专利摘要

本发明涉及一种含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物及其制备方法和应用，其是在氮气保护下，将氯桥二聚体和4’‑甲基‑2,2’‑联吡啶‑4‑(肼基羰基)二茂铁加入二氯甲烷溶剂中加热反应，得到含有肼基羰基‑二茂铁配体的铱配合物，本发明是首次将带有羰基肼基的二茂铁引入铱的配合物中，将羰基肼基可被次氯酸特异性切割的特性与二茂铁具有分子内淬灭荧光作用的特性结合，使铱配合物自身的荧光特性被二茂铁猝灭，遇到次氯酸根之后羰基肼基被次氯酸特异性切割，实现发光信号的“开”和“关”，从而作为检测次氯酸根的荧光探针，实现了生物及细胞中次氯酸含量的检测，而且其具有高灵敏度、高选择性、荧光响应迅速、pH适用范围较宽等优点。

权利要求

1.一种含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物，其结构式为：

2.一种如权利要求1所述的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

(1)氯桥二聚体的制备

在氮气保护下，将IrCl₃·3H₂O和2-苯基苯并噻唑加入2-乙氧基乙醚与水的混合溶剂中，IrCl₃·3H₂O和2-苯基苯并噻唑的摩尔比为1:2～2.5，加热至回流，搅拌反应15～24h后停止反应，冷却至室温，抽滤得到沉淀，所得沉淀分别用二次去离子水、乙醇、正己烷洗涤，真空烘干，得到氯桥二聚体；

(2)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁的制备

在无水无氧条件下，将4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸加入二氯亚砜溶剂中，加热至回流，搅拌2～4h后停止反应，将溶剂旋蒸除去，将剩余固体溶于无水二氯甲烷中，在冰浴条件下逐滴加入溶有(肼基羰基)二茂铁和三乙胺的无水二氯甲烷溶液，4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸与(肼基羰基)二茂铁的摩尔比为1:1～3，滴加完成后冰浴下搅拌2～4h后停止反应，恢复至室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁；

(3)铱配合物的合成

在氮气保护下，将氯桥二聚体和4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁按照摩尔比为1:2～5的比例混合加入二氯甲烷溶剂中，加热至35～45℃，搅拌反应15～24h后停止反应，冷却到室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物。

3.如权利要求2所述的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述(肼基羰基)二茂铁和三乙胺的摩尔比为1：1～1：3.5。

4.如权利要求1所述的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物应用于次氯酸根检测。

5.如权利要求1所述的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物作为荧光探针用荧光法检测生物及细胞中的次氯酸根含量的应用。

6.如权利要求4或5所述的用途，其特征在于用荧光法检测生物及细胞中的次氯酸根含量的方法由以下步骤组成：

(1)配制pH为7.4、浓度为25mmol的PBS-无水乙醇缓冲溶液，再配制浓度为50μmol的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的乙醇溶液和浓度为4mmol的标准次氯酸水溶液；

(2)将PBS-无水乙醇缓冲溶液与含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的乙醇溶液按照体积比为5～10:1添加到另一个干净的荧光比色皿中，向其中分别加入0、10、20、30、40、50μL的标准次氯酸水溶液，用荧光分光光度仪分别测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I，激发波长为365nm，狭缝为10nm/10nm，以荧光比色皿中次氯酸的浓度为横坐标，以其所对应的荧光强度I为纵坐标，绘制次氯酸浓度的工作曲线，所得线性回归方程为：I-I₀＝1.14+22.56C，I₀为加入0μL的标准次氯酸水溶液时对应的荧光强度，C为标准次氯酸水溶液的浓度，μmol/L；

(3)将PBS-无水乙醇缓冲溶液与含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的乙醇溶液按照体积比为5～10:1添加到另一个干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取待测次氯酸水溶液，加入到该荧光比色皿中，用荧光分光光度仪上测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I_待测，激发波长为365nm，狭缝为10nm/10nm，将测得的荧光强度I_待测代入步骤(2)的线性回归方程中，从而待测次氯酸水溶液的浓度为C_待测。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述PBS-无水乙醇缓冲溶液中无水乙醇的体积浓度为28％。

说明书

技术领域

本发明属于荧光材料技术领域，具体涉及一种含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物及其制备方法和用途。

背景技术

铱金属配合物因其具有良好的荧光量子产率和发光效率及其良好的光学稳定性，已经引起了众多学者极大的研究兴趣。与钌联吡啶配合物相比，铱金属配合物具有发光效率高、寿命长、灵敏度高等优点，近年来受到分析化学工作者的青睐。前人的研究偏重于合成具有良好的荧光量子产率的铱金属配合物，对于针对性检测次氯酸的铱金属配合物的研究较少。与其他ROS/RNS类似,次氯酸/次氯酸根在生物体内发挥着重要的生理作用,在生物体中，通过氯离子在髓过氧物酶的催化下的过氧化反应合成的次氯酸是一种必需的抗菌剂。并且，体内过量的次氯酸会引发诸如肝缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、肺损伤、风湿病、心血管疾病、神经退化、甚至癌症等疾病，其在体内的浓度水平及作用过程就成为了研究其致病原理的关键点。因此,活体生物样品中次氯酸/次氯酸根的原位测定与示踪对于进一步解明其各种生理功能具有重要的实际意义。而光学探针方法因其具有操作简便，灵敏度高，稳定性好，选择性好，具有可视性，可进行非侵入型的实时监控等优点，已日益成为一种生命分析领域的重要研究方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高选择性、pH适用范围宽、荧光响应迅速的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物。

同时，本发明还提供了上述含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的制备方法，其制备周期较短，副反应比例较少，产率较高。

本发明还提供了上述含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物在次氯酸含量检测方面的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

该含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物，其结构式为：

上述的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的制备方法，由以下步骤组成：

(1)氯桥二聚体的制备

在氮气保护下，将IrCl₃·3H₂O和2-苯基苯并噻唑加入2-乙氧基乙醚与水的混合溶剂中，IrCl₃·3H₂O和2-苯基苯并噻唑的摩尔比为1:2～2.5，加热至回流，搅拌反应15～24h后停止反应，冷却至室温，抽滤得到沉淀，所得沉淀分别用二次去离子水、乙醇、正己烷洗涤，真空烘干，得到氯桥二聚体；

(2)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁的制备

在无水无氧条件下，将4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸加入二氯亚砜溶剂中，加热至回流，搅拌2～4h后停止反应，将溶剂旋蒸除去，将剩余固体溶于无水二氯甲烷中，在冰浴条件下逐滴加入溶有(肼基羰基)二茂铁和三乙胺的无水二氯甲烷溶液，4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸与(肼基羰基)二茂铁的摩尔比为1:1～3，滴加完成后冰浴下搅拌2～4h后停止反应，恢复至室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁；

(3)铱配合物的合成

在氮气保护下，将氯桥二聚体和4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁按照摩尔比为1:2～5的比例混合加入二氯甲烷溶剂中，加热至35～45℃，搅拌反应15～24h后停止反应，冷却到室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物。

进一步限定，在步骤(2)中，所述(肼基羰基)二茂铁和三乙胺的摩尔比为1：1～3.5。

上述的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物应用于次氯酸根检测，特别是作为荧光探针用荧光法检测生物及细胞中的次氯酸根含量的应用。

进一步限定，用荧光法检测生物及细胞中的次氯酸根含量的方法由以下步骤组成：

(1)配制pH为7.4、浓度为25mmol的PBS-无水乙醇缓冲溶液，再配制浓度为50μmol的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的乙醇溶液和浓度为4mmol的标准次氯酸水溶液；

(2)将PBS-无水乙醇缓冲溶液与含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的乙醇溶液按照体积比为5～10:1添加到另一个干净的荧光比色皿中，向其中分别加入0、10、20、30、40、50μL的标准次氯酸水溶液，用荧光分光光度仪分别测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I，激发波长为365nm，狭缝为10nm/10nm，以荧光比色皿中次氯酸的浓度为横坐标，以其所对应的荧光强度I为纵坐标，绘制次氯酸浓度的工作曲线，所得线性回归方程为：I-I₀＝1.14+22.56C，I₀为加入0μL的标准次氯酸水溶液时对应的荧光强度，C为标准次氯酸水溶液的浓度，μmol/L；

(3)将PBS-无水乙醇缓冲溶液与含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的乙醇溶液按照体积比为5～10:1添加到另一个干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取待测次氯酸水溶液，加入到该荧光比色皿中，用荧光分光光度仪上测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I_待测，激发波长为365nm，狭缝为10nm/10nm，将测得的荧光强度I_待测代入步骤(2)的线性回归方程中，从而待测次氯酸水溶液的浓度为C_待测。

进一步限定，上述PBS-无水乙醇缓冲溶液中PBS与无水乙醇的体积比为2.5:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明是首次将带有羰基肼基的二茂铁引入铱的配合物中,得到一种新的铱配合物，将羰基肼基可被次氯酸特异性切割的特性与二茂铁具有分子内淬灭荧光作用的特性结合，使铱配合物自身的荧光特性被二茂铁猝灭，遇到次氯酸根之后羰基肼基被次氯酸特异性切割，从而实现发光信号的“开”和“关”，从而作为检测次氯酸根的荧光探针，实现了生物及细胞中次氯酸含量的检测。

(2)本发明的铱配合物具有高灵敏度、高选择性、荧光响应迅速等优点,同时，本发明的铱配合物从酸到碱的范围内都可以用于次氯酸的检测，即pH适用范围较宽，是一种较好的检测次氯酸的分析方法，并可进一步在荧光及电化学发光成像中应用。

(3)本发明的方法在制备4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-肼基羰基二茂铁时反应条件应严格保持溶剂除水与反应体系除氧条件，相比于其他制备方法，本方法明显缩短了制备周期，降低了副反应进行的比例，极大提高了反应的产率。

(4)本发明在新型铱金属配合物性质研究的基础上，首次在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中引入了体积比为28％的无水乙醇作为荧光探针的溶剂，大大提高了其作为荧光探针检测次氯酸的灵敏度。

附图说明

图1为实施例1的产物质谱图。

图2为标准铱配合物Ir-Fc的质谱图。

图3为检测次氯酸浓度的标准曲线图。

图4为铱配合物检测标准次氯酸的荧光发射图。

图5为铱配合物检测待测次氯酸的荧光性质图。

图6为铱配合物探针用于检测细胞内次氯酸的荧光共聚焦显微镜照片。

图7为铱配合物探针在不同pH条件下的荧光特性曲线。

图8为铱配合物探针在不同溶剂条件下的荧光特性曲线。

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。

实施例1

本实施例制备含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的方法由以下步骤组成：

(1)氯桥二聚体的制备

在氮气保护下，将0.3528g(1mmol)的IrCl₃·3H₂O加入2-乙氧基乙醚与水的混合溶剂中，2-乙氧基乙醇：水(V:V)＝30:10mL，磁力搅拌15min，搅拌均匀后，向其中加入0.4792g(2.2mmol)的2-苯基苯并噻唑，加热至120℃，回流，搅拌反应24h后停止反应，冷却至室温，抽滤得到沉淀，所得沉淀分别用30mL二次去离子水、30mL乙醇和30mL正己烷洗涤，50℃的干燥箱中真空烘12h至干燥，得到橙红色粉末状氯桥二聚体；

(2)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁的制备

在无水无氧条件下，将214mg(1mmol)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸加入50mL的二氯亚砜溶剂中，加热至80℃回流，搅拌3h后停止反应，将溶剂旋蒸除去，将剩余固体溶于50mL的无水二氯甲烷中，在0℃冰浴条件下逐滴加入溶有244mg(肼基羰基)二茂铁和130μL三乙胺的无水二氯甲烷溶液，滴加完成后冰浴下搅拌3h后停止反应，恢复至室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂(V:V＝40:1)进行纯化，除去溶剂干燥后得到4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁；

(3)铱配合物的合成

在氮气保护下将0.13g(0.1mmol)氯桥二聚体和0.1g(0.228mmol)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁按照摩尔比为1:2.28的比例混合加入50mL的二氯甲烷溶剂中，加热至40℃，搅拌反应24h后停止反应，冷却到室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇(V:V＝20:1)作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到目标产物含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物(Ir-Fc)，其结构式为：

其产率为50％。

将所得产物经EIS-QTOF质谱分析所得结果参见图1，结果为1053.1325[M+H]^-，与Ir-Fc的标准质谱图(图2)的标准值1053.1315[M+H]^-接近，说明本实施例所得产物为上述结构的Ir-Fc。

实施例2

本实施例制备含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物的方法由以下步骤组成：

(1)氯桥二聚体的制备

在氮气保护下，将0.3528g(1mmol)的IrCl₃·3H₂O加入2-乙氧基乙醚与水的混合溶剂中，2-乙氧基乙醇：水(V:V)＝30:10mL，磁力搅拌15min，搅拌均匀后，向其中加入0.4356g(2mmol)的2-苯基苯并噻唑，加热至120℃，回流，搅拌反应15h后停止反应，冷却至室温，抽滤得到沉淀，所得沉淀分别用30mL二次去离子水、30mL乙醇和30mL正己烷洗涤，50℃的干燥箱中真空烘12h至干燥，得到橙红色粉末状氯桥二聚体；

(2)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁的制备

在无水无氧条件下，将214mg(1mmol)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸加入50mL的二氯亚砜溶剂中，加热至75℃回流，搅拌3h后停止反应，将溶剂旋蒸除去，将剩余固体溶于50mL的无水二氯甲烷中，在0℃冰浴条件下逐滴加入溶有732mg(3mmol)(肼基羰基)二茂铁和130μL三乙胺的无水二氯甲烷溶液，滴加完成后冰浴下搅拌2h后停止反应，恢复至室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂(V:V＝40:1)进行纯化，除去溶剂干燥后得到4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁；

(3)铱配合物的合成

在氮气保护下,将130mg(0.1mmol)氯桥二聚体和880mg(0.2mmol)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁按照摩尔比为1:2的比例混合加入50mL的二氯甲烷溶剂中，加热至35℃，搅拌反应24h后停止反应，冷却到室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇(V:V＝20:1)作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到目标产物含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物(Ir-Fc)，其产率为48％。

实施例3

(1)氯桥二聚体的制备

在氮气保护下，将0.3528g(1mmol)的IrCl₃·3H₂O加入2-乙氧基乙醚与水的混合溶剂中，2-乙氧基乙醇：水(V:V)＝30:10mL，磁力搅拌15min，搅拌均匀后，向其中加入0.5445g(2.5mmol)的2-苯基苯并噻唑，加热至120℃，回流，搅拌反应18h后停止反应，冷却至室温，抽滤得到沉淀，所得沉淀分别用30mL二次去离子水、30mL乙醇和30mL正己烷洗涤，50℃的干燥箱中真空烘12h至干燥，得到橙红色粉末状氯桥二聚体；

(2)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁的制备

在无水无氧条件下，将214mg(1mmol)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸加入50mL的二氯亚砜溶剂中，加热至75℃回流，搅拌3h后停止反应，将溶剂旋蒸除去，将剩余固体溶于50mL的无水二氯甲烷中，在0℃冰浴条件下逐滴加入溶有610mg(2.5mmol)(肼基羰基)二茂铁和130μL三乙胺的无水二氯甲烷溶液，滴加完成后冰浴下搅拌2h后停止反应，恢复至室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂(V:V＝40:1)进行纯化，除去溶剂干燥后得到4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁；

(3)铱配合物的合成

在氮气保护下,将0.13g(0.1mmol)氯桥二聚体和2.2g(0.5mmol)4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-(肼基羰基)二茂铁按照摩尔比为1:5的比例混合加入50mL的二氯甲烷溶剂中，加热至45℃，搅拌反应15h后停止反应，冷却到室温，旋蒸除去溶剂，再用硅胶柱层析分离，采用二氯甲烷和甲醇(V:V＝20:1)作为展开剂进行纯化，除去溶剂干燥后得到目标产物含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物(Ir-Fc)，其产率为40％。

上述含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物(下述简称铱配合物)可以作为荧光探针可以在荧光法检测生物及细胞中的次氯酸含量中应用，具体检测方法由下述步骤组成：

(1)配制pH为7.4、浓度为25mmol的PBS-无水乙醇(2.5:1,v/v)缓冲溶液，再配制浓度为50μmol的铱配合物的乙醇溶液和浓度为4mmol的标准次氯酸水溶液；

(2)将PBS-无水乙醇(2.5:1,v/v)缓冲溶液与铱配合物的乙醇溶液按照体积比为7:1添加到荧光比色皿系列中，向其中分别加入0、10、20、30、40、50μL的标准次氯酸水溶液，用荧光分光光度仪分别测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I，激发波长为365nm，狭缝为5nm/10nm，所得荧光强度分别是46.18、89.97、143.64、180.776、229.045、271.138，以荧光比色皿中次氯酸的浓度为横坐标，以其所对应的荧光强度I为纵坐标，绘制次氯酸浓度的工作曲线，所得线性回归方程为：I-I₀＝1.14+22.56C，I₀为加入0μL的标准次氯酸水溶液时对应的荧光强度，C为标准次氯酸水溶液的浓度，μmol/L，见图3。

(3)将PBS-无水乙醇缓冲溶液与铱配合物的乙醇溶液按照体积比为7:1添加到另一个干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取30μL待测次氯酸水溶液，加入到该荧光比色皿中，用荧光分光光度仪上测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I₁＝177.23，激发波长为365nm，狭缝为5nm/10nm，将测得的荧光强度I₁代入步骤(2)的线性回归方程中，从而待测次氯酸水溶液的浓度为C_待测＝5.76x10^-6mol/L。

在实际检测过程中，PBS-无水乙醇缓冲溶液与铱配合物的乙醇溶液的体积比可以在5～10:1的范围内浮动，保证其荧光特性稳定即可。

为了验证本发明的含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物Ir-Fc(下述简称铱配合物)对次氯酸的检测效果，现以下述实验为例进行说明。

(1)取2.4mL的PBS-无水乙醇(28％，v/v)缓冲溶液、600μL Ir-Fc的乙醇溶液加到系列荧光比色皿中，分别用微量进样器取0、10、20、30、40、50μL的标准次氯酸水溶液，边加样边在荧光分光光度仪上检测各比色皿的荧光强度(激发：365nm，狭缝：10nm/10nm)，荧光发射图见图4。

由图4中a～f线对比可知，随着次氯酸的加入，荧光仪所检测到的566nm处的荧光强度逐渐增大，说明次氯酸加入后切断了化学键(-C₂O₂N₂H₂-)，导致了荧光淬灭基团二茂铁的离去，被淬灭的铱配合物的荧光逐渐恢复。

(2)检测样品

由图5可知，在荧光光谱仪上测定566nm的对应的荧光强度F为177.23，激发：365nm，狭缝：10nm/10nm，相对荧光强度I﹣I₀﹦131.05，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝5.76x10^-6mol/L。

(3)活细胞中荧光成像实验

巨噬细胞按照组织培养保藏标准(American Type Tissue Culture Collection)规定进行培养。巨噬细胞用含有10μM该铱配合物探针的培养液在37℃下孵育3h，然后用培养液洗涤3次，作为空白对照组的共聚焦显微镜照片，如图6中的a)Ir-Fc所示。

实验组在巨噬细胞用含有10μM该铱配合物探针的培养液在37℃条件下孵育3h后，再用50μM NaClO等渗盐溶液在37℃条件下孵育0.5h，之后用培养基洗涤3次，置于共聚焦显微镜下拍照，如图6中b)Ir-Fc+HOCl所示。

如图6中a)Ir-Fc所示，只用Ir-Fc荧光探针处理过的巨噬细胞在荧光显微镜下呈现出极微弱的荧光；与之形成强烈对比的是图6中b)组用Ir-Fc荧光探针+次氯酸溶液处理过的巨噬细胞在荧光显微镜下呈现出较强的黄色荧光。

结果表明，Ir-Fc荧光探针是可以透过细胞膜的，而且有能力与细胞内的次氯酸发生相互作用而发出可检测到的荧光信号。因此，在活细胞中使用该探针进行次氯酸检测是可行的，即该铱金属配合物探针可用于检测活细胞内的次氯酸。

(4)pH性质研究

1)配制pH＝4/4.5/5、浓度为25mmol的醋酸/醋酸钠-无水乙醇(乙醇浓度为28％,v/v)缓冲溶液，pH＝6/7/8、浓度为25mmol的PBS-无水乙醇(乙醇浓度为28％,v/v)缓冲溶液，pH＝9/10、浓度为25mmol的碳酸钠/碳酸氢钠-无水乙醇(乙醇浓度为28％,v/v)缓冲溶液，再配制浓度为50μmol的铱配合物的乙醇溶液和浓度为4mmol的标准次氯酸水溶液；

2)将pH＝4/4.5/5/6/7/8/9/10的上述缓冲溶液与铱配合物的乙醇溶液按照体积比为7:1添加到荧光比色皿系列中，向其中分别加入200μL的标准次氯酸水溶液，用荧光分光光度仪分别测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I，激发波长为365nm，狭缝为5nm/10nm。

实验结果如图7中所示，在未加入次氯酸时(Ir-Fc)，在pH＝4-10范围内，pH值的变化对于Ir-Fc荧光探针在566nm处的荧光强度基乎无影响，荧光均很弱，加入次氯酸(Ir-Fc+HOCl)之后，随着pH值的增加，566nm处的荧光呈现先增强后减弱的趋势，但总体来说在p H从酸到碱的范围内都可用于次氯酸的检测。

(5)溶剂条件研究

1)配制一系列pH为7.4、浓度为25mmol的PBS-无水乙醇(乙醇浓度分别为0％,22％，25％，28％,33％，50％，v/v)的缓冲溶液，再配制浓度为50μmol的铱配合物的乙醇溶液和浓度为4mmol的标准次氯酸水溶液；

2)将乙醇浓度分别为0％,22％，25％，28％,33％，50％的上述缓冲溶液与铱配合物的乙醇溶液按照体积比为7:1添加到荧光比色皿系列中，向其中分别加入200μL的标准次氯酸水溶液，用荧光分光光度仪分别测定其在波长为566nm处对应的荧光强度I，激发波长为365nm，狭缝为5nm/10nm。

如图8中所示，在未加入次氯酸(Ir-Fc)时，水介质中乙醇的加入对于Ir-Fc荧光探针在566nm处的荧光强度基乎无影响，荧光均很弱；加入次氯酸(Ir-Fc+HOCl)后，Ir-Fc荧光探针在566nm处的荧光强度随着酒精的浓度从0变化至50％(V/V)，出现了很明显的变化。由图可知，乙醇浓度为28％(V/V)时，该探针在566nm处的荧光最强。

此实验结果表明，本发明的铱金属配合物探针在酒精浓度为28％时，具有较高的检测灵敏度。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，不仅限于上述的实施方式。

一种含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。