IPC分类号 : C08L35/00,C08K3/32,C08J3/075,C08F222/38,C08F230/02,A61L27/52,A61L27/16,A61L27/12
专利摘要
本发明公开高强度矿化水凝胶及其在骨修复中的应用，以N‑丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸为原料，在引发剂存在条件下共聚制成水凝胶，通过钙磷离子在凝胶内部原位沉积形成羟基磷灰石。由于凝胶结构中存在氢键形成的物理交联作用和羟基磷灰石与凝胶基体离子交联的双重作用，这种矿化水凝胶管具有良好的拉伸和压缩性能。同时由于羟基磷灰石的存在，提高了凝胶管的骨结合和骨修复能力。
权利要求
1.高强度矿化水凝胶，其特征在于，按照下述步骤进行：由单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸在水中通过自由基共聚制备水凝胶；将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，然后将水凝胶浸入氨水中，以使共聚水凝胶为碱性并在共聚水凝胶中沉淀结晶产生羟基磷灰石；N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸的质量比(8—10)：1，初始水凝胶的固含量为20—30％，引发剂用量为两种单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸质量之和的1—5％；在氯化钙和磷酸的混合水溶液中，元素钙和元素磷的摩尔比为(1.5—1.8)：1；将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液中，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，浸泡温度为20—25摄氏度，浸泡时间为10—80小时；将水凝胶浸入氨水中，氨水的质量百分数为15％，浸泡2—6小时，以调节凝胶管内部pH值至9—10，室温20—25摄氏度下在其内部沉积羟基磷灰石；在沉积羟基磷灰石后，将水凝胶置于氯化钙水溶液中以使羟基磷灰石步熟化，温度为室温20—25摄氏度，时间为2—6小时，氯化钙的浓度为750mM。
2.根据权利要求1所述的高强度矿化水凝胶，其特征在于，N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸的质量比为(9—10)：1；初始水凝胶的固含量为25—30％；引发剂用量为两种单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸质量之和的3—5％。
3.根据权利要求1所述的高强度矿化水凝胶，其特征在于，在氯化钙和磷酸的混合水溶液中，元素钙和元素磷的摩尔比为(1.6—1.7)：1；将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液中，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，浸泡温度为20—25摄氏度，浸泡时间为24—60小时。
4.根据权利要求1所述的高强度矿化水凝胶，其特征在于，将水凝胶浸入氨水中，氨水的质量百分数为15％，浸泡4—6小时，以调节凝胶管内部pH值至9—10，室温20—25摄氏度下在其内部沉积羟基磷灰石；在沉积羟基磷灰石后，将水凝胶置于氯化钙水溶液中以使羟基磷灰石步熟化，温度为室温20—25摄氏度，时间为4—6小时，氯化钙的浓度为750mM。
5.根据权利要求1所述的高强度矿化水凝胶，其特征在于，引发剂为偶氮二异丁腈或者过氧化苯甲酰，将反应体系加热到所用引发剂的引发温度之上并保持1-5h。
6.根据权利要求1所述的高强度矿化水凝胶，其特征在于，引发剂为1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2′,2′-二甲基乙酮、甲基乙烯基酮或者安息香，在紫外光照射的条件下引发自由基聚合，照射时间为30min-1h。
7.高强度矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：由单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸在水中通过自由基共聚制备水凝胶；将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，然后将水凝胶浸入氨水中，以使共聚水凝胶为碱性并在共聚水凝胶中沉淀结晶产生羟基磷灰石；N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸的质量比(8—10)：1，初始水凝胶的固含量为20—30％，引发剂用量为两种单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸质量之和的1—5％；在氯化钙和磷酸的混合水溶液中，元素钙和元素磷的摩尔比为(1.5—1.8)：1；将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液中，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，浸泡温度为20—25摄氏度，浸泡时间为10—80小时；将水凝胶浸入氨水中，氨水的质量百分数为15％，浸泡2—6小时，以调节凝胶管内部pH值至9—10，室温20—25摄氏度下在其内部沉积羟基磷灰石；在沉积羟基磷灰石后，将水凝胶置于氯化钙水溶液中以使羟基磷灰石步熟化，温度为室温20—25摄氏度，时间为2—6小时，氯化钙的浓度为750mM。
8.根据权利要求7所述的高强度矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸的质量比为(9—10)：1；初始水凝胶的固含量为25—30％；引发剂用量为两种单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸质量之和的3—5％。
9.根据权利要求7所述的高强度矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，在氯化钙和磷酸的混合水溶液中，元素钙和元素磷的摩尔比为(1.6—1.7)：1；将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液中，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，浸泡温度为20—25摄氏度，浸泡时间为24—60小时。
10.根据权利要求7所述的高强度矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，将水凝胶浸入氨水中，氨水的质量百分数为15％，浸泡4—6小时，以调节凝胶管内部pH值至9—10，室温20—25摄氏度下在其内部沉积羟基磷灰石；在沉积羟基磷灰石后，将水凝胶置于氯化钙水溶液中以使羟基磷灰石步熟化，温度为室温20—25摄氏度，时间为4—6小时，氯化钙的浓度为750mM。
11.根据权利要求7所述的高强度矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，引发剂为偶氮二异丁腈或者过氧化苯甲酰，将反应体系加热到所用引发剂的引发温度之上并保持1-5h。
12.根据权利要求7所述的高强度矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，引发剂为1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2′,2′-二甲基乙酮、甲基乙烯基酮或者安息香，在紫外光照射的条件下引发自由基聚合，照射时间为30min-1h。
13.如权利要求1—6之一所述的高强度矿化水凝胶在制备治疗骨修复药品中的应用。
说明书
技术领域
本发明涉及一种具有体积骨修复能力的高强度矿化水凝胶管的制备，具体为一种管状N-丙烯酰基甘氨酰胺-乙烯基膦酸-羟基磷灰石(P(NAGA-VPA)/HAp)水凝胶的制备方法及其在体积骨修复方面的应用，该水凝胶管通过原位沉淀的方法在凝胶基体中引入羟基磷灰石无机微粒，使凝胶具有与骨结合以及体积骨修复能力。
背景技术
现今，对于无法自愈的体积骨缺损仍然缺少一种简单有效的治疗方法。为解决这一问题，许多类骨的生物活性材料被应用于修复体积骨缺损，其中作为广泛应用于生物体的材料，可注射水凝胶为修复体积骨修复提供了一种解决方法。但由于其力学强度较差，可注射水凝胶应用于体积骨修复时需要术后外部固定，使手术过程复杂且增加了患者的疼痛，且二次手术易引起炎症反应。得益于不断深入的高强度水凝胶研究，其有望解决这一问题。但由于高强度水凝胶自身结构与天然骨的差距，其缺少与天然骨之间的结合能力，极大的限制了其在骨修复方面的应用。
近年来，报道了许多制备矿化水凝胶的方法。同时，研究显示，矿化水凝胶中沉积的低结晶度羟基磷灰石可一方面提高凝胶的力学强度，另一方面提高凝胶与天然骨之间的结合能力。(Nonoyama,T.；Wada,S.；Kiyama,R.；Kitamura,N.；Mredha,M.T.I.；Zhang,X.；Kurokawa,T.；Nakajima,T.；Takagi,Y.；Yasuda,K.；Gong,J.Double-Network HydrogelsStrongly Bondable to Bones by Spontaneous OsteogenesisPenetration.Adv.Mater.2016,28,6740-6745.)不久前，我们已经在体内实现了高强度矿化水凝胶对于2D颅骨修复。(Xu,B.；Zheng,P.；Gao,F.；Wang,W.；Zhang,H.；Zhang,X.；Feng,X.；Liu,W.A Mineralized High Strength and Tough Hydrogel for Skull Bone Regeneration.Adv.Funct.Mater.2017,27,1604327.)但与2D骨缺损不同，简单有效的3D骨缺损修复方法仍然鲜有报道。(Bouyer,M.；Guillot,R.；Lavaud,J.；Plettinx,C.；Olivier,C.；Curry,V.；Boutonnat,J.；Coll,J.L.；Peyrin,F.；Josserand,V.；Bettega,G.；Picart,C.Surface Delivery of Tunable Doses of BMP-2from an Adaptable PolymericScaffold Induces Volumetric Bone Regeneration.Biomaterials 2016,104,168-181.)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供高强度矿化水凝胶及其在骨修复中的应用，具体为管状N-丙烯酰基甘氨酰胺-乙烯基膦酸-羟基磷灰石(P(NAGA-VPA)/HAp)，该材料除了具有传统水凝胶的特性外，还有与骨良好结合并促进骨修复的能力。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
高强度矿化水凝胶，由水凝胶和羟基磷灰石组成，水凝胶由单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸在水中通过自由基共聚制备；以氯化钙和磷酸为原料，在调节为碱性的N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸的共聚水凝胶中沉淀结晶产生羟基磷灰石，形成高强度矿化水凝胶。
在上述技术方案中，N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸的质量比(8—10)：1，优选(9—10)：1。N-丙烯酰基甘氨酰胺(NAGA)是一种带有双氨基的单体，在聚合后形成强氢键作用，为凝胶基体提供物理交联作用，乙烯基膦酸(VPA)是一种带有膦酸基团单体，为凝胶基体提供矿化能力。
在上述技术方案中，在制备水凝胶的体系中，初始水凝胶的固含量为20—30％，优选25—30％；初始水凝胶的固含量是指N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸质量之和与N-丙烯酰基甘氨酰胺、乙烯基膦酸和水质量之和的比例，即(N-丙烯酰基甘氨酰胺+乙烯基膦酸)/(N-丙烯酰基甘氨酰胺+乙烯基膦酸+水)。
在上述技术方案中，在制备水凝胶的体系中，反应容器为内部插入不锈钢管的四氟乙烯管。
在上述技术方案中，将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，然后将水凝胶浸入氨水中，以使共聚水凝胶为碱性并在共聚水凝胶中沉淀结晶产生羟基磷灰石。
在氯化钙和磷酸的混合水溶液中，元素钙和元素磷的摩尔比为(1.5—1.8)：1，优选(1.6—1.7)：1。
将N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸制备的共聚水凝胶浸泡于氯化钙和磷酸的混合水溶液中，以使氯化钙和磷酸浸入共聚水凝胶，浸泡温度为20—25摄氏度，浸泡时间为10—80小时，优选24—60小时。
将水凝胶浸入氨水中，氨水的质量百分数为15％，浸泡2—6小时，优选4—6小时，以调节凝胶管内部pH值至9—10，室温20—25摄氏度下在其内部沉积羟基磷灰石。
在沉积羟基磷灰石后，将水凝胶置于氯化钙水溶液中以使羟基磷灰石步熟化，温度为室温20—25摄氏度，时间为2—6小时，优选4—6小时，氯化钙的浓度为750mM。
在完成制备后，将矿化凝胶管浸于去离子水中，直至平衡，形成高强度矿化凝胶管。
在上述技术方案中，引发剂若选用如偶氮二异丁腈(ABIN)、过氧化苯甲酰(BPO)等热引发剂，则需要首先通入惰性气体排除反应体系中的氧，以避免其的阻聚作用，再根据引发剂的活性和用量，将反应体系加热到所用引发剂的引发温度之上并保持1h以上或者更长(1-5h)时间，以促使引发剂能够长时间产生足够多的自由基，引发反应体系持续发生自由基聚合反应，最终制备本发明的水凝胶。若选用如1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2′,2′-二甲基乙酮(Irgacure 2959)、甲基乙烯基酮、安息香等光引发剂，则必须选用透明密闭的反应容器，在紫外光照射的条件下引发自由基聚合，由于光引发效率高于热引发，因根据所选引发剂的活性和用量调整照射时间时，照射时间可选用20分钟或者更长(30min-1h)。
在上述技术方案中，引发剂用量为两种单体N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸质量之和的1—5％，优选3—5％。
在本发明的技术方案中，N-丙烯酰基甘氨酰胺(NAGA)是一种在聚合后可在聚合物分子链间形成强物理氢键作用的单体，乙烯基膦酸(VPA)是一种可提高基体矿化能力的单体，二者通过简单的共聚合可形成具有潜在矿化能力的凝胶基体。这种高强度矿化凝胶管为治疗体积骨缺损提供了一种简单有效的方法。本发明提供的一种高强度矿化水凝胶管的凝胶基体是以N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸为原料，在引发剂存在条件下共聚制成(在无氧条件下通过引发剂引发N-丙烯酰基甘氨酰胺和乙烯基膦酸分子上的不饱和键发生自由基聚合反应制备出初始共聚凝胶管)，羟基磷灰石是通过钙磷离子在凝胶内部原位沉积形成。由于凝胶结构中存在氢键形成的物理交联作用和羟基磷灰石与凝胶基体离子交联的双重作用，这种矿化水凝胶管具有良好的拉伸和压缩性能。同时由于羟基磷灰石的存在，提高了凝胶管的骨结合和骨修复能力。
附图说明
图1是本发明的管状P(NAGA-VPA)/HAp水凝胶的图片。
图2是本发明的P(NAGA-VPA)/HAp水凝胶的红外谱图。
图3是本发明的P(NAGA-VPA)/HAp水凝胶的扫描电镜。
图4是本发明的P(NAGA-VPA)/HAp水凝胶的XRD数据谱线图。
图5是利用本发明的管状P(NAGA-VPA)/HAp水凝胶修复大鼠桡骨缺损的手术图片。
图6是利用本发明的管状P(NAGA-VPA)/HAp水凝胶修复大鼠桡骨缺损8周后染色结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。本发明实施例中使用药品和仪器均为市售或者实验室使用的常规药品和设备，N-丙烯酰基甘氨酰胺是以丙烯酰氯和甘氨酰胺为原料依据参考文献制备，这里不再赘述，详见Dai,X.；Zhang,Y.；Gao,L.；Bai,T.；Wang,W.；Cui,Y.；Liu,W.A Mechanically Strong,Highly Stable,Thermoplastic,andSelf-Healable Supramolecular Polymer Hydrogel.Adv.Mater.2015,27,3566-3571。
将单体N-丙烯酰基甘氨酰胺(225mg)，乙烯基膦酸(25mg，25μl，Sigma)加入到4ml离心管中，用750μl的水溶解后加入2.5μl光引发剂IRGACURE-1173(2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮,98％,Sigma)。将含有单体和引发剂的溶剂注入管状模具中(内径1mm，外径1.8mm)，在紫外固化箱(XL-1000UV，Spectronics Corporation)中照射40min，以充分引发自由基聚合。聚合完成后打开模具取出凝胶管浸入氯化钙和磷酸的混合溶液(氯化钙浓度为0.792M，磷酸浓度为0.479M，溶剂为水)中24小时，使离子充分浸入凝胶基质中。而后，将凝胶管放入质量百分数为15％的氨水溶液(氨的水溶液)中4小时，调节凝胶管内部pH值至碱性(pH为9—10)，室温20—25摄氏度下在其内部沉积羟基磷灰石。最终，将凝胶管置于750mM氯化钙水溶液中，使羟基磷灰石进一步熟化，时间为4小时，得到的矿化凝胶管置于去离子水中直至溶胀平衡，制备的管状矿化水凝胶详见说明书附图1。
利用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR,Spectrum 100 FTIR Spectrometer,PerkinElmer Inc.,USA)测定干燥的矿化凝胶粉末，1000cm
将上述矿化凝胶在液氨中骤冷后冻干，利用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,s4800,Hitachi Ltd.,Japan)对凝胶表面形貌进行观察。在凝胶表面可见羟基磷灰石无机粒子，而同时可以分析矿化凝胶的钙磷比十分接近羟基磷灰石的理论值，详见说明书附图3和下表所示，Li,B.；Wang,Y.；Jia,D.；Zhou,Y.；Cai,W.Mineralization of Chitosan Rodswith Concentric Layered Structure Induced by ChitosanHydrogel.Biomed.Mater.2009,4,015011。
利用X射线衍射仪(XRD,D8Advanced,Bruker,Germany)对干燥的矿化凝胶粉末进行相成分分析。根据PDF#46-0905(Hutchens,S.A.；Benson,R.S.；Evans,B.R.；O’Neill,H.M.；Rawn,C.J.Biomimetic Synthesis of Calcium-Deficient Hydroxyapatite in aNatural Hydrogel.Biomaterials 2006,27,4661-4670)在26.0°和32.3°处出现的衍射峰分别为晶面(002)和(112)，且其均属于羟基磷灰石，说明矿化凝胶中存在羟基磷灰石结晶，详见说明书附图4。
用于压缩性能测试的样品的尺寸为直径5mm，高7mm，压缩速率为10mm min
用如下方法检测本发明在体内促进骨再生并与骨之间形成结合的效果。实验前，用质量分数为6％的水合氯醛水溶液将雄性SD大鼠麻醉，并用碘伏彻底消毒手术区域，脱毛后用医用酒精彻底去除表皮的碘伏。在大鼠左前肢桡骨上方制造一个缺口，并切开桡骨上方的肌肉组织，而后用咬骨钳在桡骨上制造2mm缺损，并保留尺骨不受损伤。将凝胶管套于桡骨缺损处后立即缝合肌肉组织和表皮。在植入8周后将凝胶及周围骨组织取出，利用组织染色，观察凝胶与骨的结合以及骨内部新骨的形成状态。结果显示，在矿化凝胶管与骨形成了良好的结合，并且新生成的骨内部有大量的成骨细胞，详见说明书附图5和6，可见本发明的高强度矿化水凝胶在骨修复中的应用。
依照本发明内容进行工艺参数的调整，均可制备本发明的高强度矿化水凝胶，并表现出与实施例基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
高强度矿化水凝胶及其在骨修复中的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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