专利摘要

本发明属于秸秆资源化处理领域，涉及一种利用秸秆发酵制备生物表面活性剂的方法。步骤如下：秸秆的预处理、发酵菌群的驯化及富集、秸秆发酵和生物表面活性剂的提纯。本发明以农业废弃物秸秆为原料，利用微生物发酵的方法制备生物表面活性剂，提供了一种低成本生产生物表面活性剂的方法。该方法既能为秸秆资源化利用提供新途径，又可以大大降低现阶段生产生物表面活性剂的成本。

权利要求

1.一种利用秸秆发酵制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)秸秆的预处理

将秸秆粉碎至1-3cm的小段，在2-3MPa的压力下，用蒸汽将玉米秸秆加热到120-190℃，维持2-10min，然后瞬间减至常压；秸秆粉末与水按照固液质量比1：5-15混合，加热至微沸状态5-60min，去除秸秆中的半纤维素；

(2)发酵菌群的驯化及富集

将含油废水接入琼脂平板培养基中，于25-35℃条件下恒温培养4-10天，形成菌落；将菌落接种到液体发酵培养基中，调节pH 6.5-7.5，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，筛选出具有表面活性剂能力的菌种；将具有表面活性剂能力的菌种再次接种到液体发酵培养基中，调节pH 6.5-7.5，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，驯化14-35天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为秸秆发酵的接种菌剂；

所述的琼脂平板培养基组成：胰蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉18.0g/L，pH 7.0-7.2；

所述的液体发酵培养基组成：葡萄糖5-10g/L，硝酸铵4-8g/L，硫酸镁0.2-0.4g/L，氯化钙0.06-0.10g/L，酵母粉0.2-1.0g/L，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L，磷酸氢二钠6-10g/L，初始pH 7.2；

(3)启动秸秆发酵

将步骤(1)预处理后的秸秆按照质量百分比2-10％加入液体发酵培养基，灭菌后，再接种体积百分比5-20％的接种菌剂，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，发酵周期7-15天，得到发酵液；

(4)生物表面活性剂的提纯

对步骤(3)得到的发酵液进行粗离心，去除大粒固体物质，对剩下的溶液调节pH为1.0-3.0，10000-18000r/min离心10-20min以去除菌体；在60-90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩，浓缩液加入NaCl，静置24-48h，肉眼可见有浅黄色沉淀产生；过滤收集浅黄色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液在35-45℃条件下蒸干，得到黄褐色沉淀，即为生物表面活性剂。

说明书

技术领域

本发明属于秸秆资源化处理领域，涉及一种利用秸秆发酵制备生物表面活性剂的方法。

背景技术

“十二五”期间，在国家有关部门和各地政府积极推动和支持下，秸秆综合利用取得了显著成果，各地投资建设了一批秸秆人造板、秸秆直燃发电、秸秆沼气、秸秆气化、秸秆成型燃料等综合利用项目。同时，多种形式的秸秆还田、保护性耕作、秸秆快速腐熟还田、过腹还田、栽培食用菌等技术的推广应用，在一定程度上减少了秸秆焚烧现象。据国家发改委和农业部对全国“十二五”秸秆综合利用情况进行的评估结果显示，2015年全国秸秆理论资源量为10.4亿吨，可收集资源量为9.0亿吨，利用量约为7.2亿吨。但是，这些技术、产品的附加值比较低，实施过程中存在亏损运营等问题，对企业和个人的推动性不强。因此，如何提高秸秆综合利用下游产品的附加值是解决秸秆综合利用的一个重要发展方向。

生物表面活性剂是在一定的条件下，由微生物产生的一种具有表面活性的代谢产物，其具特点是同时具有亲油性和亲水性。与其他表面活性剂相比较，生物表面活性剂具有稳定性好、无毒性、耐酸耐盐性好、对环境无污染、可被生物降解及抗菌性等特性。目前我国生产生物表面活性剂的方法通常是直接以小分子有机物(糖、氨基酸等)或者油脂类物质(液体石蜡、食用油等)为原料利用微生物发酵制得。这些原料往往本身就是商品，成本较高，不利于生物表面活性剂产品的规模化生产。

发明内容

本发明提供了一种高附加值的秸秆综合利用新途径。本发明阐述了利用含油废水中筛选驯化的菌群，对预处理后的秸秆进行发酵，得到生物表面活性剂的过程。

本发明的技术方案：

一种利用秸秆发酵制备生物表面活性剂的方法，步骤如下：

(1)秸秆的预处理

将秸秆粉碎至1-3cm的小段，在2-3MPa的压力下，用蒸汽将玉米秸秆加热到120-190℃，维持2-10min，然后瞬间减至常压，秸秆粉末与水按照固液质量比1：5-15混合，加热至微沸状态5-60min，去除秸秆中的半纤维素；

(2)发酵菌群的驯化及富集

将含油废水接入琼脂平板培养基中，于25-35℃条件下恒温培养4-10天，形成菌落；将菌落接种到液体发酵培养基中，调节pH 6.5-7.5，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，筛选出具有表面活性剂能力的菌种；将具有表面活性剂能力的菌种接种到液体发酵培养基中，调节pH 6.5-7.5，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，驯化14-35天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为秸秆发酵的接种菌剂；

所述的琼脂平板培养基组成：胰蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉18.0g/L，pH 7.0-7.2；

所述的液体发酵培养基组成：葡萄糖5-10g/L，硝酸铵4-8g/L，硫酸镁0.2-0.4g/L，氯化钙0.06-0.10g/L，酵母粉0.2-1.0g/L，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L，磷酸氢二钠6-10g/L，初始pH 7.2；

(3)启动秸秆发酵

将步骤(1)预处理后的秸秆按照质量百分比2-10％加入液体发酵培养基，灭菌后，接种体积百分比5-20％的接种菌剂，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，发酵周期7-15天，得到发酵液；发酵效果根据菌剂接入量及发酵体系启动速度而定，一般发酵前期获得生物表面活性剂的量逐渐增加，待培养基中碳源逐渐减少后，表面活性剂的量将逐渐减少。

(4)生物表面活性剂的提纯

对步骤(3)得到的发酵液进行粗离心，去除大粒固体物质，对剩下的溶液调节pH为1.0-3.0，10000-18000r/min离心10-20min以去除菌体；在60-90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩，浓缩液加入NaCl，静置24-48h，肉眼可见有浅黄色沉淀产生；过滤收集浅黄色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液在35-45℃条件下蒸干，得到黄褐色沉淀，即为生物表面活性剂。

本发明的有益效果：本发明提供了一种利用微生物菌群发酵秸秆制备生物表面活性剂的技术方法，以农业废弃物秸秆为原料，利用微生物发酵的方法制备生物表面活性剂，提供了一种低成本生产生物表面活性剂的技术方法。该技术既能为秸秆资源化利用提供新途径，又可以大大降低现阶段生产生物表面活性剂的成本。

具体实施方式

以下结合技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例

(1)取自然风干的玉米秸秆，粉碎至3cm的小段，在2.5MPa的压力下，用蒸汽将玉米秸秆加热到150℃，维持5min，然后瞬间减至常压，以固液比1∶10(秸秆粉末与水溶液的比例)混合，用电炉加热，保持微沸状态30min。去除半纤维素。

(2)将石化含油废水接入琼脂平板培养基中，于25-35℃条件下恒温培养，4-10天后形成菌落。将菌落接种到液体发酵培养基中，调节pH 6.5-7.5，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，利用泡沫性能筛选法和排油圈筛选法选出具有最优产表面活性剂能力的菌种。将各菌种重复接种到液体发酵培养基中，保持上述发酵条件，驯化14-35天。驯化完成后的菌种于低温保存，作为秸秆发酵的接种菌剂。

筛选培养基组成：胰蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉18.0g/L，pH 7.0-7.2。

发酵培养基组成：葡萄糖5g/L，硝酸铵3.1g/L，酵母粉0.8g/L，磷酸二氢钾2.4g/L，磷酸氢二钠9.6g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.08g/L，pH 7.0-7.5。

(3)预处理后秸秆以3％比例加入发酵培养基，培养基灭菌后接种10％的菌剂，温度25-35℃，搅拌转速100-200r/min，发酵周期7-15天。

(4)发酵结束后，对发酵液进行粗离心。去除大粒固体物质后，剩下的溶液用浓盐酸调节pH为1.0，18000r/min离心20min以去除菌体。用旋转蒸发仪对上清液在80℃条件下进行浓缩，浓缩液加入适量NaCl，静置48h，肉眼可见有浅黄色沉淀产生。过滤收集上述沉淀，用少量乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液在35-45℃条件下蒸干，得到黄褐色沉淀，即为生物表面活性剂粗产品。

(5)对得到的生物表面活性剂进行了带电性分析、红外分析及¹H NMR分析，推测该表面活性剂为以糖环结构为主，部分羟基被甲氧基取代的阴离子表面活性剂。发酵液能将纯水的界面张力降低到37mN/m以下，最大产量为2.87g/L。

一种利用秸秆发酵制备生物表面活性剂的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。