的制备方法，其特征在于，所述的难溶无机磷培养基由下述组分构成：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，七水硫酸镁0.3g，磷酸钙10.0g，蒸馏水1000mL；pH 7.0-7.5。

6.权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1在分解难溶性磷方面的应用。

7.权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1在产生长素方面的应用。

8.权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1在产氨方面的应用。

9.权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1在促进植物种子发芽中方面的应用。

10.权利要求1所述的壁芽孢杆菌G1在促进植物生长方面的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一株具有土壤解磷、产生长素、产氨特征的壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1，本发明还涉及该壁芽孢杆菌G1的制备方法，及其在促进土壤磷有效性、小白菜种子发芽，生菜和玉米植株生长等方面的应用。

背景技术

磷是植物生长发育所必需的矿物质元素之一。利用溶磷微生物研制成生物肥或生物菌剂，对提高磷肥的有效性和土壤难溶磷的利用率、减少化学磷肥投入和农业可持续发展具有重要的意义。芽孢杆菌属(Bacillus)的产芽孢特性，具有较强的抵抗外界环境胁迫的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外线辐射所造成的伤害，从而易于定殖土壤而发挥田间肥效。因此，具有溶磷作用的芽孢杆菌在生物肥产业中具有巨大的应用前景。

目前溶磷芽孢杆菌，主要为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等菌株研究。譬如，张维娜等(2012)报道巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)JD-2具有较强降解有机磷、无机磷的能力，有效磷含量分别为对照组的25倍、22倍。许仁杰等(2003)报道施用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57后，冬小白菜的株高、根长、鲜重、干重、叶片中磷含量、及根系土壤中磷的含量均显著高于对照组。吴小芹等(2010)报道在卵磷脂液体培养下，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)JYZ-SD1的可溶性磷含量为1.94mg/L，是对照(0.37mg/L)的5.17倍，接种JYZ-SD1菌株150天后杨树扦插苗苗高和茎粗比CK分别增长了38.1％和15.9％。曹昱(2010)报道解磷枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GU施用后，香蕉产量增加了30.8％。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)GL-1施用后，玉米株高、叶片数、土壤速效磷含量分别比CK增加了4.8％、8.2％和60％(蔡燕飞等，2012)。这些成果显示了芽孢杆菌在土壤溶磷方面的潜力，为挖掘新型溶磷微生物资源打下了很好的工作基础和相关经验。近年来，一些研究者从自然环境中分离到壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)。研究发现，壁芽孢杆菌对壁画的生物腐蚀性有一定的影响(Pepe et al，2008)。另外，孟凡旭(2009)报道壁芽孢杆菌具有一定的嗜盐性。兰晓君等(2009)研究发现壁芽孢杆菌A1具有一定的耐镍性。付宝荣等(2013)分离筛选出一株具有高絮凝能力的壁芽孢杆菌。然而，目前尚未有壁芽孢杆菌在溶磷方面的报道，因此研究壁芽孢杆菌的磷溶能力对于发掘新型溶磷微生物资源具有非常重要的意义。

以往解磷微生物筛选多局限于单一功能菌株。王莉晶(2008)从农田土壤中分离得到解磷菌株，并将之应用于小麦幼苗。陈阳等(2008)从鄂尔多斯沙漠中几种典型固沙植物根际分离解磷菌，并研究其解磷能力。李振东等(2013)选择东祁连山高寒草地优势植物乳白香青为试验材料，分离和筛选内生解磷细菌，研究了其对玉米的促生作用。将产芽孢、解磷和促生等多功能组合是生物肥国内外研究的热点问题。已有研究表明一部分解磷菌除了释放土壤难溶性磷中的磷素，供植物吸收利用之外，还能够合成释放植物激素类物质，如细胞分裂素，生长素，赤霉素，促进植物根系有效地吸收土壤中的水分和养分，以促进植物的生长发育，同时对植物体其他生命活动进行调控(姚拓，2004)。还有一部分解磷菌具有产铁载体、氨、产氢氰酸以及产抗生素等促生能力(康贻军等，2010)。马文彬等(2014)，从植物根际分离出菌株Y16，该菌株兼具溶磷、固氮及分泌生长素性能，接种该菌株后可使箭筈豌豆地上生物量、地下生物量分别显著增加104.5％和254.1％。Hariprasad等(2009)从卡纳塔克邦地区番茄植株根际分离出具有产生长素和铁载体的解磷菌株P.putida PSRB6，对番茄种子的种子发芽实验表明，菌株PSRB6可显著促进番茄根长、苗长和发芽率，相比对照分别提高17.7％、10.2％、11.3％。温室条件下，接种菌株PSRB6后，番茄根长、鲜重、干重，土壤速效磷含量分别提高了22.2％、20.0％、112.9％、66.7％。而具有高效解磷和产生长素等多种功能的壁芽孢杆菌却未曾报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种兼具高效解磷、产生长素、产氨功能，能有效促进种子发芽，促进植物生长的壁芽孢杆菌G1，本发明还涉及该壁芽孢杆菌G1的制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现上述目的：

该壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1，简称G1菌。该菌株于2014年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号No.10189，分类命名：壁芽孢杆菌，(Bacillus muralis)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

进一步的，所述的G1菌是在广东省广州市火炉山土壤中分离纯化所得，属革兰氏阳性菌，具有一个内生芽孢；菌体为直杆状，常以成对或链状排列，好氧或兼性厌氧；接触酶试验、氧化酶试验、淀粉水解试验、蛋白酶试验、纤维素降解试验、吲哚试验、粉红色色素沉着、荧光色素阳性；甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、明胶液化试验阴性；在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，淡黄色，直径约为1-2mm，边缘不整齐，微凸，扁平湿润。

经过序列测定，该G1菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

G1菌的保藏方法，其保藏培养基的成分为葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水合硫酸亚铁0.03g，四水合硫酸锰0.03g，磷酸钙10g，酵母膏0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml或按照此比例配制成的培养基，pH值为pH 7.0-7.5，按常规菌种保藏温度保藏。

本发明的另外一个技术方案是提供该G1菌的制备方法，该方法依次包括下述步骤：

(1)分离

称取广东省广州市火炉山的土壤10.0g，放入装有80-100ml生理盐水的瓶中，振荡使细胞充分分散，静置，取10ml上清液置于三角瓶中，88-91℃加热10-12分钟，取500μL水浴后上清液加入至25-35ml难溶无机磷培养基，进行富集培养，富集培养周期为5-7d，第一次富集培养结束后取500μL培养液各自加入到新的难溶无机磷培养基中进行第二次富集培养，两次富集培养结束后，取上清液置于离心管中，离心后再取上清液，测定上清液中水溶性磷含量，保留水溶性磷含量达30mg/L以上的培养液进行第三次富集，三次富集结束后采用同样的方法进行第四次富集培养，培养结束后测定培养液中水溶性磷含量，G1菌水溶性磷含量220.4μg/mL，采用甘油保藏法保存该菌株；

(2)纯化

将筛选出的G1菌利用平板划线法纯化后，保存于牛肉膏蛋白胨培养基所制斜面，置于4℃冰箱备用，经分子生物学鉴定和生理生化鉴定后，确定G1菌株为壁芽孢杆菌。

进一步的，上述的的壁芽孢杆菌G1的制备方法，所述的难溶无机磷培养基由下述组分构成：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，七水硫酸镁0.3g，磷酸钙10.0g，蒸馏水1000mL；pH 7.0-7.5。

本发明的最后一个技术方案是提供该壁芽孢杆菌G1在分解难溶性磷、产生长素方面、产氨方面以及促进植物种子发芽中和促进植物生长中的应用

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

发明人经过大量实验研究，从广州市火炉山的土壤中筛选出一株壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1。此菌株兼具高效解磷、产生长素、产氨功能，能有效促进种子发芽，促进植物生长。

应用该菌株后，小白菜种子发芽率、第7天苗长、根长、鲜重与对照相比分别提高45.8％、44.7％、31.8％、30.4％、30.0％。生菜盆栽试验结果显示，每盆植株的磷、氮、钾累积量分别比对照增加39.6％、42.6％、23.5％，土壤有效磷含量比对照提高7.8％。玉米盆栽试验结果表明，玉米叶片中磷、氮、钾含量分别比对照提高18.5％、23.0％、10.8％，土壤有效磷含量比对照提高10.3％。田间小区试验中生菜干物质重量、玉米产量分别比对照增加了54.1％、12.5％。上述结果表明该菌株在提高土壤中难溶磷的有效性和磷肥利用率的同时，还可显著促进小白菜种子发芽及生菜和玉米植株的生长。

附图说明

图1.G1菌革兰氏染色显微照片，菌体被染成紫色；

图2.G1菌芽孢染色显微照片，菌体中椭圆形部分为芽孢；

图3.不同菌株在难溶无机磷培养基下产水溶性磷浓度的对比图；

图4.不同菌株在难溶无机磷培养基下产微生物磷浓度的对比图；

图5.不同菌株产生长素定量实验对比图；

图6.不同菌株产生长素定性实验对比图；

图7.G1菌株产氨实验照片；

图8.G1菌剂促进生菜生长盆栽试验照片；

图9.G1菌剂促进玉米生长盆栽试验照片；

图10.G1菌剂促进生菜生长田间小区试验照片；

图11.G1菌剂促进玉米生长田间小区试验照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1 菌株的分离、纯化

(1)分离

配制难溶无机磷培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，七水硫酸镁0.3g，磷酸钙10.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。

以广东省广州市火炉山的土壤为筛选土样，准确称取筛选土样10.0g，放入装有80-100ml(优选90ml)0.85％生理盐水的250ml三角瓶中(加玻璃珠10颗)，200r/min，摇床振荡30min，使细胞充分分散，静置20-30s，取10ml上清液置于50ml灭菌三角瓶中，88-91℃加热10-12分钟(优选90℃水浴加热10分钟)。取500μL水浴后上清液加入到难溶无机磷培养基(150ml三角瓶中含有30ml培养基)，每个土样设两个重复。置于摇床进行富集培养，转速150r/min，温度30℃。富集培养周期为5-7d，第一次富集培养结束后取500μL培养液各自加入到新的培养基中进行第二次富集培养。两次富集培养结束后，在超净工作台中用移液枪取上清液适量，置于离心管中，离心，取上清液，采用钼锑抗比色法测定上清液中水溶性磷含量，保留水溶性磷含量达30mg/L以上的培养液进行第三次富集。第三次富集结束后采用同样的方法进行第四次富集培养，培养结束后采用钼蓝比色法测定培养液中水溶性磷含量，采用甘油保藏法(培养液与50％甘油比例7:3，-80℃保存)保存水溶性磷含量较高的菌株。筛选出溶磷量较高的细菌菌株编号为C，G1，G2，Q1，Q2和S2，其中菌G1水溶性磷含量达220.4μg/mL。

(2)纯化

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，pH值7.0-7.2。

将筛选出的G1菌利用平板划线法纯化后，保存于上述保藏培养基所制斜面，置于4℃冰箱备用。经分子生物学鉴定和生理生化鉴定后，确定G1菌株为壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)。

实施例2 特性鉴定

(1)菌体形态特性

革兰氏阳性菌，有一个内生芽孢，菌体为直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端，具鞭毛，有运动性。菌体革兰氏染色显微照片见图1，芽孢染色照片见图2。

(2)菌落形态特性

在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，淡黄色，直径约为1-2mm，边缘不整齐，微凸，扁平湿润。

(3)生长特性

在酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，水1L的液体培养基中，转速150rpm，温度30℃，起始pH值为7.0的条件下，培养18小时，测得活菌数为1.97±0.08×10⁸cfu/ml。

(4)生理、生化特性，见表1。

(5)分子生物学特性

采用试剂盒法(购自上海生工生物工程有限公司)提取G1菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物F27(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，SEQ ID NO:2)和R1492(TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T，SEQ ID NO:3)，PCR扩增细菌的16S rDNA，50μL的PCR反应体系为：DNA模板1μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物1(l mM)1μL，引物2(l mM)1μL，10×PCR Buffer 5μL，MgCl2(25mM)3μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，ddH2O 34.5μL。

PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，进入热循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。

1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的长度和浓度，在1000bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后，测序由北京六合华大基因科技有限公司完成，将获得的DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)输入美国国立生物信息中心NCBI网页上进行BLAST比对，以Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明所述菌株的16S rDNA序列和与GenBank中壁芽孢杆菌具有较高的同源性，其相似度为99％。结合上述的菌体形态特性、平板菌落特征、生理生化特性、16SrDNA序列分析的结果，初步鉴定该菌株为壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)，命名为壁芽孢杆菌Bacillus muralis G1。

表1 G1菌生理生化特性

注：+表示为阳性；－表示为阴性；w表示为弱阳性；

实施例3 G1菌在难溶性无机磷培养基培养下产水溶性磷的效果实验

(1)培养基配制：

①难溶无机磷培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，七水硫酸镁0.3g，磷酸钙10.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5；

②LB液体培养基：酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0；

③LB固体培养基：酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

(2)待测液制备

挑取营养琼脂斜面培养基上G1菌体划线于LB固体培养基平板上，30℃下培养24h。将平板上G1菌体接入含有50ml LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，150r/min，摇床培养24h。将培养液6000r/min离心5min，用无菌水重悬菌体，在涡旋混合仪上扩散均匀，用移液枪将菌悬液等量接入含有50mL难溶无机磷培养基的250mL三角瓶，30℃，150r/min，摇床培养7d。

(3)水溶性磷含量测定

将培养液在10000g，4℃离心15min，取上清液，采用钼锑抗比色法测定水溶性磷含量。设不接G1菌，接入等量无菌水为对照，每个处理重复3次。水溶性磷含量变化(单位为μg/mL，即表示每毫升样品中所含水溶性磷的微克数)试验结果见图3。

图3的结果表明：G1菌的水溶性磷含量高达219.6μg/mL。G1菌具有较强的解磷能力。G1菌的水溶性磷含量虽略微低于G2菌，但综合菌株其它性能(产生长素，产氨能力、对植株效果等方面)，选择G1作为公布对象。

实施例4 G1菌在难溶性无机磷培养基培养下的产微生物磷的效果试验

将实施例3中离心后的沉淀用无菌水洗涤，10000g，4℃离心15min，弃去上清液，以除尽离心管中残留的水溶性磷。沉淀用溶菌液处理(5mg溶菌酶加入到1mL TEN溶液中)，置于数显恒温水浴锅，37℃水浴1h，期间轻轻摇动数次，以利于反应充分进行，然后4℃，10000g离心15min，取上清液，采用钼锑抗比色法测定微生物磷，每个处理重复3次。试验结果见图4。结果表明：G1菌的微生物磷含量高达70.7μg/mL。

实施例5 G1菌产生长素效果试验

(1)生长素定性测定：将G1菌接种于含有L-色氨酸(100μg/mL)的50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，150r/min摇床培养24h。取50μL培养液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液(35％HClO₄+1mL0.5mol/LFeCl₃)，设50μL的灭菌LB培养基作为阴性对照，10、20、50(μg/mL)生长素的比色液作为阳性对照。将白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30min后观察，颜色变红者表示能够产生长素。

(2)生长素定量测定：将G1菌接种于含有L-色氨酸(μg/mL)的50mL LB液体培养基中，三个重复，30℃，150r/min摇床培养24h。将培养液分别在8000×g下离心10min，取4mL上清液加入4mL Salkowski比色液，混匀，室温、黑暗中静置30min，使用紫外分光光度计，在530nm下测吸光度，同时用无菌培养基做相同处理作为对照，采用0、10、20、30、50(μg/mL)的生长素作标准曲线。试验结果见图5。G1菌产生长素量最高，达到7.1μg/mL。

实施例5 G1菌产氨效果试验

培养基：蛋白胨5g，蒸馏水1000ml，pH7.2，分装试管，121℃灭菌15min。

试剂(Nessler)：将20g碘化钾溶于50ml水中，并在此溶液中加碘化汞小粒至溶液饱和为止(约32g)此后再加460mL水和134g氢氧化钾，将上清液贮于暗色瓶中备用。

将G1菌适量接种于蛋白胨水培养基中，置室温培养3d，加入试剂数滴，观察是否出现黄褐色沉淀。试验结果见图6。结果表明：G1菌具有产氨功能。

实施例6 G1菌促进植物种子发芽实验室效果试验

(1)菌悬液制备：

①将菌种活化后点接入LB液体培养基，经过24h振荡培养，培养温度为30℃，转速为150r/min；所述液体培养基成分为：酵母提取物5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH7.0；

②将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液中菌体细胞浓度；

③将菌液于高速离心机中离心，转速6000r/min，离心5min；

④将菌体用灭菌的0.85％生理盐水重悬；

⑤用于浸泡小白菜种子的菌株浓度为2.0×10⁷cfu/ml的菌悬液。

(2)种子表面灭菌处理：种子用75％乙醇浸泡1min，再用2％次氯酸钠溶液浸泡2min，置于灭菌滤纸上自然晾干。

(3)采用G1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组采用25mLG1菌重悬液)，用G1表示，第2组采用25ml 0.85％生理盐水处理作为空白对照，用CK表示)。各处理组设四个重复，各重复含10颗小白菜种子(随机选取表面灭菌后大小均一的种子)。处理组G1采用菌悬液浸泡30min，CK采用30ml 0.85％生理盐水作同样处理。取灭菌培养皿，加入两层无菌滤纸，倒去浸泡液后，用无菌镊子夹取种子放入培养皿中，每皿10颗，再加盖一层无菌滤纸，以沁润保存水分，置于22℃培养箱培养7天，每天浇水适量，每皿的水量要相同，均匀，定期测定发芽率，苗长，鲜重等指标。试验结果表明，本发明分离的壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1能够显著促进小白菜种子发芽率、第三天苗长、第七天苗长、根长、鲜重与对照相比分别增加了45.8％、44.7％、31.8％、30.4％、30.0％。

表2 G1菌对小白菜种子发芽促进效果对比表

注：数据为4次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMR法)。

实施例7 G1菌促进盆栽生菜生长效果的试验

(1)菌悬液制备：

①将菌种活化后点接入LB液体培养基，经过24h振荡培养，培养温度为30℃，转速为150r/min；所述液体培养基成分为：酵母提取物5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH7.0；

②将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液中菌体细胞浓度；

③将菌液于高速离心机中离心，转速6000r/min，离心5min；

④将菌体用灭菌的0.85％生理盐水重悬；

⑤用于接种生菜的菌株浓度为3.0×10⁸cfu/ml的菌悬液。

(2)生菜育苗：

生菜水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在25℃培养箱内，待种子根长达到1-2mm时移至50孔育苗盆中，每孔1粒。每天浇水适量，待生菜苗长出3片叶子时，备用移苗。

(3)试验设计：

用G1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入G1菌3×10⁶cfu/g soil)，用G1表示，第2组加入0.85％生理盐水30ml作为空白对照，用CK表示)，每个处理组重复4次。各处理组每盆装土3.0kg，施用化学肥料尿素、磷酸钙、氯化钾，施用量分别为：50mg N kg^-1soil，25mg P₂O₅kg^-1soil，50mg K₂O kg^-1soil。

移苗之前，将肥料与土混合均匀，挑选长势大小均一的生菜苗移至盆中，移苗之后2天，浇施G1菌悬液，每天浇水适量，每盆的水量要相同，均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而误差。2013年12月28日测量生菜叶片数(包括长出的所有叶片)，叶绿素相对含量(SPAD):用便携式SPAD-502透射型叶绿素仪测定(测量植株第三片叶子3-4个点后取平均值)。2013年12月29日测量生菜主根长(生菜根部到主根尖端的长度)，茎叶干重，根干重(105℃杀青30min，75℃烘干至恒重)，结果表明(表3、4)：加入本发明分离的壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1能够显著促进土壤有效磷的释放(与对照相比提高7.8％)、提高生菜对土壤氮磷钾的吸收及干物质积累。

表3 G1菌剂对生菜植株的促生效果对比表

注：数据为4次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMR法)。下表相同。

表4 G1菌剂对土壤解磷的效果及对生菜的促生效果对比表

实施例8 G1菌促进玉米生长盆栽效果试验

(1)菌悬液制备：同生菜盆栽试验。

(2)玉米育苗：玉米水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，待种子根长达到2mm时移至50孔育苗盆中，每孔1粒。每天浇水适量，待玉米苗长至10cm时，准备移苗。

(3)试验设计：

采用G1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入G1菌3×10⁶cfu/g soil)，用G1表示，第2组加入0.85％生理盐水80ml作为空白对照，用CK表示)，每个处理组重复4次。各处理组每盆装土8.0kg，施用化学肥料尿素、磷酸钙、氯化钾，施用量分别为：50mg N kg^-1soil，25mg P₂O₅kg^-1soil，50mg K₂O kg^-1soil。移苗之前，将肥料与土混合均匀，当苗长至约10cm时，挑选大小均一玉米苗移至盆中，每盆4棵。移苗之后2天，浇施G1菌悬液，每天浇水适量，每盆的水量要相同，均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而误差。2014年3月29日完成移栽，分别于移栽后第25天、35天采样。测定指标除与生菜盆栽相同外，另测量玉米第三片真叶长度和宽度作为叶长和叶宽，采用公式“叶面积＝叶长×叶宽×0.75”计算玉米叶面积，用游标卡尺测定离土壤表面玉米第二节作为径粗。结果表明(表5、6)：加入本发明分离的壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1能够显著促进土壤有效磷的释放(与对照相比提高10.3％)、提高玉米叶片中氮磷钾含量及促进玉米生长。

表5 移栽后第25和35天时G1菌剂对玉米植株的促生效果对比表

注：数据为4次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMR法)。下表相同。

表6 移栽后第35天G1菌剂对玉米植株养分吸收和土壤有效磷含量的影响

实施例9 G1菌促进生菜生长田间小区效果试验

(1)菌悬液制备：同生菜盆栽试验。

(2)生菜育苗：同生菜盆栽试验。

(3)试验地点：华南农业大学农场，试验面积21m²。

(4)供试土壤：赤红壤发育的菜园土。

(5)试验设计：

采用G1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组每小区加入G1菌悬液1.2L)，用G1表示，第2组每小区加入0.85％生理盐水1.2L作为空白对照，用CK表示)，每个处理组各设3个小区(各小区面积为3.5m²)，6个小区采取完全随机区组设计。待生菜苗长出3片叶子时，挑选长势大小均一的苗进行移栽，种植密度120株苗(排除边际效应，设保护行1株，实际株数78株)。移栽后2天浇施G1菌悬液，将1.2L上述菌悬液加水至6L，分施到苗根际，50mL/株(保证每株苗根际G1菌数量为3.0×10⁹cfu)。施用复混肥料(15-15-15，正大科技)，移栽前每小区施肥0.25kg。于2014年2月20日进行移栽，移栽后35天收获采样。测定指标与生菜盆栽相同。结果表明(表7、8，图10)：田间条件下，加入本发明分离的壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1能够显著促进生菜的生长。

表7 G1菌剂对生菜植株的促生效果对比表

注：数据为3次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMRT法)。下表相同。

表8 G1菌剂对生菜植株养分吸收的影响

实施例10 G1菌促进玉米生长田间小区效果试验

(1)菌悬液制备：同玉米盆栽试验。

(2)玉米育苗：同玉米盆栽试验。

(3)试验地点：华南农业大学农场，试验面积31.8m²。

(4)供试土壤：赤红壤发育的菜园土。

(5)试验设计：

采用G1菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组每小区加入G1菌悬液340ml，用G1表示，第2组每小区加入0.85％生理盐水340ml作为空白对照，用CK表示)，每个处理组各设3个小区(各小区面积为5.3m²)，6个小区采取完全随机区组设计。待玉米苗长至10cm时，挑选长势大小均一的苗进行移栽，种植密度为34株/小区。移栽后2天浇施G1菌悬液，将340mL上述菌悬液加水至1.7L，分施到玉米苗根际，50mL/株(保证每株苗根际G1菌数量为3.0×10⁹cfu)。施用复混肥料(15-15-15，正大科技)，每个小区施肥量0.25kg，移栽前施肥0.15kg。于2014年5月16日进行移栽，移栽后50天施肥0.1kg。移栽后80天采样。结果表明(表9、10，图11)：田间小区条件下，加入本发明分离的壁芽孢杆菌(Bacillus muralis)G1能够显著促进玉米的生长，提高玉米产量12.6％。

表9 移栽后第80天G1菌剂对玉米植株生长的影响

注：数据为3次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMR法)。下表相同。

表10 移栽后第80天G1菌剂对玉米产量的影响

一株壁芽孢杆菌G1及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。