专利摘要

具有抗肿瘤活性的砷糖化合物及其制法和应用。本发明涉及N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺。由阿散酸经过二氧化硫还原，盐酸成盐，碱化，上保护基制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺，然后与炔丙酸在N,？N’-环己基碳二亚胺作用下生成N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺；2-叠氮-1,3,4,6-O-乙酰基-D-葡萄糖与N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺反应生成N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,？6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺；所得产物再与1，2-乙二硫醇反应得到本发明所述化合物。

权利要求

1.N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I，其结构式如下：

。

2.权利要求1所述化合物I的合成方法，其特征是包括以下步骤：

步骤一：以阿散酸为原料，在二氧化硫与碘化钾的作用下还原成三价砷化物后，经过盐酸酸化成4-二氯砷苯胺盐酸盐；4-二氯砷苯胺盐酸盐经过以下两种方法之一制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；方法一：在碱性条件下生成对氨基苯基氧化砷，再进一步在溶剂中与1，2-乙二硫醇反应生成4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；方法二：4-二氯砷苯胺盐酸盐直接在碱性条件下与1，2-乙二硫醇反应生成4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；

步骤二：以4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺为原料，与炔丙酸在N,N’-环己基碳二亚胺作用下生成N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺；

步骤三：2-叠氮-1,3,4,6-O-乙酰基-D-葡萄糖中间体与N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺在溶剂中在一价铜催化下发生点击反应生成N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺；

步骤四：N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺在溶剂中与1，2-乙二硫醇反应生成产物N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤二中4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺与丙炔酸在N,N’-环己基碳二亚胺作用下生成N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺；所用的溶剂是二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤三的反应条件是在氮气保护的条件下，在体积比为1:1的叔丁醇与水混合溶剂或者N,N-二甲基甲酰胺中100℃反应4小时，或者在微波合成仪中反应30min。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤四的反应条件是在甲醇中室温搅拌4小时。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤一中经过盐酸酸化成4-二氯砷苯胺盐酸盐后，经过过滤和干燥后再用于制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；步骤一方法一中，4-二氯砷苯胺盐酸盐先在碱性条件下水解后，经过过滤、干燥，再在甲醇中与1，2-乙二硫醇反应，经过重结晶得到4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；步骤一方法二中，4-二氯砷苯胺盐酸盐在碱性条件下直接与1，2-乙二硫醇反应，经过重结晶得到4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺。

7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤二反应完成后，经过柱层析得到N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺。

8.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤三的后处理经过硅藻土过滤，减压蒸馏，柱层析得到N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺。

9.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤四反应完成后将反应体系浓缩，析出晶体或者柱层析，干燥得到N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I。

10.权利要求1所述化合物在制备抗直肠癌的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤活性的化合物N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺及其制备方法及其应用。

本发明提供具有良好抗直肠癌活性的化合物N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺及其制备方法及其应用。

背景技术

直肠癌是指从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌，是消化道最常见的恶性肿瘤之一。直肠癌位置低，容易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断。目前，直肠癌的治疗需要以外科手术为主，辅以化疗、放疗的综合治疗。对于手术治疗，因其位置深入盆腔，解剖关系复杂，手术不易彻底，术后复发率高。中下段直肠癌与肛管括约肌接近，手术时很难保留肛门及其功能是手术的一个难题，也是手术方法上争论最多的一种疾病。化疗、放疗在杀死癌细胞的同时也会将正常细胞杀死，还能导致胃肠功能紊乱、骨髓抑制等副作用，大大降低了患者的生存质量。因此，寻找一种代替或部分代替手术、化疗、放疗方法的药物，具有十分重要的意义。

本发明涉及的化合物N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I经过检测具有良好的抗肿瘤活性，是未见文献报道的新化合物。本发明所用的原料为2-氨基葡萄糖是可以来自壳聚糖降解的产物。壳聚糖在动物体内的降解成为2-氨基葡萄糖。壳聚糖也有文献报道具有抗肿瘤的生物活性。文献报道1，4位取代的1，2，3-三唑具有良好的抗肿瘤活性。在三唑衍生物的4位引入对氨基苯基氧化砷（3价）及其相应的衍生物。文献报道三价的砷化物具有良好的抗肿瘤活性，但是细胞毒性较大。最近文献报道壳聚糖可以减低三价砷化物的毒性，同时能够协同增强抗肿瘤活性。2-氨基葡萄糖是壳聚糖的单体，对2-氨基进行叠氮化的修饰后，可通过点击反应引入三价砷化物。1，2-乙二硫醇保护的三价砷化物就有靶向定位，同时又可以保护三价砷化物。文献报道天然砷糖是无毒的。

发明内容

本发明的目的是提供一种化合物及其制备方法和用途，该化合物具有良好的抗肿瘤效果。

本发明提供的技术方案是：N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺（化合物I），其结构式为：

。

本发明还提供了上述化合物I的合成方法，包括以下步骤：

步骤一：以阿散酸为原料，经过二氧化硫还原，盐酸成盐，碱化，上保护基制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；或者以阿散酸为原料，经过二氧化硫还原，盐酸成盐，直接在碱性条件下上保护基团制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺。

步骤二：以4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺为原料，与炔丙酸在N,N’-环己基碳二亚胺作用下生成N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺。

步骤三：2-叠氮-1,3,4,6-O-乙酰基-D-葡萄糖中间体与N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺在溶剂中在一价铜催化下发生点击反应生成N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺。

步骤四：N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺在溶剂中与1，2-乙二硫醇反应生成产物N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I。

上述步骤一中制备4-二氯砷苯胺盐酸盐所用的溶剂是甲醇、四氢呋喃之一。反应温度是室温。制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺所用的溶剂是甲醇或碳酸钠水溶液。其中运用4-二氯砷苯胺盐酸盐通过氨水碱化，析出晶体后过滤，经过干燥之后，溶于甲醇或四氢呋喃之中，与1.0当量的1，2-乙二硫醇反应生成4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；运用4-二氯砷苯胺盐酸盐直接在1.0当量的碳酸钠的水溶液中与1.1当量的1，2-乙二硫醇反应4小时析出4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺，过滤，干燥。

上述步骤一中经过盐酸酸化成4-二氯砷苯胺盐酸盐后，经过过滤和干燥后再用于制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；步骤一方法一中，4-二氯砷苯胺盐酸盐先在碱性条件下水解后，经过过滤、干燥，再在甲醇中与1，2-乙二硫醇反应，经过重结晶得到4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺；步骤一方法二中，4-二氯砷苯胺盐酸盐在碱性条件下直接与1，2-乙二硫醇反应，经过重结晶得到4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺。

上述步骤二的溶剂是二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、甲醇之一。反应温度是室温。步骤二反应完成后，经过柱层析得到N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺。

上述步骤三中的溶剂是水与叔丁醇的混合溶剂（体积比为1:1）或者N，N-二甲基甲酰胺。在一价铜（抗坏血酸钠与二价铜盐如：硫酸铜、乙酸铜、三氟甲烷磺酸铜等原位生成即可或碘化亚铜）催化下发生点击反应，同时脱保护基生成N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺。反应条件是在氮气保护的条件下，反应时间是100^oC加热4小时或者微波100^oC加热30min。步骤三的后处理经过硅藻土过滤，减压蒸馏，柱层析得到N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺。

步骤四的反应条件是在甲醇中室温搅拌4小时。

步骤四反应完成后将反应体系浓缩，析出晶体或者柱层析，干燥得到N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I。

本发明采用便宜的阿散酸为原料经过三步反应制备N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I。

本发明所述化合物I具有抗直肠癌的活性，可以作为活性药物在制备抗直肠癌的药物中的应用。

本发明化合物I的制备路线：

具体实施方式

以下实例进一步说明本发明，并不意味着对本发明的限制：

实施例一：4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺的制备，甲醇作溶剂。通过方法一先制备4-二氯砷苯胺盐酸盐，再氨水作用下水解得到4-氨基苯基氧化砷（3价砷），再与1，2-乙二硫醇反应制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺。称取阿散酸（对氨基苯砷酸）(10g,46.08mmol)，碘化钾（50mg,0.30）溶于60mL甲醇和48mL浓盐酸混合溶剂中。通入二氧化硫气体30min至溶液从橙红色变成浅黄色。白色固体析出。溶液降温至0^oC，静置过夜。抽滤，滤饼用冷乙醚50mL洗涤两次。得到白色固体4-二氯砷苯胺盐酸盐（12.57g,95%）。

4-二氯砷苯胺盐酸盐（12.57g,43.78mmol）分批加入20mL浓氨水中，搅拌30min后，白色固体析出。过滤，滤饼用10mL水洗涤两次，真空干燥，得到白色固体4-氨基苯亚砷酸（3价）。

4-氨基苯亚砷酸(1.504g,7.675mmol)溶于150mL甲醇，室温下加入1，2-乙二硫醇(651uL,7.751mmol)反应4小时后，过滤，得到白色固体4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺(1.0g,收率50%)。

实施例二：4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺的制备，甲醇作溶剂。通过方法二先制备4-二氯砷苯胺盐酸盐，直接与1，2-乙二硫醇反应制备4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺。

称取阿散酸（对氨基苯砷酸）(10g,46.08mmol)，碘化钾（50mg,0.30）溶于60mL甲醇和48mL浓盐酸混合溶剂中。通入二氧化硫气体30min至溶液从橙红色变成浅黄色。白色固体析出。溶液降温至0^oC，静置过夜。抽滤，滤饼用冷乙醚50mL洗涤两次。得到白色固体4-二氯砷苯胺盐酸盐（12.57g,95%）。

4-二氯砷苯胺盐酸盐（12.57g,57.96mmol）溶于300mL水溶液中，冰水外降温至0-5^oC，分批加入碳酸钠（共10.65g,57.96mmol）,冰浴30min后加入1，2-乙二硫醇（4.86mL,57.96mmol）。搅拌4小时。析出白色固体4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺(9.68g,64%)。

实施例三：以4-(1,3,2-二硫砷烷)苯胺为原料，以二氯甲烷作溶剂。与炔丙酸在N,N’-环己基碳二亚胺作用下生成N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺。

炔丙酸（216uL,3.521mmol）加入到溶有N，N’-环己基碳二亚胺（726.5mg,3.521mmol）的二氯甲烷（10mL）中，室温下搅拌1小时，冰浴降温搅拌30min后滴加(1,3,2-二硫砷烷)苯胺(760.6mg,2.934mmol)的二氯甲烷（10mL）。滴加完毕，保温反应30min,逐渐升温至室温反应过夜。反应完毕。硅藻土过滤，减压蒸干溶剂，残余物柱层析（淋洗液：石油醚：乙酸乙酯=4:1），得到黄色固体（584.5mg,64%）。

实施例四：2-叠氮-1,3,4,6-O-乙酰基-D-葡萄糖中间体与N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺在叔丁醇与水（体积比为1:1）溶剂中在无水硫酸铜与抗坏血酸钠催化下发生点击反应生成N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺。

2-叠氮-1,3,4,6-O-乙酰基-D-葡萄糖（70.5mg,0.1889mmol），N-(4-(1,3,2-二硫砷烷)苯基)炔酰胺（64.7mg,0.2079mmol）,五水硫酸铜（106.3mg,0.4250mmol）和抗坏血酸钠（3.8mg,0.01889mmol）溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下100^oC反应4小时，反应完毕，减压蒸干溶剂。向残余物中加入5mL水和20mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。残余物经过柱层析（二氯甲烷：甲醇=20:1）,得到白色固体N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺（44mg,收率：38%）。

实施例五：N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺在甲醇中与1，2-乙二硫醇反应生成产物N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I。

N-（4”-氧化砷苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺（44mg,0.07232mmol）溶于4mL甲醇，加入1，2-乙二硫醇（6.1uL，0.07305mmol）。室温下搅拌4小时，析出白色固体，重结晶得到白色晶体N-（4”-(1”,3”,2”-二硫砷烷)苯基）-1-（1’,3’,4’,6’-O-乙酰基-D-葡萄糖）-1，2，3-三唑-4-甲酰胺I（26mg,收率：52.55%）。产物为β和α构型的混合物。其中β:α=17:50经过¹HNMR和¹³CNMR和HR-MS表征。

¹HNMRα构型:δ=8.92(s,1H),8.28(s,1H),7.81-7.62(m,4H),6.42(d,J=3.2Hz,1H),6.06-6.01(m,1H),5.33-5.28(m,1H),4.72-4.67(m,1H),3.76(m,1H),3.39-3.32(m,2H),3.20-3.14(m,2H),2.14-1.99(m,12H);

¹HNMRβ构型:δ=8.96(s,1H),8.23(s,1H),7.81-7.62(m,4H),6.28(d,J=8.4Hz,1H),5.92-5.87(m,1H),5.26-5.22(m,1H),4.42-4.35(m,1H)，4.18-4.10(m,2H),3.48(m,1H),3.39-3.33(m,2H),3.20-3.14(m,2H),2.14-1.99(m,12H).

¹³CNMRα/β构型:δ=170.47,169.65,169.57,169.03,167.9,157.34,143.27,139.51,139.46,138.14,138.10,131.72,126.87,125.21,119.69,119.65,91.54,89.78,73.10,72.08,69.99,68.74,68.17,68.03,63.33,61.64,61.30,41.87,29.69,20.70,20.66,20.52,20.49,20.26,20.21;

HRMS:M+H⁺:C25H30AsN4O10S2理论值：685.0619，实测：685.0620.

从下面实验可以看出化合物I所示的化合物具有良好的直肠癌生物活性。

实施例六：

实验方法

（1）细胞培养

结直肠癌细胞株HCT116由本实验室长期保存于液氮中，使用前培养于含10%胎牛血清的培养基RPMI培养基1640(GIBCO)中，置于37oC、饱和湿度及5%CO₂培养箱常规培养，每2~4天传代，取对数生长期的细胞进行实验。

（2）MTS细胞毒性实验

取对数生长期的细胞结直肠癌细胞HCT116制备细胞悬液，接种在96孔细胞培养板中，在含有10%FBS的培养基中培养过夜，第二天加入不同浓度的化合物，在5%CO₂培养箱培养；72h终止培养，加入MTS(Promega)，37oC孵育1-4小时，在酶标仪(ThermoScientificVarioskanFlash）上于490nm读取吸光值。计算细胞毒性IC₅₀。分别重复三次以上。取平均值。

化合物Ia的IC₅₀=1.34uM,

实验表明：本发明中的I具有良好的抗直肠癌的活性，也可以用做肿瘤的抑制剂。

具有抗肿瘤活性的砷糖化合物及其制法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。