专利摘要

本发明提供了一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法，属于生物医药技术领域，包括：将透明质酸衍生物、多肽和微生物转谷氨酰胺酶在缓冲液中混合后，将得到的混合液在25～40℃下水浴2h以上，实现透明质酸定点修饰多肽；所述透明质酸衍生物包括HA‑NH2或HA‑Q。本发明中的HA‑NH2和HA‑Q经微生物转谷氨酰胺酶催化，可实现对多肽的定点修饰，修饰得到的产物，与未修饰的多肽相比，半衰期显著延长、生物利用度显著提高、生物活性无明显变化。

权利要求

1.一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法，其特征在于，步骤如下：将透明质酸衍生物、多肽和微生物转谷氨酰胺酶在缓冲液中混合后，将得到的混合液在25～40℃下水浴2h以上，实现透明质酸定点修饰多肽；

所述透明质酸衍生物包括HA-NH2或HA-Q；

所述HA-NH2是在透明质酸的还原末端引入单一活性氨基后得到；

所述HA-Q的制备包括：含单一谷氨酰胺残基的小肽的羧基经碳二亚胺/N-羧基琥珀酰亚胺活化后，与所述HA-NH2以酰胺键共价结合，得到HA-Q；

所述含单一谷氨酰胺残基的小肽为NR1-QX1-COOH、NR1-Q-X1-X2-COOH、NR1-X1-Q-X2-COOH、NR1-Q-X1-X2-X3-COOH、NR1-X1-Q-X2-X3-COOH或NR1-X1-X2-Q-X3-COOH；

其中R1为N-端保护基团；

X1、X2、X3为谷胺酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸之外的任一氨基酸残基；

所述Q为谷氨酰胺；

所述多肽为TP5、ES2-TH和PCK3145；

所述TP5的氨基酸序列为RKDVY，ES2-TH的氨基酸序列为IVRRADRAAVPGGCGKRK，PCK3145的氨基酸序列为EWQTDNCETCTCYGT。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明质酸的重均分子量小于50kD。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述透明质酸衍生物为HA-NH2时，所述多肽含有谷氨酰胺残基。

4.根据权利要求1或 3所述的方法，其特征在于，所述混合液中多肽的含量 0 .5～

10 .0mg/mL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合液中的HA-NH2含量为多肽摩尔质量的0 .5～1 .5倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-端保护基团包括芐氧羰基、叔丁氧羰基或对甲氧基芐基。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述透明质酸衍生物为HA-Q时，所述多肽含有赖氨酸残基。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述混合液中多肽的含量为0 .5～

10 .0mg/mL；

所述混合液中的HA-Q含量为多肽摩尔质量的0 .5～1 .5倍。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液中微生物转谷氨酰胺酶的含量为0 .01～5U/mL。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域技术领域，尤其涉及一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法。

背景技术

多肽一般指数量不等的α-氨基酸以肽键连接形成的化合物，作为药物具有生物活性机制明确、特异性高、毒副作用低等优点，临床上广泛用于刺激造血、抗肿瘤、免疫调节等。然而多肽类药物体内半衰期普遍较短，需要高剂量、频繁用药，极大增加了用药成本，降低了患者的用药依从性。对多肽分子结构进行修饰是解决半衰期短的常用方法，其中聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化学修饰是应用最为广泛的方法。但PEG为非生物可降解的，体内易蓄积，不适合大剂量、长期用药；此外PEG化学法修饰效率低，且难以实现定点修饰；所得PEG修饰产物活性常常显著降低、缺乏靶向性。因此，迫切需要开发新型的聚合物和修饰策略用于提升多肽药物的临床疗效。

HA属于糖胺聚糖家族，是一种天然亲水性高分子聚合物，具有良好的生物可降解性、生物相容性等独特的性质；肿瘤细胞表面存在HA特定的受体，HA修饰可实现药物的靶向输送，故具有开发成为多肽修饰剂的潜力。然而,受HA固有结构特征的限制，现有化学方法反应步骤多、条件剧烈且难以实现定点修饰。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法，采用本发明的方法可实现对多肽的定点修饰。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法，包括：将透明质酸衍生物、多肽和微生物转谷氨酰胺酶在缓冲液中混合后，将得到的混合液在25～40℃下水浴2h以上，实现透明质酸定点修饰多肽；

所述透明质酸衍生物包括HA-NH2或HA-Q；

所述HA-NH2是在透明质酸的还原末端引入单一活性氨基后得到；

所述HA-Q的制备包括：含单一谷氨酰胺残基的小肽的羧基经碳二亚胺/N-羧基琥珀酰亚胺活化后，与所述HA-NH2以酰胺键共价结合，得到HA-Q。

优选的，所述透明质酸的重均分子量小于50kD。

优选的，当所述透明质酸衍生物为HA-NH2时，所述多肽含有谷氨酰胺残基。

优选的，所述混合液中多肽的含量为0.5～10.0mg/mL。

优选的，所述混合液中的HA-NH2含量为多肽摩尔质量的0.5～1.5倍。

优选的，所述含单一谷氨酰胺残基的小肽为NR1-Q-X1-COOH、NR1-Q-X1-X2-COOH、NR1-X1-Q-X2-COOH、NR1-Q-X1-X2-X3-COOH、NR1-X1-Q-X2-X3-COOH或NR1-X1-X2-Q-X3-COOH；

其中R1为N-端保护基团；

X1、X2、X3为谷胺酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸之外的任一氨基酸残基；

所述Q为谷氨酰胺。

优选的，所述N-端保护基团包括芐氧羰基、叔丁氧羰基或对甲氧基芐基。

优选的，当所述透明质酸衍生物为HA-Q时，所述多肽含有赖氨酸残基。

优选的，所述混合液中多肽的含量为0.5～10.0mg/mL；

所述混合液中的HA-Q含量为多肽摩尔质量的0.5～1.5倍。

优选的，所述混合液中微生物谷氨酰胺转移酶的含量为0.01～5U/mL。

本发明提供了一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法，包括：将透明质酸衍生物、多肽和微生物转谷氨酰胺酶在缓冲液中混合后，将得到的混合液在25～40℃下水浴2h以上，实现透明质酸定点修饰多肽；所述透明质酸衍生物包括HA-NH2或HA-Q；所述HA-NH2是在透明质酸的还原末端引入单一活性氨基后得到；所述HA-Q的制备包括：含单一谷氨酰胺残基的小肽的羧基经碳二亚胺/N-羧基琥珀酰亚胺活化后，与所述HA-NH2以酰胺键共价结合，得到HA-Q。本发明中的HA-NH2和HA-Q经多肽经微生物转谷氨酰胺酶催化后，可实现对多肽的定点修饰，修饰得到的产物，与未修饰多肽相比，半衰期显著延长、生物利用度显著提高、生物活性无明显变化。

附图说明

图1是实施例1和2分别制得的HA-NH2和HA-Q的合成路线图；

图2是HA-TP5的纯度HPLC色谱图；

图3是HA-PCK3145的纯度HPLC色谱图；

图4是HA-ES2-TH的纯度HPLC色谱图；

图5是TP5(A)和HA-TP5(B)在小鼠体内的药物浓度-时间曲线图；

图6是PCK3145(A)和HA-PCK3145(B)在小鼠体内的药物浓度-时间曲线图；

图7是ES2-TH(A)和HA-ES2-TH(B)在小鼠体内的药物浓度-时间曲线图；

图8是HA-TP5的体外活性结果；

图9是HA-PCK3145的体外活性结果；

图10是HA-ES2-TH的体外活性结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法，包括：将透明质酸衍生物、多肽和微生物转谷氨酰胺酶在缓冲液中混合后，将得到的混合液在25～40℃下水浴2h以上，实现透明质酸定点修饰多肽；所述透明质酸衍生物包括HA-NH2或HA-Q；所述HA-NH2是在透明质酸的还原末端引入单一活性氨基后得到；所述HA-Q的制备包括：含单一谷氨酰胺残基的小肽的羧基经碳二亚胺/N-羧基琥珀酰亚胺活化后，与所述HA-NH2以酰胺键共价结合，得到HA-Q。

在本发明中，所述HA为透明质酸，所述透明质酸的重均分子量优选小于50kD，更优选为2～10kD。本发明对所述透明质酸的来源没有特殊限定，采用常规市售产品。

在本发明中，所述透明质酸优选与己二胺通过还原胺化反应，在透明质酸的还原末端引入单一活性氨基，所述还原末端优选为透明质酸的末端半缩醛。本发明对所述透明质酸和己二胺参加反应使用的量和反应的条件没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，当所述透明质酸衍生物为HA-NH2时，所述混合液中微生物转谷氨酰胺酶的含量优选为为0.01～5U/mL，更优选为0.5～2.0U/mL；所述混合液中多肽的含量为0.1～10mg/mL；所述混合液中的HA-NH2含量为多肽摩尔质量的0.5～1.5倍。在本发明中，所述混合液优选在25～40℃下进行水浴，更优选在37℃下进行水浴。本发明对所述缓冲液的组分和含量没有特殊限定，采用常规即可，所述缓冲液的pH值优选为6～8，更优选为7.2。在本发明中，所述多肽含有谷氨酰胺残基，所述多肽优选为5～50肽，更优选为6～20肽。本发明对所述微生物转谷氨酰胺酶的来源没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述HA-NH2定点修饰多肽的机理为：微生物转谷氨酰胺酶能够催化蛋白质多肽链的谷氨酰胺(受体)残基的侧链与赖氨酸残基的ε-氨基(供体)之间发生特异转氨反应，从而以新的酰胺键连接，本发明将酶的底物拓展为连接氨基供体的HA，实现了对活性多肽的谷氨酰胺残基的定点修饰。

在本发明中，所述含单一谷氨酰胺残基的小肽优选为NR1-Q-X1-COOH、NR1-Q-X1-X2-COOH、NR1-X1-Q-X2-COOH、NR1-Q-X1-X2-X3-COOH、NR1-X1-Q-X2-X3-COOH或NR1-X1-X2-Q-X3-COOH；其中R1为N-端保护基团，优选包括芐氧羰基、叔丁氧羰基或对甲氧基芐基；X1、X2、X3优选为谷胺酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸之外的任一氨基酸残基，更优选为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；所述Q为谷氨酰胺。在本发明中，谷胺酰胺、赖氨酸为修饰对象，应避免引入；天冬氨酸、谷氨酸含两个羧基，会影响合成含单一的HA-Q。

本发明对所述小肽的羧基经碳二亚胺/N-羧基琥珀酰亚胺活化的条件没有特殊限定，采用常规活化条件即可。

本发明对所述缓冲液的组分和含量没有特殊限定，采用常规即可，所述缓冲液的pH值优选为6～8，更优选为7.2。

本发明对所述活化后的小肽和HA-NH2以酰胺键共价结合的使用量和反应的条件没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，当所述透明质酸衍生物为HA-Q时，所述混合液中微生物谷氨酰胺转移酶的含量优选为0.01～5U/mL，更优选为0.5～2.0U/mL；所述混合液中多肽的含量为0.1～10mg/mL；所述混合液中的HA-Q含量为多肽摩尔质量的0.5～1.5倍。在本发明中，所述多肽含有赖氨酸残基，所述多肽优选为5～50肽，更优选为6～20肽。本发明对所述微生物转谷氨酰胺酶的来源没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述HA-Q定点修饰多肽的机理为：微生物转谷氨酰胺酶能够催化蛋白质多肽链的谷氨酰胺(受体)残基的侧链与赖氨酸残基的ε-氨基(供体)之间发生特异转氨反应，从而以新的酰胺键连接，本发明将酶的底物拓展为连接谷氨酰胺受体的HA，实现了对活性多肽的赖氨酸残基的定点修饰。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

HA-NH2的制备：

HA经双氧水降解、冻干得到重均分子量Mw＝7.98kDa的低子量HA，即平均每个HA分子由18个双糖重复单元组成。称取2g的上述HA溶于50mL双蒸水中，再加入加5mL 1,6-己二胺(HMD)，充分溶解，室温反应2h；加入750mg的氰基硼氢化钠，室温继续反应12h；反应液以Superdex 30凝胶柱层析纯化，得到的样品溶液旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机冻干，得到HA-NH2固体样品。

1HNMR分析表明，在δ＝1.35ppm、δ＝1.60ppm和δ＝2.90ppm处出现了三个积分值相近的信号峰，分别对应HMD的α-H、β-H和γ-H，说明HA与HMD共价结合；根据δ＝2.0ppm的乙酰基氢信号与HMD的α-H、β-H和γ-H信号的积分比，可确定制得的HA-NH2系HA与HMD按分子比1:1构成的单一组分。

实施例2

HA-Q的制备：

称取135mg二肽N-苄氧羰基-谷氨酰胺-甘氨酸溶于100mL乙腈:硼酸缓冲液(2:3，v/v)的混合液，依次加入192mg EDC、135mgNHS，活化1h；取1.5g实施例1制备得到的HA-NH2溶于反应液中，室温反应18h；加入25mg琥珀酸酐，室温静置24h以中止反应；反应液用Superdex30凝胶柱纯化，得到的样品溶液于3旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机冻干，得到HA-Q固体样品，反应产率为86.9％。

1HNMR分析发现，其在δ＝7.45–7.25ppm处新增的特征信号峰，表明谷氨酰胺残基成功结合于HA的末端，生成HA-Q产物；根据亚甲基的氢信号与苯环的氢信号积分比，可确定制得的HA-Q是HA-NH2与含谷氨酰胺的二肽按分子比1:1构成的单一组分。

实施例3

酶法HA定点修饰胸腺五肽(TP5)

称取10mg TP5(氨基酸序列为RKDVY)、100mg实施例2制得的HA-Q别溶于20mL PBS缓冲液中，加入1U微生物转谷氨酰胺酶(mTGase)溶液，于37℃水浴反应12h；反应液以0.22μm滤膜过滤，以Superdex30凝胶柱层析纯化，收集的样品溶液以旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机冻干得到固体样品HA-TP5，产率达82.7％。

以C18反向色谱柱-HPLC检测HA-TP5纯度为95.1％。1H NMR分析发现，HA-TP5较HA在δ＝7.02ppm和δ＝6.73ppm处新增TP5酪氨酸残基中苯环的特征吸收峰，在δ＝3.78ppm处出现TP5氨基酸的α-H信号峰，在δ＝0.99ppm处出现TP5缬氨酸的甲基信号峰，故产物为TP5的赖氨酸被HA定点修饰；根据缀合物HA的异头氢信号峰与氨基酸α-H信号峰积分值可知HA-TP5中HA与TP5按分子比1:1构成。

实施例4

酶法HA定点修饰ES2-TH

称取10mg ES2-TH(氨基酸序列为IVRRADRAAVPGGCGKRK)和50mg实施例2制得的HA-Q于10mL PBS缓冲液中，加1U mTGase，于37℃水浴反应12h；反应液以0.22μm滤膜过滤，以ODS反向色谱柱纯化，得到的样品溶液于旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机冻干，最终得到固体样品HA-ES2-TH，产率为85.0％。

以C18反向色谱柱-HPLC检测其纯度为92.1％。1H NMR分析发现δ＝3.76-3.94ppm的信号峰归属ES2-TH各个氨基酸α-H，在δ＝2.56ppm信号峰归属赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的与N或S原子直接相连的亚甲基，在δ＝1.21ppm出现的信号峰为异亮氨酸与缬氨酸中甲基，表明ES2-TH的赖氨酸被HA定点修饰成功；根据缀合物HA的异头氢与ES2-TH氨基酸的α-H信号峰的积分比可知HA-ES2-TH中HA与肽以分子比1:1构成。

实施例5

酶法HA定点修饰PCK3145

称取10mg PCK3145(氨基酸序列为EWQTDNCETCTCYGT)和50mg HA-NH2溶于10mLPBS缓冲液中，加1U mTGase，于37℃水浴反应12h；反应液以0.22μm滤膜过滤，以ODS反向色谱柱纯化，得到的样品溶液于旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥机冻干，得固体样品HA-PCK3145，反应产率为81.7％。

以C18反向色谱柱-HPLC上检测其纯度为88.3％。1H NMR分析表明，在δ＝8.32ppm处出现PCK3145酪氨酸和色氨酸的苯环特征吸收峰；δ＝3.88-3.77ppm处出现PCK3145各个氨基酸的α-H信号峰，δ＝2.51ppm处出现谷氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬氨酸残基的特征信号峰，表明PCK3145的谷氨酰胺残基被HA定点修饰。根据缀合物HA的异头氢与氨基酸α-H的氢信号峰积分比可知HA与PCK3145的分子比为1:1。

实施例6

HA-多肽的体内药代动力学特征

为比较实施例3～5制得的三种不同HA-多肽缀合物及对应的未修饰多肽的药代动力学特征，选用BALB/c小鼠作为动物模型，随机分组，每组6只，空白组小鼠尾静脉注射400μL PBS缓冲液，各实验组小鼠尾静脉注射400μL样品溶液，在不同的时间点摘眼球取血，每只小鼠取500μL血液加750μL乙腈，涡旋3min混匀，1000r·min-1离心10min，取上清液以激发波长280nm、发射波长490nm检测其荧光强度。经药代动力学软件分析，各样品在小鼠体内的药代动力学行为符合二室模型。

根据图5可知，HA-TP5的体内分布半衰期t1/2α、消除半衰期t1/2β为4.011min、224.5min，与TP5相比(0.5032min、29.45min)，分别延长了8.0、7.6倍；其药时曲线下面积AUC0-较TP5(2382μg·mL-1·min vs 193.5μg·mL-1·min)提高12.3倍；平均驻留时间MRT0-较TP5(319.6minvs 41.5min)延长7.7倍，因此HA-TP5较未修饰的TP5具有更长的半衰期、更好的生物利用度。

根据图6可知，HA-PCK3145在小鼠体内的t1/2α、t1/2β为57.58、3032min，与PCK3145相比(22.37、219.5min)，分别延长2.6倍、13.8倍；其AUC0-较PCK3145(6717μg·mL-1·minvs1689μg·mL-1·min)提高4.0倍；MRT0-较PCK3145(3811minvs 270.9min)延长14倍。因此HA-PCK3145相较于PCK3145具有更长的半衰期、更好的生物利用度。

根据图7可知，HA-ES2-TH在小鼠体内的t1/2α、t1/2β为34.99min、1703min，与ES2-TH相比(17.46min、243.3min)，分别延长2.0倍、7.0倍；其AUC0-较ES2-TH(2958μg·mL-1·minvs 510.5μg·mL-1·min)提高5.8倍；MRT0-较ES2-TH(1976minvs 243.2min)延长9.1倍。总之，HA-ES2-TH相较于ES2-TH具有更长的半衰期、更好的生物利用度。

实施例7

HA-多肽的体外活性测定

根据实施例3～5制备得到的三种多肽的体外生物活性，采用MTT法测定HA-多肽对不同细胞的影响。

取BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死，以75％酒精浸泡10min，取出脾脏放入盛有Hank’s液的培养皿中，研磨制备脾细胞悬液，并以RPMI1640(含10％FBS，1％青链霉素混合液)调整细胞密度为107·mL-1。在96孔板上每孔加100μL细胞悬液、100μL不同浓度的TP5、HA-TP5溶液，每种溶液设置3个复孔，以37℃、5％CO2条件下培养48h。每孔加入20μL 0.5％MTT溶液，继续培养4h，吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振摇10min后使用Synergy H1全功能酶标仪检测96孔板在570nm处吸光值A以测定其活性。

由图8的结果可以清楚看出，不同浓度HA-TP的促增殖指数均显著高于阴性对照组，表明其可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.05)，HA-TP的促增殖率与相同浓度的TP5相比无显著差异(P>0.05)，即HA修饰对P5的体外免疫活性影响不大。

取培养至对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7，以含有10％FBS的DMEM培养基调整细胞浓度至6ⅹ104·mL-1。在96孔板上每孔加100μL细胞悬液、100μL不同浓度的PCK3145或HA-PCK3145溶液，每种溶液设置5个复孔，以37℃、5％CO2条件下培养48h。每孔加入20μL 0.5％MTT溶液，继续培养4h，吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振摇10min后使用SynergyH1全功能酶标仪检测96孔板在570nm处吸光值A以测定其活性。

由图9的结果可以清楚看出，与阴性对照组相比，不同浓度的HA-PCK3145均具明显的降低肿瘤细胞增殖的作用，表明其体外具有极显著的抗人乳腺癌细胞增殖作用(P<0.01)，相同浓度的HA-PCK3145与PCK3145的抗肿瘤细胞增殖活性相当(P>0.05)，因此HA修饰对PCK3145体外抗肿瘤活性影响不大。

(3)HA-ES2-TH的体外抗血管内皮细胞增殖活性

取培养至对数生长期的血管内皮细胞EAhy926，以含有10％FBS的DMEM培养基调整细胞浓度至6ⅹ104·mL-1。在96孔板上每孔加100μL细胞悬液、100μL不同浓度的HA-ES2-TH与ES2-TH、ES2溶液，每种溶液设置5个复孔，以37℃、5％CO2条件下培养48h。每孔加入20μL0.5％MTT溶液，继续培养4h，吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振摇10min后使用Synergy H1全功能酶标仪检测96孔板在570nm处吸光值A以测定其活性。

由图10的结果可以清楚看出，与阴性对照组相比，不同浓度的HA-ES2-TH均具明显的降低内皮细胞增殖的作用，表明其在体外具有极显著的抗血管内皮细胞增殖作用(P<0.01)，相同浓度的HA-ES2-TH与ES2-TH、ES2的抗肿瘤细胞增殖活性相当(P>0.05)，因此HA修饰对ES2-TH体外抗血管生成活性影响不大。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的HA-NH2和HA-Q经多肽经微生物谷氨酰胺转移酶催化后，可实现对多肽的定点修饰，修饰得到的产物，与未修饰相比，半衰期显著延长，生物利用度显著提高，对生物活性无明显影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种基于酶催化透明质酸定点修饰多肽的方法专利购买费用说明

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1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。