专利摘要

本发明公开了一种溶解氧荧光传感膜的制备方法及沉积物‑水界面溶解氧二维动态分布检测方法，本发明能够准确获取沉积物‑水界面二维、高分辨率（µm级）溶解氧的浓度动态变化信息，适用于沉积物‑水界面溶解氧的检测技术领域。

权利要求

1.一种沉积物-水界面溶解氧的荧光传感膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制含1~5mg/ml的氧气敏感性染料和1~5mg/ml参比染料的乙醇溶液作为染料储备液，

（2）将染料储备液与水按照体积比为6~10：1的比例混合均匀，并加入0.05~0.2g/ml的HydroMed D4，搅拌溶解得到铸膜液；

（3）通过刮涂或旋涂法将铸膜液涂覆在透明聚酯薄膜表面，并干燥12h以上至完全干燥得到传感层；

（4）接着，在传感层表面继续涂覆白色硅橡胶层作为遮光保护层，得到溶解氧传感膜；

（5）溶解氧传感膜校正：首先，通过调节通入在去离子水中的氮气和氧气的气体流量得到不同溶解氧浓度；然后，将上述溶解氧传感膜贴敷于透明容器内壁后浸入前述不同溶解氧浓度去离子水中，在395 nm的紫外激发光源照射下通过CMOS相机获取不同溶解氧浓度下的传感膜荧光图像；接着，提取不同溶解氧浓度下荧光图像的红色通道R和绿色通道G，计算得到荧光强度比值F＝R/G，并以单指数函数对荧光强度比值F与溶解氧浓度的关系进行曲线拟合，得到传感膜的溶解氧响应模型，式（1）：

（1）

式中，a，b和F0为拟合参数。

2.根据权利要求1所述沉积物-水界面溶解氧的荧光传感膜的制备方法，其特征在于：所述氧气敏感性染料采用PtOEP或者PtTFPP；所述参比染料采用Coumarin 6、Macrolexyellow或Coumarin 545T。

3.根据权利要求1所述沉积物-水界面溶解氧的荧光传感膜的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述传感膜荧光图像通过CMOS相机在500nm长通滤光片下采集。

4.一种基于权利要求1~3任一所述荧光传感膜的沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将经过校正的溶解氧传感膜拼贴在透明有机玻璃管的内壁，并投入到水域采样点进行沉积物原位样品采样；

（2）采集的沉积物原位样品的上覆水中以0.2~0.6 L/min的流量通入氧气进行好氧培养若干天后，在暗室中采集传感膜的荧光图像；

（3）接着在上覆水中以0.2~0.6 L/min的流量继续通入氮气，进行厌氧培养若干天后，在暗室中采集传感膜的荧光图像；

（4）通过提取荧光图像各点的荧光强度比值，并与校正拟合后的标准溶解氧响应模型进行比较，最后绘制得到的沉积物原位样品在好氧和厌氧条件下的沉积物-水界面的溶解氧二维动态分布图。

5.根据权利要求4所述荧光传感膜的沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法，其特征在于：所述采集的沉积物原位样品的沉积物高度为20±5cm，上覆水的高度为10±2cm。

说明书

技术领域

本发明属于水体沉积物中溶解氧的检测技术领域，尤其涉及一种简单的溶解氧荧光传感膜的制备方法以及沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法。

背景技术

氧气是生命的基础。它不仅对单个动物的生存至关重要，而且还调节主要养分（氮，磷，硫，铁，锰及其它金属元素）和碳的全球循环。在海洋中至少在过去的半个世纪，开放海洋和沿海水域的氧气含量一直在下降，这主要是由于人类活动增加了全球温度，并向沿海水域排放养分。这些改变促进微生物呼吸作用并加快了氧气的消耗，降低了氧气在水中的溶解度，此外降低了从大气到海洋内部的氧气再供应速率，导致海洋水体和沉积物厌氧。在湖泊和水库等淡水系统中随着氮，磷等大量养分的输入，水体富营养化问题严重，引起蓝藻水华的大量暴发。暴发的蓝藻水华降低水体透明度，引起水生植物的退化，并且蓝藻在腐烂降解过程中迅速耗尽水体中的氧气，也会降低水体和沉积物氧气。湖泊，海洋中水体氧气的降低将会形成局部的死水区，沉积物厌氧导致内源营养盐的大量释放，从而引起一系列的生物、生态和环境后果。因此需要对水体和沉积物进一步研究，以了解和预测长期全球和区域规模的氧气变化及其对海洋和淡水渔业及生态系统的影响。

水体中溶解氧的测定可以使用便携式溶氧仪，但是由于溶氧仪探头较大（最小探头直径为1.2 cm，雷磁DO-9585），无法原位获取沉积物中溶解氧的浓度信息。当前普遍使用微电级的方法来解决该问题，溶解氧电极最小的尖端直径可达到100 µm，可以实现沉积物-水界面溶解氧的原位测定。但是，微电级只能获取一个点的溶解氧剖面信息，由于沉积物具有高度的空间异质性，无法真实反映沉积物中溶解氧的剖面变化信息，并且微电级需要从丹麦进口价格较昂贵（1根溶解氧电极约10000元人民币），尖端较细碰到立即损坏，测定时间较长（30 min一个剖面），需要专业人员操作。因此，急需发明一种新的沉积物-水界面溶解氧测定方法去解决该问题。最近发展的平面光学传感器为沉积物中溶解氧的检测提供了新的途径，比如：中国专利申请202010133853.8提出了“一种检测沉积物溶解氧二维分布的光学传感膜制备方法”，包括透明的PET基材、传感层和保护层，所述传感层是将荧光染料和供体染料均匀混合后固定在透明的PET基材表面，所述保护层是将稀释后的气体渗透型硅橡胶涂覆在传感层之上。该方法制备的传感膜在紫外光激发光的照射下，通过CCD相机获取光学传感膜的发射图像，最终获取沉积物中溶解氧浓度的二维信息。虽然该技术可以有效获取沉积物中溶解氧的二维剖面信息，但是在传感膜的制备过程中使用甲苯氯仿等剧毒溶剂以及聚苯乙烯等难降解材料，大量生产将会对环境及人体造成一定的危害，因此，发展一种简单高效、环境友好型及高性能的溶解氧的制备方法以及快速检测方法至关重要。

发明内容

发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供了一种溶解氧荧光传感膜的制备方法及沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法，本发明能够准确获取沉积物-水界面二维、高分辨率（µm级）溶解氧的浓度动态变化信息，适用于沉积物-水界面溶解氧的检测技术领域。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种沉积物-水界面溶解氧的荧光传感膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制含1~5mg/ml的氧气敏感性染料和1~5mg/ml参比染料的乙醇溶液作为染料储备液，

（2）将染料储备液与水按照体积比为6~10：1的比例混合均匀，并加入0.05~0.2g/ml的HydroMed D4，搅拌溶解得到铸膜液；

（3）通过刮涂或旋涂法将铸膜液涂覆在透明聚酯薄膜表面，并干燥12h以上至完全干燥得到传感层；

（4）接着，在传感层表面继续涂覆白色硅橡胶层作为遮光保护层，得到溶解氧传感膜；

（5）溶解氧传感膜校正：首先，通过调节通入在去离子水中的氮气和氧气的气体流量得到不同溶解氧浓度；然后，将上述溶解氧传感膜贴敷于透明容器内壁后浸入前述不同溶解氧浓度去离子水中，在395 nm的紫外激发光源照射下通过CMOS相机获取不同溶解氧浓度下的传感膜荧光图像；接着，提取不同溶解氧浓度下荧光图像的红色通道R和绿色通道G，计算得到荧光强度比值F＝R/G，并以单指数函数对荧光强度比值F与溶解氧浓度的关系进行曲线拟合，得到传感膜的溶解氧响应模型，式（1）：

（1）

式中，a，b和F0为拟合参数。

作为优选，所述氧气敏感性染料采用PtOEP（Platinum (II) 2,3,7,8,12,13,17,18-octaethyl-21H,23H-porphyrin）或者PtTFPP；所述参比染料采用Coumarin 6（香豆素6）、Macrolex yellow或Coumarin 545T（香豆素545T）。

作为优选，步骤（5）中所述传感膜荧光图像通过CMOS相机在500nm长通滤光片下采集。

本发明还提供了一种基于上述荧光传感膜的沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法，包括以下步骤：

（1）将经过校正的溶解氧传感膜拼贴在透明有机玻璃管的内壁，并投入到水域采样点进行沉积物原位样品采样；

（2）采集的沉积物原位样品的上覆水中以0.2~0.6 L/min的流量通入氧气进行好氧培养若干天后，在暗室中采集传感膜的荧光图像；

（3）接着在上覆水中以0.2~0.6 L/min的流量继续通入氮气，进行厌氧培养若干天后，在暗室中采集传感膜的荧光图像；

（4）通过提取荧光图像各点的荧光强度比值，并与校正拟合后的标准溶解氧响应模型进行比较，最后绘制得到的沉积物原位样品在好氧和厌氧条件下的沉积物-水界面的溶解氧二维动态分布图。

作为优选，所述采集的沉积物原位样品的沉积物高度为20±5cm，上覆水的高度为10±2cm。

有益效果：与现有技术相比，（1）本发明专利使用简单高效的方法制备溶解氧荧光传感膜，利用荧光比率成像原理，最终实现沉积物-水界面溶解氧的原位二维高分辨率检测。所述发明专利溶解氧传感膜的制备方法简单高效，不需要复杂设备。相比于传统的溶解氧传感膜制备方法使用的是甲苯氯仿等剧毒溶剂以及聚苯乙烯等难降解材料；本发明专利溶解氧传感膜制备过程中使用的有机溶剂为乙醇，聚合物为HydroMed D4，两者都是无毒的溶液/材料，HydroMed D4同时还具有良好的气体渗透性可增加传感膜的敏感性。并且本发明专利溶解氧传感膜具有快速的反应时间（小于10s），具有良好的可逆性，涂覆白色硅橡胶涂层降低了背景干扰并提高了传感膜的稳定性。因此，本发明专利在满足简单高效、环境友好型及高性能的条件下，解决沉积物-水界面原位二维高分辨率溶解氧测定的难题。（2）长期以来沉积物溶解氧的测定只能使用丹麦的微电级系统，进口的溶解氧电极价格昂贵且极易损坏，对沉积物的研究造成不便。本发明专利打破国外垄断现状，并且将传统的分辨率从一维提高到了二维水平，为全面深入开展湖泊、水库、河道和海洋沉积物-水界面的研究提供了强有利的工具。

附图说明

图1是本发明所述荧光传感膜的沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法的原理结构示意图；

图2是本发明所述溶解氧传感膜在不同溶解氧浓度下的红色和绿色通道荧光强度示意图；

图3是本发明实施例所述溶解氧传感膜在不同溶解氧浓度下的荧光强度比值与溶解氧响应曲线；

图4是本发明实施例所述溶解氧传感膜在好氧和厌氧条件下沉积物-水界面溶解氧的二维动态变化信息对比示意图；

图5是本发明实施例所述解氧传感膜获取苦草成长第5天和第10天根系沉积物溶解氧的二维分布信息对比示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

下面结合附图进一步说明本发明专利的沉积物-水界面二维高分辨率溶解氧动态变化的快速检测方法及其工作原理。

如图1，一种沉积物-水界面二维高分辨率溶解氧动态变化的快速检测方法，包括采集沉积物的透明聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃管、黑色遮光板、溶解氧传感膜平面光极、激发光源、滤光片、CMOS相机和电脑。采样管内包含沉积物和上覆水。

（1）首先将制备荧光传感膜的氧气敏感性染料PtOEP和参比染料Coumarin 6溶于乙醇中获取染料储备液（PtOEP和Coumarin 6的浓度为1~5mg/ml）；将HydroMed D4加入到体积比为9：1的染料储备液与水的混合溶液中搅拌溶解得到铸膜液（HydroMed D4的浓度为0.05~0.1g/ml）；使用刮涂或旋涂的方法将铸膜液涂覆在透明的聚酯薄膜表面，并干燥至少12 h；待传感层完全干燥后，将白色硅橡胶涂覆在传感层表面作为遮光层和保护层并干燥至少24 h后最终制得溶解氧传感膜。

（2）将制备完成的溶解氧传感膜贴附在盛有不同溶解氧浓度的去离子水长方形透明聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃容器的内壁。使用395 nm的紫外激发光源照射传感膜，最后使用CMOS相机并结合500 nm长通滤光片获取不同氧气浓度下的传感膜荧光图像。提取不同溶解氧浓度下传感膜荧光图像的红色通道R和绿色通道G，如图2所示，计算两个通道的荧光强度比值F＝R/G，使用单指数拟合方程进行曲线拟合，得到传感膜对溶解氧的响应曲线：

式中，式中C为溶解氧的浓度；a，b和F0为拟合参数。所述的复合荧光传感膜对溶解氧的响应曲线如图3所示，最终得到校准曲线：

（3）将经过校准的溶解氧传感膜平整贴于透明的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃管（推荐的尺寸高度30 cm，内径9 cm）内壁避光带至太湖采样点，采集沉积物原位样品（约20 cm沉积物，10 cm上覆水）避光迅速运回实验室，在上覆水中缓慢充入氧气流量为0.4 L/min，好氧培养3天稳定后将有机玻璃盒移至暗室中获取荧光图像。随后将氧气换成氮气，充入氮气流量为0.4 L/min，厌氧培养3天稳定后将有机玻璃盒移至暗室中获取荧光图像。根据前述方法，计算并绘图后可以得到好氧，厌氧沉积物-水界面的溶解氧二维动态分布，如图4所示。结果表明，好氧显著增加上覆水及沉积物的溶解氧浓度值，相反，厌氧显著降低上覆水及沉积物的溶解氧浓度值，好氧条件下上覆水的溶解氧为250 µM，而厌氧条件下上覆水溶解氧降低至0 µM。

（4）与（3）相似，使用溶解氧的传感膜贴附完成的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃管避光带至太湖采样点，采集沉积物原位样品后避光迅速运回实验室。在沉积物里种植苦草幼苗，将贴附传感膜的柱子向地面倾斜45°C使得苦草根系在重力作用下贴附膜生长，分别待其生长5天及10天后将有机玻璃盒移至暗室中获取荧光图像。根据前述方法，计算并绘图后可以获取苦草根系周边沉积物的溶解氧二维动态分布。结果表明由于根系泌氧，根系周边沉积物溶解氧浓度显著高于非根系区沉积物，苦草生长第5天根系周边沉积物的溶解氧高于第10天，如图5所示。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种溶解氧荧光传感膜的制备方法及沉积物-水界面溶解氧二维动态分布检测方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。