专利摘要

泽泻调血脂品质评价模型的构建，本发明提供了一种以不同产地泽泻调脂效应物质含量及调脂效应酶活性为自变量，调血脂指标表达水平为因变量的相关性分析，构建以泽泻生物活性为核心内容，辅以化学成分为内在指标的多指标高效率可信度高的品质评价模型；该模型比现行的中药指标性成分定性定量分析更能客观准确表达中药功效作用及其品质差异，为中药品质评价提供新的思路和技术平台。

权利要求

1.一种泽泻调血脂品质评价模型的构建方法，其特征在于，步骤如下：

第一步 制备不同产地泽泻有效部位的浸膏，得到其浸膏得率大小顺序；

第二步 得出不同产地泽泻有效部位的含量顺序；

第三步 得出有效部位对调脂关键酶活性的影响因素；

第四步 根据上述步骤，分析不同产地泽泻成分的含量；

第五步 构建品质评价数学模型，具体过程如下：

选取调脂药效指标TC表达水平为因变量，选用不同产地泽泻调脂效应物质23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇C的含量，以及调脂效应酶HMG-CoA还原酶、LPL、LCAT和ACAT的活力值为自变量，应用统计软件，通过偏最小二乘法模型识别方法进行相关性分析；建立不同产地泽泻调脂药效与五种调脂效应物质以及四种调脂效应酶之间的关系方程；具体方法如下：

泽泻的主要药效成分为a1,a2,a3,…,an，不同产地泽泻对调脂效应酶活性的影响为d1,d2,d3,…,dm，研究的药用目的为b1，b2，b3，…,bk，bj(j＝1,2,3,…,k)，a1,a2,a3…an和d1,d2,d3,…,dm对bj的贡献有大有小，分别令其贡献值大小为w1,w2,…,wn,w1,w2,…,wm，选取调脂药效指标CTC来反映，则CTC等效于bj，即

其中即进行归一化处理，Wi值越大说明该因素对泽泻降脂特性的贡献就越大；

可以用以下公式来表示：

若写成对应的矩阵形式为

动物样本数为6，则有6个调脂指标(CTC1，CTC2，CTC3，…，CTC6)，则写成矩阵形式为

用C，W，AD表示矩阵，可写成C＝W(AD)，则W＝C(AD)-1，即可求出W1,W2…,Wn,W1，W2，…，Wm的大小；

选取调脂药效指标CTC为因变量，选用不同产地泽泻调脂效应物质23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇C的含量，以及调脂效应酶HMG-CoA还原酶、LPL、LCAT和ACAT的活力值为自变量，应用SPSS19.0统计软件，通过偏最小二乘法(PLS)进行相关性分析； 不同产地泽泻CTC数据见表2，不同产地泽泻中的5个主要成分ai(i＝1,2,3,4,5)的含量，不同产地泽泻HMG-CoA还原酶、LPL、LCAT和ACAT活性的结果dt(t＝1,2,3,4)将以上数据代入公式(1)进行运算分析，可得如下矩阵：

其中各指标的贡献值w分别为：w1＝0.53，w2＝0.51，w3＝0.27，w4＝0.23，w5＝0.21，w6＝-0.47，w7＝0.24，w8＝0.01，w9＝-0.53；

归纳为方程即为：

CTC＝0.53C23-乙酰泽泻醇B+0.51C24-乙酰泽泻醇A+0.27C泽泻醇B+0.23C泽泻醇A+0.21C23-乙酰泽泻醇C－0.47CHMG-CoA还原酶+0.24CLPL+0.01CLCAT－0.53CACAT。

说明书

技术领域

本发明涉及中药品质模型构建，具体涉及泽泻品质模型构建。

背景技术

脂质代谢紊乱包括胆固醇和低密度脂蛋白代谢异常、富含甘油三脂的脂蛋白代谢异常、高密度脂蛋白代谢异常。研究表明，脂蛋白代谢酶生物活性的改变会引起脂质代谢的变化，导致脂质代谢紊乱而引发高脂血症。影响脂质代谢的关键酶有三羟基三甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶、脂蛋白脂酶(LPL)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、脂酰酶A胆固醇酯酰基转移酶(ACAT)等。在LPL、LCAT、LPL、ACAT等酶的联合作用下，可以增加血液中胆固醇(TC)的转化或代谢。HMG-CoA还原酶、ACAT活性降低，LPL、LCAT活性增加均可减少TC的合成。

泽泻为常用调血脂中药，其有效成分为泽泻醇类化合物。目前其品质评价仅从化学角度考虑，以其有效成分23-乙酰泽泻醇B作为评价指标，却未考虑其调血脂的药理药效作用。本发明旨在建立既反映其多组分多靶点整体效应，又能客观准确表达其调脂功效作用及其品质差异的评价模式。

发明内容

发明目的：以不同产地泽泻调脂效应物质含量及调脂效应酶活性为自变量，调血脂指标表达水平为因变量的相关性分析，构建以泽泻生物活性为核心内容，辅以化学成分为内在指标的多指标高效率可信度高的品质评价模型。

发明内容：本发明通过收集不同产地药材，研究其对调血脂指标、调血脂关键酶的影响，并与不同产地的有效成分的含量进行关联分析，选取调血脂指标表达水平为因变量，选用不同产地泽泻调脂效应物质含量及调脂效应酶活性为自变量相关性分析，建立不同产地泽泻调脂药效与五种调脂效应物质以及四种调脂效应酶之间的关系方程。从而构建以泽泻生物活性为核心内容，辅以化学成分为内在指标的多指标高效率可信度高的品质评价模型。

有益效果

本发明构建的以中药泽泻活性为核心内容，辅以化学成分为内在指标的多指标高效率可信度高的品质评价模型，符合中药药效评价的发展方向，能客观准确表达其功效作用及其品质差异，比现行的中药指标性成分定性定量分析具有优势，为其品质评价提供新的思路和技术平台。

具体实施方法

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1 制备不同产地泽泻有效部位的浸膏

称取福建泽泻饮片3.00kg，粉碎为粗粉，置于圆底烧瓶中，加5倍药材量的95％乙醇，加热回流提取2h，趁热过滤提取液，将剩余的残渣重复以上提取步骤，合并2次滤液，回收乙醇，并水浴浓缩成浸膏。将浸膏加适量水溶解后，先后用石油醚、乙酸乙酯萃取，对泽泻乙酸乙酯部位即有效部位进行回收试剂，得浸膏，称重。采用以上的方法制备得四川、广东和广西泽泻有效部位的浸膏。

从表1中可以看出，4个不同产地的泽泻乙酸乙酯部位浸膏得率分别是，福建：2.30％；四川：2.38％；广东：1.56％；广西：2.09％。通过比较数据可知，不同产地的泽泻乙酸乙酯部位浸膏得率大小顺序为：四川＞福建＞广西＞广东。

表1不同产地泽泻有效部位的浸膏得率

实施例2 不同产地泽泻有效部位的调血脂作用

配制脂肪乳剂：取1.00g丙硫氧嘧啶于乳钵中研细，备用。取20.00g猪油于40℃水浴加热融化，置乳钵中，加入10.00g胆固醇、1.00g丙硫氧嘧啶，充分搅拌，溶解。再逐渐加入10％去氧胆酸钠水溶液20.00mL，并不断搅拌，然后分别加入1.00mL吐温-80和2.00mL丙二醇，研磨乳化均匀，最后加蒸馏水至100.00mL。装入密闭容器中，冷藏，使用前先于37℃水浴融化。

取90只雄性ICR小鼠，随机分为15组，每组6只。选取1组设为正常对照组，正常喂养，每天喂生理盐水10mL·kg-1灌胃；其余动物均用于造模，灌胃脂肪乳10mL·kg-1。连续5周，灌胃期间均自由摄取常规饲料。将剩余动物均衡分为14组，分别为：模型组，辛伐他汀组，福建泽泻高、中、低剂量组，四川泽泻高、中、低剂量组，广西泽泻高、中、低剂量组，广东泽泻高、中、低剂量组。

分别称取适量福建、四川、广东、广西泽泻有效部位(乙酸乙酯部位浸膏)、辛伐他汀片，溶解于0.30％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中，分别稀释至100.00mL。

阳性组辛伐他汀组每天灌饲0.64mg·kg-1；福建泽泻乙酸乙酯部位低剂量组每天灌饲9.77mg·kg-1；中剂量组每天灌饲19.53mg·kg-1；高剂量组每天灌饲29.30mg·kg-1；四川泽泻乙酸乙酯部位低剂量组8.58mg·kg-1；中剂量组每天灌饲17.15mg·kg-1；高剂量组每天灌饲25.73mg·kg-1；广东泽泻乙酸乙酯部位低剂量组9.44mg·kg-1；中剂量组每天灌饲18.87mg·kg-1；高剂量组每天灌饲28.31mg·kg-1；广西泽泻乙酸乙酯部位低剂量组6.40mg·kg-1；中剂量组每天灌饲12.80mg·kg-1；高剂量组每天灌饲19.20mg·kg-1。

各造模组每日上午继续以10mL·kg-1灌胃给予脂肪乳剂，下午各给药组给予相应药物治疗，连续给药3周。末次给药后，禁食12h(不禁水)，小鼠眼眶静脉取血，静置1h，离心取血清，离心条件：4℃，3000r·min-1，15min，取血清按照TC试剂盒的说明书操作测定。

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，结果均以 表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

各组小鼠血清中的TC含量的测定结果见表2。结果表明，与空白组比较，模型组的TC水平显著上升(P<0.01)，说明高脂模型造模成功。与模型组比较，各个给药组的TC水平均显著下降(P<0.01)，表明4个产地泽泻有效部位均能显著调节高脂小鼠的血脂水平。各产地的浸膏得率：四川＞福建＞广西＞广东。表明不同产地泽泻有效部位含量不同，其中四川和福建产的泽泻有效部位的含量较高。

表2各组血脂水平比较( n＝6)

注：福建：福建产药材有效部位，四川：四川产药材有效部位，广东：广东产药材有效部位，广西：广西产药材有效部位；与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例3 四种产地泽泻有效部位对调脂关键酶活性的影响

在实施例2中，末次给药后禁食12h(不禁水)，各组小鼠眼眶静脉取血之后，脱颈处死后取肝，取适量并剪成细小碎片，按每1g组织加入1％十二烷基硫酸钠9.00mL和苯甲基磺酰氟0.09mL的比例，分别加入试剂，冰浴下匀浆后离心，离心条件：4℃，12000r·min-1，15min，吸取上清分装并保存于-80℃，备用。

取肝匀浆上清液，按照HMG-CoA还原酶试剂盒、LPL试剂盒、LCAT试剂盒、ACAT试剂盒的说明书操作，检测以上4种酶的活性。

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，结果均以x±s表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

各组小鼠肝脏中调脂关键酶活性的检测结果见表3。与空白组相比，模型组HMG-CoA还原酶、ACAT的活性显著升高(P＜0.01)，LPL、LCAT的活性显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，4个产地泽泻乙酸乙酯部位高、中、低剂量给药组的HMG-CoA还原酶、ACAT活性均显著下降(P＜0.01)，LPL、LCAT的活性显著增强(P＜0.01，P＜0.05)，各个产地的高、中、低剂量组对调脂关键酶的作用强度顺序为：高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，表明泽泻有效部位对调脂关键酶的作用呈浓度依赖性。4个产地给药组相比，对HMG-CoA还原酶活性的作用大小顺序为：福建＞四川＞广东＞广西；对LPL活性的作用大小顺序：福建＞四川＞广东＞广西；对LCAT活性的作用大小顺序为：四川＞福建＞广东＞广西；对ACAT活性的作用大小顺序为：四川＞福建＞广东＞广西。

表3不同产地泽泻有效部位对调脂关键酶活性的影响( n＝6)

注：福建：福建产药材有效部位，四川：四川产药材有效部位，广东：广东产药材有效部位，广西：广西产药材有效部位；与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例4 不同产地泽泻有效成分的含量分析

取福建泽泻的干燥块茎20kg，10倍量甲醇冷浸提取4次，低压浓缩，得浸膏1600g。用水分散后依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯部位785g，正丁醇部位531g。取乙酸乙酯部位450g，采用100-200目硅胶(2500g)、石油醚-乙酸乙酯体系进行粗分，得25个组分(Fr1-Fr25)。将各组分(2.9～5g)通过甲醇/二氯甲烷体系重结晶或通过C18柱层析分离后，利用高效液相色谱法(HPLC)分析选择合适条件后，经半制备液相(95％甲醇溶液，等度洗脱)制备得到23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C和24-乙酰泽泻醇A，纯度为98％(重量)。

采用高效液相色谱法-紫外法(HPLC-UV)，建立同时测定23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C含量的分析方法：精密称取5个成分的对照品适量，用乙腈溶解，分别配制成含泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C为0.1g·L-1的对照品储备溶液。采用Ultimate XB-C18色谱柱(150nm×4.6mm，5μm)；柱温：35℃；检测波长204nm、210nm、246nm；进样量10μL；流动相乙腈-水梯度洗脱，0～12min，56％乙腈；12～29min，56％～73％乙腈；29～55min，73％乙腈；流速为0.8mL·min-1。取药材粉末(过60目筛)1.0g溶于20mL乙腈，称重；40℃水浴超声提取30min，补重，过滤；取滤液2mL，加入0.5mL内标贮备母液，乙腈稀释定容至10mL。经0.45μm滤膜过滤，作为供试品溶液。确定线性范围，绘制标准曲线，并进行精密度、稳定性和重复性试验、加样回收率等方法学考察。

采用以上方法检测其他3个产地泽泻中5种效应成分的含量。结果见表4，说明，23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C含量均为：四川＞福建＞广西＞广东；24-乙酰泽泻醇A为：广西＞四川＞广东＞福建；泽泻醇A：四川＞广西＞广东＞福建。

表4不同产地泽泻有效成分的含量测定( ％)

实施例5 构建品质评价数学模型

选取调脂药效指标TC表达水平为因变量，选用不同产地泽泻调脂效应物质23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇C的含量，以及调脂效应酶HMG-CoA还原酶、LPL、LCAT和ACAT的活力值为自变量，应用SPSS19.0统计软件，通过偏最小二乘法(PLS)模型识别方法进行相关性分析，建立不同产地泽泻调脂药效与五种调脂效应物质以及四种调脂效应酶之间的关系方程。

泽泻的主要药效成分为a1,a2,a3,…,an，不同产地泽泻对调脂效应酶活性的影响为d1,d2,d3,…,dn，研究的药用目的为b1，b2，b3，…,bk，bj(j＝1,2,3,…,k)，a1,a2,a3…an和d1,d2,d3,…,dn对bj的贡献有大有小，分别令其贡献值大小为w1,w2,…,wn,w1,w2,…,wm，选取调脂药效指标CTC来反映，则CTC等效于bj，即

其中 即进行归一化处理，Wi值越大说明该因素对泽泻降脂特性的贡献就越大。

可以用以下公式来表示：

若写成对应的矩阵形式为

动物样本数为6，则有6个调脂指标(CTC1，CTC2，CTC3，…，CTC6)，则写成矩阵形式为

用C，W，AD表示矩阵，可写成C＝W(AD)，则W＝C(AD)-1，即可求出W1,W2…,Wn,W1，W2，…，Wm的大小。

选取调脂药效指标CTC为因变量，选用不同产地泽泻调脂效应物质23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇C的含量，以及调脂效应酶HMG-CoA还原酶、LPL、LCAT和ACAT的活力值为自变量，应用SPSS19.0统计软件，通过偏最小二乘法(PLS)进行相关性分析。不同产地泽泻CTC数据见表2，不同产地泽泻中的5个主要成分ai(i＝1,2,3,4,5)的含量见表4，不同产地泽泻HMG-CoA还原酶、LPL、LCAT和ACAT活性的结果dt(t＝1,2,3,4)见表3。将以上数据代入公式(1)进行运算分析，可得如下矩阵：

其中各指标的贡献值w分别为：w1＝0.53，w2＝0.51，w3＝0.27，w4＝0.23，w5＝0.21，w6＝-0.47，w7＝0.24，w8＝0.01，w9＝-0.53。

归纳为方程即为:

CTC＝0.53C23-乙酰泽泻醇B+0.51C24-乙酰泽泻醇A+0.27C泽泻醇B+0.23C泽泻醇A+0.21C23-乙酰泽泻醇C－0.47CHMG-CoA还原酶+0.24CLPL+0.01CLCAT－0.53CACAT

即为以泽泻生物活性为核心，辅以化学成分为内在指标的品质评价数学模型。

本发明比较四个不同产地泽泻的四种脂代谢效应关键酶差异，比较四个不同产地泽泻有效成分含量差异，并与四个产地的调脂指标进行关联分析，建立以泽泻生物活性为核心，辅以化学成分为内在指标的品质评价数学模型。分析可知，泽泻的调脂特性与泽泻中的五个主要有效成分均成正相关，并且各自的贡献大小顺序为：23-乙酰泽泻醇B>24-乙酰泽泻醇A>泽泻醇B>泽泻醇A>23-乙酰泽泻醇C。同时，与调脂关键酶中的HMG-CoA还原酶和ACAT的酶活性呈负相关，与LPL活性成正相关，LCAT对泽泻调脂药效的贡献相对较小。此结果可从泽泻多种有效成分含量、多种调脂关键酶活性对泽泻的调脂药效进行多角度多层次的系统性评价。该模型符合中药药效评价的发展方向，能客观准确表达其功效作用及其品质差异，理论上比现行的中药指标性成分定性定量分析具有优势，为其品质评价提供新的思路和技术平台。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

泽泻调血脂品质评价模型的构建专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。