专利摘要

本发明公开了一株巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumstrainX3及在植物促生方面的应用。该菌株保藏编号为CGMCCNo.10803，于2015年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；本发明的巨大芽孢杆菌X3以产吲哚乙酸(IAA)分离得到，具备产铁载体、溶磷、产氨、耐盐和抑病特性，可显著促进作物的生长，提高玉米产量。同时菌株X3还能够增加土壤中微生物多样性和微生物丰度。该菌种繁殖速度快，生产工艺简单，抗逆能力强，易保存，利于工业化生产，利用该菌株制备生物肥，既可以防治土传病害又能促进植物生长，应用前景广阔。 CGMCCNo.10803 20150511

权利要求

1.一株巨大芽孢杆菌X3，保藏编号CGMCC No.10803，于2015年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述巨大芽孢杆菌X3，其特征在于其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.制备权利要求1所述的巨大芽孢杆菌X3的方法，其特征在于，该方法依次包括下述步骤：

(1)分离

以广东省广州市天河区华南农业大学农场的土壤为筛选土样，称取筛选土样，放入装有无菌水的三角瓶中，摇床振荡使细胞充分分散，静置20～30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10³～10⁵稀释度，用移液枪分别吸取稀释液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，28℃倒置培养48h，进行斜面保存，备用；

(2)产吲哚乙酸的筛选

产IAA细菌的定性测定：将步骤1)筛选的细菌接种于含有L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃、180rpm条件下摇床培养1d，取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液，将加入50μL IAA的比色液作为阳性对照，白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30min后观察，颜色变红者表示能够产IAA；

培养液中IAA的定量测定：首先用分光光度法测定菌悬液OD₆₀₀值，然后菌悬液以离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置，测定其OD₅₃₀值，采用分析纯的IAA梯度稀释测定方法绘制标准曲线，计算单位体积发酵液中IAA含量。

(3)纯化

将产IAA可达5mg·L^-1的菌株纯化保存，共保存13株菌株，而菌株X3产IAA最高，将筛选出的X3菌利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂斜面培养基上。

4.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在产生长素或/和铁载体或/和产氨方面的应用。

5.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在分解难溶性磷或耐盐方面的应用。

6.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在防治香蕉枯萎病中的应用。

7.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在产过氧化氢酶、淀粉酶和蛋白酶的方面应用。

8.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在促进植物种子发芽方面的应用。

9.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在促进作物生长或/和提高产量方面的应用。

10.权利要求1或2所述巨大芽孢杆菌X3在增加土壤微生物群落多样性或/和增加微生物丰度中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一株巨大芽孢杆菌X3(Bacillus megateriumstrain)及其制备方法、应用。

背景技术

吲哚乙酸(IAA)是产生调节植物生长素的信号物质，是在植物体内普遍存在的生长素，对植物生长起着关键的作用。细菌不仅通过分泌IAA，而还有通过固氮溶磷、产铁载体、抑制土壤病原菌和增加土壤有益微生物等多种途径到达对植物的促生作用。相关专利文献表明，巨大芽孢杆菌SJ-7菌株有解磷解钾和防治真菌病害的功能。巨大芽孢杆菌JX15具备产吲哚乙酸、固氮和溶磷等特性，能够提高肥料利用率，促进花生生长。程园园等筛选的巨大芽孢杆菌WXD-3-1和枯草芽孢杆菌WXD-3-2具有解磷、产IAA和嗜铁素能力，能够促进生菜生长。姜云等筛选出一株高产IAA(10.2mg·L^-1)的苏金云芽孢杆菌，具有解磷、解钾、固氮和产铁载体特性。王西祥等筛选的解淀粉芽孢杆菌GJ3和枯草芽孢杆菌NS178具有较广的抑菌谱，对14种病原菌具有拮抗效果。而目前对高效产IAA、溶磷、拮抗、耐盐、产氨等多功能的巨大芽孢杆菌研究尚未报道。

近年来，研究显示土壤中细菌利用尿素产氨，不仅直接影响土壤中N源的循环利用，并且可以用于酸化土质的改良。王国兴等研究表明有些细菌具有产脲酶能力，通过尿素产氨途径，促进土壤氮的有效化，满足植物生长对N素营养需求，提高植物产量与品质。还有研究表明细菌分泌的多种酶系具有应用价值，马桂珍等筛选出一株产蛋白酶能力较强的地衣芽孢菌GD-2-2，其可水解蛋白质供植物体利用。莫芹等筛选了9株对淀粉有降解能力的细菌分别属于土芽孢杆菌、厌氧芽孢杆菌和芽孢杆菌。陈欣等筛选出一株产过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌，并优化其发酵条件。本研究的菌株X3具有产氨特性，同时还有淀粉酶、蛋白酶和过氧化氢酶特性，对有机物具有良好的转化利用能力，能提高土壤氮有效性，促进作物氮素营养。

目前已有很多文献报道芽孢杆菌产IAA，溶磷，产铁载体，抑菌等有益特征，这些特性与作物生长密切联系。徐文思等筛选出一株产IAA含量达22.6mg·L^-1的巨大芽孢杆菌JX15，施用于花生植株，其鲜重、株高、全氮、磷、钾及花生根系总长度、根表面积和根尖数均有显著增加。程园园等用巨大芽孢杆菌WXD-3-1和枯草芽孢杆菌WXD-3-2处理生菜后，其植株高、叶片宽、植株鲜重及植株干重与对照相比分别增加21.5％和8.9％、31.9％和14.5％、41.3％和13.6％、42.8％和26.4％。罗欢等施用巨大芽孢杆菌CJLC2，番茄植株根长、株高和鲜重分别增加了17.1％、18.0％和15.8％。王孟亮等施用适量巨大芽孢杆菌剂，促进了油菜根系生长，降低了油菜中的硝酸盐含量，增加了油菜生物量和产量。Khaled等施用芽孢菌剂S4的研究表明玉米的根长和茎长分别增加了62％和54％，Hamdy等施用促生菌剂的结果表明玉米的鲜重上增加了34％。朱云娜等将生物菌肥作用于玉米，使得普通玉米和甜玉米的产量分别增加了18.2％和11.6％。本研究的菌株X3可显著提高小白菜、生菜和玉米生长，具有显著的植物促生优越性。

另外，根际促生菌还可以产生大量活性物质，施入土壤后，能够调节土壤中微生物的区系组成，改善土壤微生态系统。周培等筛选的巨大芽孢杆菌NCT-2作用于次生盐渍化土壤中，可使土壤中硝酸盐的含量显著降低，土壤中的AWCD值显著提高，从而改善土壤微生物的多样性，提高微生物的丰富度。余贤美等通过BIOLOG ECO微孔板法分析枯草芽孢杆菌Bs-15具有良好的定殖能力，提高了板栗和枣树土壤微生物的整体活性，丰富了土壤微生物种群。枯草芽孢杆菌HL-1也可显著提高微生物多样性。这些研究结果可望推测，巨大芽孢杆菌剂也具有提高土壤微生物多样性，优化土壤微生态结构的作用，尚待研究。

为此，本技术针对以上研究进展和存在问题，分离筛选多功能和高效的巨大芽孢杆菌，丰富微生物肥料菌种资源，拓宽微生物肥料在改善土壤养分和土壤生态、促进植物生长、耐盐抗逆等多方面的功能化发展。本技术将对提高作物产量和品质、促进农业可持续发展、减少环境污染以及保障人类健康都有重要的理论和实践意义。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于提供一种兼具促生、增产、防病与治理盐渍化功能的巨大芽孢杆菌。

其技术方案为：一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium strain)X3，简称X3菌。该菌株于2015年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.10803，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

该X3菌是在广东省广州市华南农业大学农场土壤中进行分离、纯化所得，属革兰氏阳性菌，有芽孢；菌体为杆状，有运动性，好氧；在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为2～3mm，边缘不整齐，扁平湿润。

经过序列测定，该X3菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

X3菌的保藏方法，其保藏培养基的成分为牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，或按照此比例配制成的培养基，pH值为7.0～7.2。按常规菌种保藏温度保藏。

本发明的另一目的是提供上述菌株的的制备方法，该方法依次包括下述步骤：

(1)分离

以广东省广州市天河区华南农业大学农场的土壤为筛选土样，称取筛选土样，放入装有无菌水的三角瓶中，摇床振荡使细胞充分分散，静置20～30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10³～10⁵稀释度，用移液枪分别吸取稀释液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，28℃倒置培养48h，进行斜面保存，备用；

(2)产吲哚乙酸的筛选

产IAA细菌的定性测定：将步骤1)筛选的细菌接种于含有L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃、180r·min^-1条件下摇床培养1d，取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液，将加入50μL IAA的比色液作为阳性对照，白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30min后观察，颜色变红者表示能够产IAA；

培养液中IAA的定量测定：首先用分光光度法测定菌悬液D₆₀₀值，然后菌悬液以离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置，测定其D₅₃₀值，采用分析纯的IAA梯度稀释测定方法绘制标准曲线，计算单位体积发酵液中IAA含量。

(3)纯化

将产IAA可达5mg·L^-1的菌株纯化保存，共保存13株菌株，而菌株X3产IAA最高，将筛选出的X3菌利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂斜面培养基上。

本发明的最后一个目的是提供该巨大芽孢杆菌X3的应用，具体以如下：

上述巨大芽孢杆菌X3在产生长素或/和铁载体或/和产氨方面的应用。

上述巨大芽孢杆菌X3在分解难溶性磷或耐盐方面的应用。

上述巨大芽孢杆菌X3在防治香蕉枯萎病中的应用。

上述巨大芽孢杆菌X3在产过氧化氢酶或/和淀粉酶或蛋白酶的方面应用。

上述巨大芽孢杆菌X3在促进植物种子发芽方面的应用。

上述巨大芽孢杆菌X3在促进作物生长或/和提高产量方面的应用

上述巨大芽孢杆菌X3在增加土壤微生物群落多样性或/和增加微生物丰度中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明筛选出一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium strain)X3，此菌株能够产生高含量生长素(IAA)和铁载体，促进植物生长并提高产量，特别是玉米；并且具有溶磷，产氨，高耐盐性，可治理盐渍化土壤；并且对香蕉枯萎病具有很好的拮抗效果，可作为生物农药加以利用。

附图说明

图1.X3菌革兰氏染色显微照片；

图2.X3菌芽孢染色显微照片；

图3.菌株产IAA的定性对比图；

图4.菌株产IAA的定量对比图；

图5.X3菌株产铁载体的定性试验实验图；

图6.X3菌株产铁载体的定量试验实验图；

图7.X3菌株耐盐性实验图；

图8.X3菌株产氨能力对比图；

图9.X3菌对香蕉枯萎病的防治作用对比图；

图10.菌株在难溶无机磷培养基下产水溶性磷浓度的对比图；

图11.X3菌产过氧化氢酶试验照片，其中HL-1为阳性对照；

图12.X3菌解淀粉试验照片，其中HL-1为阳性对照；

图13.X3菌为产蛋白酶试验；

图14.X3菌促进小白菜生长盆栽试验照片；

图15.X3菌促进玉米生长盆栽试验照片；

图16.不同处理土壤微生物群落代谢活性AWCD值变化的曲线图

图17.X3菌促进生菜生长大田试验照片；

图18.X3菌促进玉米生长大田试验照片；

图19.X3菌促进玉米穗生长试验照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1 菌株的分离、纯化

(1)分离

配制牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL,pH7.0～7.5。

以广东省广州市天河区华南农业大学农场的土壤为筛选土样，采用平板涂布法准确称取筛选土样10.0g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使细胞充分分散，静置20～30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10³～10⁵稀释度，用移液枪分别吸取稀释液0.1mL，涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，28℃倒置培养48h。选择合适的浓度平板，按照形态、大小、颜色，挑取不同菌株的典型单个菌落，在培养基上纯化后，对筛选到的菌株进行斜面保存，备用。

(2)产吲哚乙酸(IAA)的筛选

产IAA细菌的定性测定：将初步筛选的细菌接种于含有L-色氨酸(100mg·L^-1)的LB液体培养基中，30℃、180r·min^-1条件下摇床培养1d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液( 的HClO₄+1mL 0.5mol·L^-1FeCl₃)，将加入50μL IAA(50mg·L^－1)的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30min后观察，颜色变红者表示能够产IAA。

培养液中IAA的定量测定:培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液OD₆₀₀值，然后菌悬液以相对离心力Fr，c＝8497离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD₅₃₀值。采用分析纯的IAA梯度稀释测定方法绘制标准曲线，计算单位体积发酵液中IAA含量。

(3)纯化

根据国家标准，将产IAA可达5mg·L^-1的菌株纯化保存，共保存13株菌株，而菌株X3的IAA产量最高，达35.05mg·L^-1，将筛选出的X3菌利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂斜面培养基上。结果如图4。

实施例2 特性鉴定

(1)菌体形态特性

革兰氏阳性菌，有芽孢。菌体为杆状，有运动性，专性需氧。菌体革兰氏染色显微照片见图1，芽孢染色照片见图2。

(2)菌落形态特性

在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为2～3mm，边缘不整齐，扁平湿润。

(3)生长特性

在牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1L的液体培养基中，转速113rpm，温度30℃，起始pH值为7.0的条件下，培养18h，测得活菌数为2.91±0.60×10⁸cfu·mL^-1。

(4)分子生物学特性

采用试剂盒法提取X3菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27f:(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和1492r：(TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T)，PCR扩增细菌的16S rDNA，在1000bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明所述菌株的16S rDNA序列和与GenBank中巨大芽孢杆菌具有较高的同源性，其相似度为99％。结合上述的平板菌落特征、Biolog Ecoplate微平板培养结果、生理生化特性、16S rDNA序列的结果，初步鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium strain)，命名为Bacillus megaterium strain X3。

实施例3 菌株产铁载体试验

定性：将菌株转接到LB平板上培养24-48h后,采用点接种法，用灭菌的牙签将菌种接在CAS固体检测平板上，点3个重复，28℃培养48h，经过培养的CAS检测平板上，分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色铁载体晕圈。结果菌株X3的橙色晕圈最大，说明该菌株产铁载体能力最强(图5)。

定量：将菌株接种于限铁SA液体培养基(蔗糖20.0g，L-天冬氨酸2.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0)中,28℃摇床培养(150rpm)48h；菌悬液经10000rpm离心15min，取上清液，菌液和CAS检测液1：1的体积充分混匀，静止1h后，测定630nm波长处的吸光值(As)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种的SA液体培养基的吸光值作为参比值(Ar)，并计算铁载体活性单位([(Ar-As)/Ar]×100)。实验结果表明(图6)，菌株X3的活性单位最大，可达38.25％。

实施例4 X3菌耐盐性试验

将菌株划线到0％，1％，3％，5％，7％，9％，11％，13％的营养琼脂平板上，培养24h，观察菌株的生长情况。结果不同菌株的耐盐能力不同，菌株X3的耐盐能力可达到13g·100mL^-1。如图7。

实施例5 X3菌产氨能力试验

将菌株转接到10mL蛋白胨水溶液(蛋白胨10.0g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2)的试管中，28±2℃培养48-72h，每管加入0.5mL Nessler's试剂,颜色由褐色转为黄色的表明有NH₃产生。结果表明X3菌可产氨，如图8。

实施例6 X3菌抑菌能力试验

将尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)接种于营养琼脂培养基中央,同时于该平板的两侧各划线接种菌株,培养，观察。结果表明X3菌对香蕉枯萎病有一定抑制作用，如图9。

实施例7 X3菌在难溶性无机磷培养基培养下的产水溶性磷的效果实验

三角瓶中装入50mL已灭菌的难溶无机磷培养基(葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0.03g,硫酸锰0.03g，酵母膏0.4g,磷酸钙10g,蒸馏水1000mL),pH7.0～7.5(磷酸钙的浓度为5.0g·L^-1)，接入X3菌制成菌液后在28℃，150rpm，摇床培养7d。将培养液在10000rpm，4℃离心15min，取上清液用钼锑抗比色法测定有效磷含量。设不接X3菌为对照，每个处理重复3次。水溶性磷含量变化(单位为mg·L^-1，即表示每升样品中所含水溶性磷的毫克数)试验结果见图10。

图9的结果表明：X3菌发酵液的水溶性磷含量最高，达到279.46mg·L^-1。

实施例8 X3菌产过氧化氢酶试验

将X3菌在牛肉膏蛋白胨培养基上活化24h后，挑适量供试菌株于载玻片上，滴加3％过氧化氢于供试菌株上，立即观察，有大量气泡产生，即为阳性，反之为阴性。以HL-1为阳性对照，试验结果如图11所示，表明X3菌的过氧化氢酶试验为阳性。

实施例9 X3菌解淀粉试验

将X3菌点接在淀粉培养基平板上，30℃恒温培养箱中培养48h，形成明显的菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。以HL-1为阳性对照，试验结果如图12所示，表明X3菌的解淀粉试验为阳性。

实施例10 X3菌产蛋白酶试验

蛋白酶检测培养基(g_.L^-1)：蛋白胨10g，氯化钠5g，氯化钙0.1g，脱脂奶粉10g，琼脂18g，115℃灭菌30min，pH 7.2-7.4。

将菌株接种到蛋白酶检测培养基上，30℃培养2d，观察菌落周围的透明圈大小来判断菌株的蛋白质水解能力，结果如图13所示，与对照相比，菌株平板上的蛋白质几乎都被利用完全，说明该菌株利用蛋白质的能力很强。

实施例11 X3菌对种子发芽促生实验

将小白菜种子用75％乙醇1min+5％次氯酸钠溶液浸泡2min，再用无菌水冲洗3-4次，然后用无菌的滤纸干燥种子，所有操作尽可能保证无菌操作。处理好的种子放在干燥无菌的容器里备用。设置两个处理组(第一组加入菌发酵液，用X3表示，第2组加入未接种菌株的培养基作为空白对照，用CK表示)将小白菜种子分别在一二组中浸泡30min。将灭菌的培养皿里事先铺好两层无菌滤纸，将浸种处理的种子放置在培养皿中(每皿10颗种子)，在种子上覆盖一层滤纸，培养(30℃)。每天每皿加2mL无菌水，加水时间统一。各菌种处理设置4个重复。测定第3,4,5天的发芽率和芽长。结果表明(表1)：加入菌能促进小白菜发芽。

表1 X3菌对小白菜种子发芽试验

实施例12 X3菌促进小白菜生长盆栽效果实验

采用X3菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入X3菌发酵液经离心用0.8％生理盐水重悬30mL，用X3表示，第2组加入0.8％生理盐水30mL作为空白对照，用CK表示)，每个处理组重复7次。各处理组土壤重1.0kg，具体试验设计见表2。小白菜水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗床中。当苗长出两心一叶时，移苗至盆中，每盆1棵苗。每天浇水适量，每盆的水量要相同，均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而误差。2013年1月17日测量小白菜株高，叶片数，根长。2013年1月19日测量小白菜植株根干重和叶干重，之后测定了小白菜植株地上部分和地下部分氮磷钾的含量。结果表明(表3和表4)：加入X3菌能够显著促进小白菜的生长。

表2 实验设计

表3 X3菌剂对小白菜的促生效果对比表

表4 X3菌剂对小白菜的营养成分对比表

实施例13 X3菌促进玉米生长盆栽效果实验

采用X3菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入X3菌发酵液经离心用0.8％生理盐水重悬30mL，用X3表示，第2组加入0.8％生理盐水30mL作为空白对照，用CK表示)，每个处理组重复4次，每次重复4棵苗。每盆土壤重3.0kg，具体试验设计见表5。玉米种子水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，放置在30℃培养箱内，两天后露出芽播种至苗床中。当苗长到约15cm高，移苗至盆中，每盆2棵苗。每天浇水适量，每盆的水量要相同，均匀，注意不要使水流出盆底以免肥料损失而误差。2014年5月13日测量玉米株高，叶片数，叶绿素，根长，叶长，叶宽，茎粗，地上部分和地下部分鲜重。2014年5月15日测量玉米植株地上部分和地下部分干重。结果表明(表6和表7)：加入X3菌能够显著促进玉米的生长。

表5 实验设计

表6 X3菌剂对玉米的促生效果对比表

表7 X3菌剂对玉米的促生效果对比表

注：数据为4次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMRT法)。

实施例14 X3菌对土壤微生物功能多样性的改良效果试验

具体操作如下：称取相当于10g烘干土样的新鲜土壤加入到装有100mL灭菌生理盐水(0.85％)的250mL三角瓶中；在旋涡震荡机上震荡1min后，在冰水浴中静置1min；重复3次；静置2min，取5mL上述土壤浸提液加入45mL灭菌生理盐水(0.85％)中，混匀后，重复此步骤，将稀释1000倍后的X3菌液加入Biolog Eco板中，每孔加150μL；将接种的微平板在30℃培养箱培养，分别于0、24、48、72、96h用酶标仪读取590nm下的吸光值。计算土壤微生物群落多样性的公式如表8。

表8 计算微生物群落多样性指数的公式

实验结果见表9，表明各处理AWCD值随时间的增加而增加，且加入X3菌种的处理土壤(X3菌组)微生物群落多样性各项指标(土壤微生物代谢活性AWCD、土壤微生物多样性指数Shannon和土壤微生物丰富度Richness)均显著高于未加入X3菌种的土壤(即空白对照组，用CK表示，达到显著性差异(P<0.05)。说明X3菌显著地提高了土壤微生物多样性。

表9 不同处理土壤微生物群落多样性指数(48h)

注：数据为3次重复的平均值±标准误，表中同列不同字母者，表示在0.05水平差异显著(DMRT法)。

实例15 X3菌促进生菜生长田间效果实验

采用X3菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入X3菌发酵液，用X3表示；第2组加入未接种菌株的培养基作为空白对照，用CK表示)，每个处理组3个小区，每个小区面积2.5×1.4m²，种植密度15×8＝120株苗(除去边际效应保护行1株，实际株数13×6＝78株)。生菜水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，两天后露出芽播种至苗床中。当苗长出两心一叶时，移入大田。2013年4月15日测量生菜株高、根长、叶面积和叶绿素。2013年4月17日测量生菜地上部分和地下部分的干重。结果表明(表10)：加入X3菌能够显著促进生菜的生长。

表10 X3菌剂对生菜的促生效果对比表

实例16 X3菌促进玉米生长田间效果实验

采用X3菌和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第1组加入X3菌发酵液，用X3表示；第2组加入未接种菌株的培养基作为空白对照，用CK表示)，每个处理组3个小区，每个小区面积5.3m²，种植密度为34株/小区，6个小区采取完全随机区组设计。玉米水洗催芽，用滤纸沁润保存水分，两天后露出芽播种至苗床中。待玉米苗长至10cm时，移入大田。测定开花期和拔节期玉米株高、根长、叶片数、叶长、叶宽、茎粗、鲜重和干重，成熟期穗长、穗粗、穗粒数、百粒重和经济产量等。结果表明(表11、12、13)：加入X3菌能够显著促进玉米的生长，玉米产量较CK增加29.8％。

表11 X3菌剂对玉米的促生效果对比表

表12 X3菌剂对玉米的促生效果对比表

表13 X3菌剂对玉米穗的促生效果对比表

巨大芽孢杆菌X3及其制备方法、应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。