专利摘要

本发明属于生物工程领域富含多不饱和脂肪酸的微生物油脂分提制备方法。该方法以产油微生物发酵提取的微生物油脂为原料，制备脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，加入萃取剂进行连续二次低温萃取，离心后取有机溶剂相旋转蒸发后可得富含多不饱和脂肪酸油脂，固形物用于微生物柴油，实现了微生物油脂高效利用和多不饱和脂肪酸简单快速富集。本发明具有成本低，多不饱和脂肪酸收率高、反应设备简单、易于大规模应用等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物油脂（Microbial oil）的高效利用和多不饱和脂肪酸（PUFAs）简单快速富集工艺，属于生物工程领域。具体涉及从微生物油脂中获得多不饱和脂肪酸和微生物柴油，是生物工程下游过程中分离提取技术领域。

背景技术

目前对微生物油脂研究和开发主要集中在利用微生物生产高附加值的特殊用途功能性油脂方面。利用微生物可生产含各种类型脂肪酸油脂，有单不饱和脂肪酸，如棕榈油酸、油酸等；多不饱和脂肪酸，如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。这些具有特殊生物功能和特殊用途的功能性油脂在促进人类健康方面具有越来越重要的作用（Erwin J. et al. Science, 1964; Ward O.P. et al. INFORM. 1995）。现在用于生产多不饱和脂肪酸的微生物主要为藻类、酵母、细菌和霉菌，由于细菌产量低，所以目前主要集中在藻类、酵母和霉菌。

在各种藻类中，金藻纲、黄藻纲、硅藻纲、绿藻纲、隐藻纲和甲藻纲中的藻类都能产生高含量多不饱和脂肪酸。

常见的产油酵母有：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)、产油油脂酵母(Lipomy slipofer)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)等。

常见的产油霉菌有：土霉菌((Asoergullus terreus)、紫瘫麦角菌(Claviceps purpurea)、高梁褶孢黑粉菌(Tolyposporium)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)等。

利用微生物生产油脂具有很多优点：微生物细胞生长繁殖快、生产周期短、代谢活动旺盛、易于培养；生长所需原料丰富，价格便宜，如淀粉和糖类，还可利用食品工业和造纸行业废弃物，如废糖蜜、木材糖化液等，从而减少环境污染。用微生物发酵生产油脂，比传统农业生产油脂所需劳动力少，且不受季节和气候变化影响，能连续大规模生产，这些优点为微生物油脂生产提供广阔前景。同时，由于天然ARA、EPA、DHA 多存在于海洋动物油脂中，资源十分有限，很难从海洋动物油脂中大量获取多不饱和脂肪酸，因此利用微生物生产多不饱和脂肪酸具有重要意义。由于微生物油脂成分十分复杂，为了获取多不饱和脂肪酸就必须对油脂进行分提。

油脂分提的目的就是将油脂中的固体脂和液体油在一定的温度下分离出来。油脂分提方法一般包括:

1、干法分提法(又称常规法)  干法分提是最简单和经济的油脂分提结晶工艺,不需要化学试剂,无废水,无损耗。随着冷冻结晶技术和分离设备的不断发展,干法分提工艺在油脂工业中将变得越来越重要,应用领域越来越广泛,尤其是新的过滤设备、离心机和结晶分提装置的发展,给干法分提带来更大的希望。

油脂干法分提是基于不同类型的甘油三酸酯的熔点或在不同温度下其互溶度不同,通过油脂冷却结晶,以达到固、液分离的目的。分提过程包括三个阶段: ①液体或熔化的甘油三酸酯冷却产生晶核；②晶体成长；③固、液相分离、离析和提纯。

2、湿法分提法  即利用溶剂结合其他手段进行油脂分提，常用的方法有：

（1） 超临界CO₂萃取法  陈文利等（精细化工中间体，2003）采用超临界CO₂ 萃取技术提取被孢霉菌体油脂，研究在超临界状态下，温度、压力、夹带剂与时间对油脂萃取率的影响，并分析对油脂成分的影响，从实际结果确定的优惠工艺条件为：萃取压力为13 MPa，萃取温度为32℃，时间为70 min，甲醇10%。此时油脂得率达到37.45%， 花生四烯酸含量达到15.68%。毛灿等（中国专利 96109525.3）将鱼油皂化，酯化和用超临界流体萃取等步骤制备二十二碳六烯酸酯（DHA）和二十碳五烯酸酯（EPA）。

（2） 微波萃取法  符嫦娥等（华东理工大学学报，2006）采用微波萃取对绿藻ARA 进行提取与纯化研究，发现微波功率、辐射时间和溶剂用量3个因素对萃取效果有较大影响。当温度为0℃，脲酯摩尔比（nU∶nFA ）为10∶1，V （乙醇溶液(w = 0.35) ）∶V （正己烷）= 1∶2作溶剂，多不饱和脂肪酸（PUFAs）以甲酯或乙酯型作为脲包客体时，富集效果最为理想，富集后的产物中多不饱和脂肪酸的含量可以达到50% 左右。

（3） 尿素包合法  李丽娜等（黑龙江八一农垦大学学报，2010）、陈文利（浙江化工，2003），李学坤等（云南化工，2006）分别研究了尿素包合法富集不饱和脂肪酸。袁成凌等（食品科技 2002）用尿素包合法（脲包法）对微生物油脂中的ARA进行富集，得到较佳操作条件：以甲醇作为溶剂，脂肪酸为脲包客体，脂肪酸∶尿素∶甲醇为1∶2∶8，反应温度为-10℃。一次富集产品中，ARA浓度从38.29%提高到78.97%，总收率达到90%以上。

（4）水酶法  黄和等（中国专利201010214592.9）用蒸馏水将发酵菌体稀释制成菌体悬浮液，调节悬浮液pH值，加入生物酶恒温振荡6-10小时后，加入乙醇和正己烷进行油脂萃取，离心分层后取有机溶剂相富集ARA。

但是这些富集多不饱和脂肪酸的方法存在着种种缺点与不足，难以批量提取。多不饱和脂肪酸干法分提对效果不明显；超声提取所需功率大，处理规模小；超临界萃取，设备复杂，生产成本高，仅限于实验室规模。脲包法处理效率不高。水酶法单一酶解效率不高，多步酶解工艺较复杂等。

发明内容

微生物油脂多不饱和脂肪酸富集工艺，反应步骤简单，产品易分离，设备要求低，富集效果好，且副产高质量微生物柴油。本发明目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种高效、低成本的多不饱和脂肪酸富集工艺路线。

本发明可以通过以下技术方案来达到：

微生物油脂多不饱和脂肪酸富集工艺，其步骤为：

（1）产油微生物发酵提取的微生物油脂，经转酯反应得脂肪酸甲酯或乙酯；

（2）向脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯中加入1-8倍体积的萃取剂，充分混合均匀后降温至-15℃--45℃，静置8-12h，固、液相抽滤分离。

（3）将液相继续降温至-50℃--80℃，静置5-10h，固、液相抽滤分离，液相旋转蒸发回收溶剂，即得富含多不饱和脂肪酸油脂。

（4）二次抽滤固相合并即为微生物柴油。

上述步骤（1）中的转酯化试剂为KOH-甲醇（乙醇）溶液或甲醇钠（乙醇钠）溶液。

上述步骤（2）的萃取剂为乙醇、正己烷、石油醚、丙酮中的任意一种或几

种。

上述步骤（2）、（3）采用二次连续降温，固液分离获得富含多不饱和脂肪酸油脂。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

（1）本发明利用微生物脂肪酸甲酯或乙酯在不同溶剂中其熔点和互溶性不同，采用二次连续降温的方法富集多不饱和脂肪酸甲酯或乙酯，效率大大提高，单一多不饱和脂肪酸甲酯或乙酯含量达到25%-83%。

（2）本发明以微生物脂肪酸甲酯或乙酯为原料富集多不饱和脂肪酸甲酯或乙酯，同时获得高质量微生物柴油，操作简便，大大降低生产成本，简化工艺流程。

（3）原料来源丰富，对含有富含ARA、EPA或DHA的微生物油脂均有很好的富集作用。

具体实施方式

实施例一

取高山被孢酶发酵后经甲酯化处理的油脂88.13 g （ARA甲酯含量50.21%），置于圆底烧瓶中，加入4倍体积的乙醇正己烷混合液（体积比1∶10），氮气保护升温至75℃，待油脂完全溶解后，将烧瓶置于-30℃冰箱中冷却结晶10 h。上清液（油脂含量67.07 g，ARA甲酯含量56.79%，ARA回收率86.07%）转移至烧瓶继续降温，-80℃冷却结晶8 h，上清液旋转蒸发回收溶剂，得油脂40 g，ARA甲酯含量83.76%，ARA回收率87.96%。合并二次冷却固形物得46.23 g。

实施例二

取高山被孢酶发酵后经乙酯化处理的油脂65.18 g （ARA乙酯含量47.21%），置于圆底烧瓶中，加入5倍体积的乙醇石油醚混合液（体积比1∶10），氮气保护升温至75℃，待油脂完全溶解后，将烧瓶置于-40℃ 冰箱中冷却结晶8 h。上清液（油脂含量49.6 g，ARA甲酯含量53.19%，ARA回收率85.73%）转移至烧瓶继续降温，-70℃冷却结晶10 h，上清液旋转蒸发回收溶剂，得油脂30.03 g，ARA甲酯含量75.23%，ARA回收率85.63%。合并二次冷却固形物得33.51 g。

实施例三

取隐甲藻发酵后经甲酯化处理的油脂15.23 g （DHA甲酯含量31.32%），置于圆底烧瓶中，加入6倍体积的甲醇丙酮混合液（体积比1∶100），氮气保护升温至75℃，待油脂完全溶解后，将烧瓶置于-30℃冰箱中冷却结晶9 h。上清液（油脂含量10.6 g，DHA甲酯含量33.01%，DHA甲酯回收率73.3%）转移至烧瓶继续降温，-70℃冷却结晶11 h，上清液旋转蒸发回收溶剂，得油脂6.91 g，DHA甲酯含量45.64%，DHA甲酯回收率66.1%。合并二次冷却固形物得7.63 g。

实施例四

取终极腐霉发酵后经乙酯化处理的油脂20.56 g （EPA乙酯含量10.43%），置于圆底烧瓶中，加入6倍体积的乙醇正己烷混合液（体积比1∶50），氮气保护升温至75℃，待油脂完全溶解后，将烧瓶置于-30℃冰箱中冷却结晶12 h。上清液（油脂含量13.1 g，EPA乙酯含量15.71%，EPA乙酯回收率69.9%）转移至烧瓶继续降温，-80℃冷却结晶10 h，上清液旋转蒸发回收溶剂，得油脂5.99 g，EPA乙酯含量25.64%，EPA乙酯回收率71.6%。合并二次冷却固形物得13.63 g。

一种微生物来源多不饱和脂肪酸制备工艺专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。