专利摘要

本发明涉及一种天然抑藻剂，由网状原角藻制备而成。本发明制备方法简单，产量大，制备的抑制剂纯度高、活性高，抑制效果好，实验证明该抑藻剂对常见的赤潮藻：拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、东海原甲藻和赤潮异弯藻有较强的抑制效果。本发明抑藻剂在消除二次污染方面具有明显优势，可避免对其他生物，尤其是人的毒害，且在环境中能够迅速降解。另外，粉末制剂方便储存、运输，同时也保持了较高的抑藻活性。

权利要求

1.一种藻类天然抑制剂，其特征在于：由网状原角藻制备而成。

2.一种藻类天然抑藻剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)将海水经孔径为0.45μm直径为47mm的醋酸纤维滤膜过滤后，121℃高温高压灭菌，备用；

2)将培养瓶置于1mol/L HCl溶液中浸泡24h，之后用蒸馏水冲洗晾干，备用；

3)在无菌室内，将网状原角藻藻种接入盛有步骤1)海水配制的培养基的培养瓶中，培养温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h，持续培养到指数生长期；

在无菌室内将指数生长期的网状原角藻接入步骤1)海水配制的培养基中，置于培养温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h，培养10天，获得活性藻液；

4)将活性藻液通过5μm滤膜过滤，滤除藻细胞，获得无细胞藻滤液；

5)将步骤4)得到的滤液经过氯仿/甲醇萃取三次，获得浓缩藻液；

6)将浓缩藻液旋转蒸发至干，获得干燥粉末状抑藻剂；

7)将抑藻剂置于-80℃超低温冰箱储存。

3.根据权利要求2所述的藻类天然抑藻剂的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的培养基为L1培养基。

4.根据权利要求2所述的藻类天然抑藻剂的制备方法，其特征在于所述步骤5)中氯仿/甲醇体积比为3:1。

5.根据权利要求4所述的藻类天然抑藻剂的制备方法，其特征在于所述步骤5)中滤液与氯仿/甲醇的用量体积比为6:1。

6.权利要求2-5任一项制备的藻类天然抑藻剂的应用，其特征在于抑藻剂用于抑制海洋藻类。

7.根据权利要求6所述的藻类天然抑藻剂的应用，其特征在于抑制剂用于抑制拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、东海原甲藻和赤潮异弯藻。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物学、生态学、藻类学领域，特别涉及一种藻类天然抑藻剂及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，我国海洋富营养化加剧，赤潮频繁爆发，严重破坏了海洋生态系统的健康，并给水产养殖业造成严重经济损失。如何有效治理赤潮和藻华成为人们不断探索的新目标。目前国内外提出多种藻类治理方法，但都存在弊端，物理方法多数效率低下，费用高；化学方法易产生二次污染。因此，探索有效、经济、环保的控制赤潮发生的方法是当前环境科学的一项重要任务，是当前经济建设和环境保护的迫切需要，而化感作用则为赤潮治理提供了一个可能途径。

化感作用(allelopathy)是一种植物通过向环境中释放化学物质而对另一种植物(包括微生物)所产生的直接或间接的作用，是生态系统中的一种自然化学调控现象。一般认为，化感作用是由于植物自身生存环境受到威胁时，为保证自身生存繁殖所需要的养分而激发的一种抑制其它竞争生物生长繁殖的能力，在海洋浮游植物种间竞争过程中发挥了重要作用，影响浮游植物群落的组成和演替。利用化感作用原理从植物的代谢产物或机体内分离有机物得到的植物源抑藻剂，不仅对靶细胞和生物受体有选择性和专一性，并且具有如环境中降解迅速、对非目标水产动物及非靶标生物，尤其是人类，具有无毒 害等特点，因此在消除二次环境污染方面特别具有优势。

网状原角藻(Protoceratiumreticulatum)是一种世界范围内广有分布的海洋甲藻，在我国近海也普遍存在。能产生虾夷扇贝毒素(Yessotoxins，YTXs)及其衍生物，分子量在955-1551，是含有2个磺酰基的多环聚醚类化合物。因为具有巯基亲脂性聚醚状结构，常和腹泻性贝毒一同被检出，曾经一度被归类到腹泻性贝毒(DSP)中，但是与DSP不同的是，YTXs并不会造成实验动物的腹泻，而且也不会使蛋白磷酸酶2A失活，2002年欧盟委员会正式将此类毒素单独列为无毒害一类。小鼠实验表明：由于YTX分子量较大，经口服进入小鼠体内不易被肠道吸收而随尿液代谢排出体外，对人类没有危害。

根据海洋局每年的赤潮公报，拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、赤潮异弯藻和东海原甲藻等是我国最为常见的赤潮藻，因此将这四种藻作为抑藻剂的抑制目标，通过实验也证实了抑藻剂对它们的显著抑制作用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种藻类天然抑藻剂及其制备方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种天然抑藻剂的制备方法，具体步骤如下：

1)将海水经孔径为0.45μm直径为47mm的醋酸纤维滤膜过滤后，121℃高温高压灭菌，备用；

2)将培养瓶置于1mol/L HCl溶液中浸泡24h，之后用蒸馏水冲洗晾干，备用；

3)在无菌室内将网状原角藻藻种接入步骤1)海水配制的培养基中，培养温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h，持续培养到指数生长期；

在无菌室内将指数生长期的网状原角藻接入步骤1)海水配制的培养基中，置于培养温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h，培养10天，获得活性藻液；

4)将活性藻液通过5μm滤膜过滤，滤除藻细胞，获得无细胞藻滤液；

5)将步骤4)得到的滤液经过氯仿/甲醇萃取三次，获得浓缩藻液；

6)将浓缩藻液旋转蒸发至干，获得干燥粉末状抑藻剂；

7)将抑藻剂置于-80℃超低温冰箱储存。

在上述方案的基础上，所述步骤3)中的培养基为L1培养基。

L1培养基配方如表1-3所示：

表1L1培养基配方 

准备步骤1)所制备的海水950mL，加入表1中各组分，用步骤 1)所制备的海水定容至1L，调节最终pH至8.0-8.2。

表2表1中配方中微量元素溶液的配方

将以上组份溶于950mL步骤1)所制备的海水，定容至1L，高压灭菌。

表3表1配方中维生素溶液的配方

首先将硫胺素(维生素B1)溶于950mL步骤1)所制备海水中， 然后加入其他组份，溶解，定容至1L，高温高压灭菌。

在上述方案的基础上，所述步骤5)中氯仿/甲醇体积比为3:1。

在上述方案的基础上，所述步骤5)中滤液与氯仿/甲醇的用量体积比为6:1。

发明优势：

本发明制备藻类抑制剂的方法是一个整体，方法中的任一步骤和参数都是方法整体中必不可少的；与传统的培养基相比，本发明使用的L1培养基适宜网状原角藻的生长，网状原角藻在该培养基中生长速度快、长势好；制备方法简单，产量大，制备的抑制剂纯度高、活性高，抑制效果好，实验证明该抑藻剂对常见的赤潮藻：拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、东海原甲藻和赤潮异弯藻有较强的抑制效果。

与传统的化学方法相比，该抑藻剂在消除二次污染方面具有明显优势：粉末制剂形式滤除了网状原角藻细胞，避免该藻扩散导致的污染；本发明依靠藻类本身的代谢产物，属于植物源抑藻剂，对靶细胞和生物受体(赤潮藻)有选择性和专一性，可避免对其他生物，尤其是人的毒害，且在环境中能够迅速降解。另外，粉末制剂方便储存、运输，同时也保持了较高的抑藻活性。

具体实施方式

实施例1

藻类抑制剂的制备：

具体步骤如下：

将网状原角藻藻种活化后，在无菌室内接入L1培养基中，培养 瓶规格为1升，培养箱温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h，持续培养到指数生长期；在无菌室内将指数生长期的网状原角藻接入L1培养基中，接种密度5000cells/mL，培养瓶规格为1升，置于培养温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h，培养10天，获得活性藻液，定为含有1个抑藻剂活性单位，即密度为5000cells/mL网状原角藻在1升培养基中培养10天所获得抑藻剂的量；将活性藻液通过5μm滤膜过滤，滤除藻细胞，获得无细胞藻滤液，即1个活性单位；将无细胞滤液经过氯仿/甲醇(体积比3:1)萃取三次，无细胞滤液与氯仿/甲醇体积比为6:1；获得浓缩藻液；将浓缩藻液旋转蒸发至干，获得干燥粉末状抑藻剂，即1个活性单位。

实施例2

网状原角藻活性藻液、无细胞滤液和粉末制剂对几种常见赤潮藻的化感抑制作用实验

1)选取对数生长期的拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、赤潮异弯藻和东海原甲藻作为受体藻种，细胞密度5000cells/mL。

2)分别将四种赤潮藻接入分别含有网状原角藻活性藻液、无细胞滤液和粉末制剂的L1培养基中，这几种培养基均含有1个活性单位的抑藻成份(实施案例1所获得)。

3)另外将相同数量的几种受体藻种接入正常的L1培养基中作为空白对照，共4组样品，每组设一个对照。

4)连续培养10天每隔两天取一次样，培养条件：温度为(20±1℃)，光暗比为L:D＝12h:12h。

5)比较网状原角藻细胞活性藻液对不同海洋微藻的化感作用：细胞计数，接种后每隔一天取样，样品用Lugol’s碘液固定，于Nikon TS 100倒置显微镜下计数，每个样品重复计数3次，取其平均值，计数结果表明：在共培养的环境中，网状原角藻显示出了对拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、赤潮异弯藻和东海原甲藻的显著抑制(表1)。

表1该表显示的是四种赤潮藻(拟旋链角毛藻、米氏凯伦藻、赤潮异湾藻和东海原甲藻)在添加抑藻剂(网状原角藻活性藻液、无细胞滤液和粉末制剂三种形态)和无抑藻剂的培养基中培养10天的细胞密度(个/毫升)时间变化。每隔两天取一次样并计数，每次计数取3个平行样，以平行样平均值为当天细胞密度。

表1实验结果显示，网状原角藻活性藻液、无细胞滤液和粉末制剂对四种藻都有明显的抑制效果，第10天的抑制效率在95％以上。 尤其是粉末制剂在经过萃取和蒸干过程后，仍然保持了较高的抑藻活性，在实际的运输和储存过程中，粉末制剂有着体积小、重量少的优势，因此更加适宜产品化批量生产。

一种藻类天然抑藻剂及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。