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一种3-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用

一种3-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用

IPC分类号 : C07J63/00,C12P33/00,A61P19/08,C12N5/071,C12R1/80

申请号
CN201711010814.3
可选规格
  • 专利类型: 发明专利
  • 法律状态: 有权
  • 申请日: 2017-10-26
  • 公开号: 107586313B
  • 公开日: 2018-01-16
  • 主分类号: C07J63/00
  • 专利权人: 南京盖斯夫医药科技有限公司

专利摘要

本发明公开了一种3‑酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用。本发明提供了新的积雪草酸衍生物—2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸,并提供了该2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸的制备方法,步骤包括:步骤S1,生物转化:取梅林青霉孢子悬浮液接入无菌液体培养液中培养2d;无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中,继续培养3d;步骤S2,分离纯化:培养液过滤取滤液,上样于大孔树脂,用40%、75%的乙醇水溶液洗脱,收集75%乙醇洗脱液,浓缩后用反相制备液相色谱分离,根据色谱图收集2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸对应的洗脱流份。申请人研究发现,2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。

权利要求

1.一种3-酮积雪草酸在制备体外促进骨髓间充质干细胞增殖并诱导其成骨分化的培养液中的应用,所述3-酮积雪草酸的化学结构如下:

说明书

技术领域

本发明属于化学领域,涉及一种3-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用。

背景技术

积雪草酸,又名亚细亚酸,是天然植物积雪草的三萜提取物的主要成分之一,具有乌苏烷型骨架结构。积雪草酸及其衍生物具有广泛的生物活性,包括抗菌、抗病毒、抗阿尔茨海默病、保护心脑血管以及抗肿瘤等作用(参考文献:积雪草酸A环开环衍生物的合成及体外抗肿瘤活性研究,中国新药杂志2017年第26卷第10期)。

微生物转化法可以实现很多化学合成无法实现的结构修饰。对积雪草酸的微生物转化是获得新型积雪草酸衍生物的重要手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸及其制备方法和在干细胞领域的应用,2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸均为积雪草酸的衍生物。

实现本发明上述目的技术方案如下:

一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸,其化学结构如下:

一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法,包括如下步骤:

步骤S1,生物转化:取活化后的梅林青霉斜面菌种,用无菌水冲洗斜面上的孢子,振摇,得梅林青霉孢子悬浮液;取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中培养2d;无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中,继续培养3d;

步骤S2,分离纯化:培养液过滤取滤液,上样于AB-8型大孔吸附树脂,依次用体积百分浓度为40%、75%的乙醇水溶液洗脱,收集75%乙醇洗脱液,浓缩后用反相制备液相色谱分离,流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:3-7,V/V/V),根据色谱图收集2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸对应的洗脱流份,浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸。

2-酮积雪草酸可能由梅林青霉通过如下生源途径转化得到:

3-酮积雪草酸可能由梅林青霉通过如下生源途径转化得到:

优选地,步骤S1于25℃、150r/min条件培养。

优选地,所述液体培养液为PDB培养基。

优选地,所述积雪草酸浓度为0.4-0.6mg/mL。

所述的2-酮积雪草酸在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化方面的应用。

所述的3-酮积雪草酸在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化方面的应用。

本发明的突出优点:

本发明提供了一种新的积雪草酸衍生物—2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸,并提供了该2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法,申请人研究发现,2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,可以用于制备诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的试剂;本发明提供的制备方法步骤简单,易于大生产。

附图说明

图1为采用反相制备液相色谱分离75%乙醇洗脱物的色谱图;

图2为骨髓间充质干细胞成骨分化的茜红素染色结果图。

具体实施方式

下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容,由于篇幅原因,实验过程的描述无法做到非常详细,凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。

实施例1 2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备

一、实验材料

梅林青霉Penicillium melinii Thom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基:PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基);转化培养基:PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。

积雪草酸自制,纯度大于98%。

二、实验方法和结果

2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法,包括如下步骤:

步骤S1,生物转化:取活化后的梅林青霉斜面菌种,用无菌水冲洗斜面上的孢子,振摇,得梅林青霉孢子悬浮液;取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d;无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中,积雪草酸浓度为0.5mg/mL,于25℃、150r/min条件继续培养3d;

步骤S2,分离纯化:培养液过滤取滤液,上样于AB-8型大孔吸附树脂,依次用体积百分浓度为40%、75%的乙醇水溶液洗脱,收集75%乙醇洗脱液,浓缩后用反相制备液相色谱分离,色谱柱Ultimate XB-C8(10μm,10mm×250mm),流速2.5mL/min,柱温25℃,检测波长为210nm,进样量0.5mL,流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:5,V/V/V),根据色谱图(如图1A所示;图1B为对比色谱图,流动相中不添加三氟乙酸)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份,浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸,纯度均大于98%。

结构鉴定:2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸与积雪草酸碳谱结构鉴定数据对比如下。

根据高分辨质谱可知,2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的分子式为C30H46O4,比积雪草酸少一个H2O。根据碳谱的酮羰基以及氢谱(600MHz,CDCl3)羟基数量可知,2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸为积雪草酸脱水后发生烯醇变化的产物。再根据2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸氢谱中C23羟基氢的化学位移确定2-酮积雪草酸(δ4.24,相对3-酮积雪草酸位于高场)、3-酮积雪草酸(δ6.34,相对2-酮积雪草酸位于低场)的酮羰基位置。

实施例2 2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备

一、实验材料

梅林青霉Penicillium melinii Thom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基:PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基);转化培养基:PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。

积雪草酸自制,纯度大于98%。

二、实验方法和结果

2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法,包括如下步骤:

步骤S1,生物转化:取活化后的梅林青霉斜面菌种,用无菌水冲洗斜面上的孢子,振摇,得梅林青霉孢子悬浮液;取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d;无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中,积雪草酸浓度为0.4mg/mL,于25℃、150r/min条件继续培养3d;

步骤S2,分离纯化:培养液过滤取滤液,上样于AB-8型大孔吸附树脂,依次用体积百分浓度为40%、75%的乙醇水溶液洗脱,收集75%乙醇洗脱液,浓缩后用反相制备液相色谱分离,流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:3,V/V/V),根据色谱图(与图1A基本一致,仅色谱峰分离度不同,均大于1.5,符合规定)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份,浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸,纯度均大于98%。

实施例3 2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备

一、实验材料

梅林青霉Penicillium melinii Thom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基:PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基);转化培养基:PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。

积雪草酸自制,纯度大于98%。

二、实验方法和结果

2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法,包括如下步骤:

步骤S1,生物转化:取活化后的梅林青霉斜面菌种,用无菌水冲洗斜面上的孢子,振摇,得梅林青霉孢子悬浮液;取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d;无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中,积雪草酸浓度为0.6mg/mL,于25℃、150r/min条件继续培养3d;

步骤S2,分离纯化:培养液过滤取滤液,上样于AB-8型大孔吸附树脂,依次用体积百分浓度为40%、75%的乙醇水溶液洗脱,收集75%乙醇洗脱液,浓缩后用反相制备液相色谱分离,流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:7,V/V/V),根据色谱图(与图1A基本一致,仅色谱峰分离度不同,均大于1.5,符合规定)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份,浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸,纯度均大于98%。

实施例4 诱导骨髓间充质干细胞成骨分化

一、实验材料

积雪草酸、2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸自制,纯度大于98%。

DMEM/F12(1:1)培养基作为无血清培养液,购于Hyclone公司。

二、实验方法

1、骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离和培养

取出生14d的健康SD大鼠,采用颈椎脱臼法处死浸泡于75%酒精中10min,无菌条件下取双侧股骨、胫骨以及肱骨,置于无血清的培养液中,剪断双侧干骺端,暴露出骨髓腔,用注射器吸取2.5mL培养基反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液置于离心管中,离心1200r/min,5min,弃上清,用含有10%胎牛血清的完全培养液重悬细胞,于5%CO2、37℃培养箱内培养,24h后换液,去除未贴壁细胞,每2-3d换液一次,当细胞贴壁生长80%-90%,0.25%胰酶消化并传代,每隔2d换液一次,用传代方法对细胞纯化,于倒置显微镜下观察细胞形态。

2、对骨髓间充质干细胞增殖的影响

取第三代BMSCs以1×103/孔的浓度接种于96孔板,分别加入25μM的积雪草酸、2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸(还设置对照组,对照组不添加积雪草酸、2-酮积雪草酸或3-酮积雪草酸),每组设置3个复孔,培养5d时终止培养,每孔中加入100μL无血清培养液及10μLCCK-8检测液,置于培养箱中2h后,使用酶标仪450nm波长下测定OD值。

3、钙化结节染色

取第3代细胞,接种培养皿中,2.5×105/皿。待细胞贴合至80%后分别加入20μM的积雪草酸、2-酮积雪草酸或3-酮积雪草酸,诱导21d后终止,PBS冲洗3次,95%酒精固定15min后,0.1%茜素红染色,37℃孵育1h,双蒸水冲洗3次。观察并照相,统计钙化面积百分比(%)。

4、统计学处理

用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,数据采用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

三、实验结果

1、BMSCs培养及鉴定

大鼠原代细胞培养24h后可见少量星形、梭形细胞贴壁生长,4d后可见细胞呈放射状排列,呈梭形。培养7d后可见细胞呈片状生长排列紧密,呈漩涡状生长,BMSCs培养正常。

2、对骨髓间充质干细胞增殖的影响

积雪草酸、2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸分别培养5d后,采用CCK-8试剂盒检测BMSCs细胞数量。结果表明:2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸能够促进BMSCs的增殖,OD值显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);积雪草酸对BMSCs的增殖无明显促进作用。

各组OD值如表1所示。

表1 CCK8法检测对骨髓间充质干细胞增殖的影响

对照组2-酮积雪草酸组3-酮积雪草酸组积雪草酸组OD值(450nm)0.91±0.091.44±0.151.57±0.140.89±0.07

3、钙化结节染色结果

已知成骨细胞会出现钙化现象,会被茜红素染成红色,未钙化的细胞不会被染色。从图2可见,对照组、积雪草酸组均没有明显的钙化结节现象(钙化面积百分比<5%),而2-酮积雪草酸组和3-酮积雪草酸组可观察到大面积的钙化结节,钙化面积百分比达40%以上。

上述实施例证明,2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化,可以用于制备成诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的培养液,以有效提高骨髓间充质干细胞分化成骨骨量。

上述实施例是对本发明实质性内容的体现,用于更好地解释本发明,但本领域技术人员应当知晓,不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。

一种3-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用专利购买费用说明

专利买卖交易资料

Q:办理专利转让的流程及所需资料

A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。

1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2:按规定缴纳著录项目变更手续费。

3:同时提交相关证明文件原件。

4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q:专利转让变更,多久能出结果

A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。

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