可耐受硫酸盐的红串红球菌及其应用

IPC分类号 : C12N1/20,C12N15/31

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CN200410087892.X

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专利摘要

本发明涉及的红串红球菌，为RhodococcuserythropolisSDUZAWQ，于2004年3月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.1129。该菌株是从炼油厂污水，土壤中分离获得的；该菌株的细胞培养液可以通过氧化断裂C－S键高效脱除二苯并噻吩，4，6－二甲基－二苯并噻吩，4－甲基－二苯并噻吩，苯并噻吩，5－甲基－苯并噻吩中的硫；使用二苯并噻吩和硫酸钠混合硫源培养RhodococcuserythropolisSDUZAWQ，获得的休止细胞培养液可以有效脱除经过加氢精制柴油中的硫。

权利要求

1.一株红串红球菌，其特征在于：该红串红球菌为Rhodococcuserythropolis SDUZAWQ，2004年3月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.1129。

2.如权利要求1所述的红串红球菌，其特征在于：该Rhodococcuserythropolis SDUZAWQ菌株适宜在中常温条件下培养，其细菌学特征：为革兰氏阳性菌，形态为杆状和多形态，菌落颜色为橘黄色。

3.如权利要求1所述的红串红球菌，其特征在于：该Rhodococcuserythropolis SDUZAWQ菌株好氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不能水解淀粉，酪素，明胶，酯酶阳性，硝酸盐还原阳性，可以利用柠檬酸，精氨酸双水解酶阴性，反硝化阴性，VP实验阴性，MR实验阴性；有机物产酸结果如下：葡萄糖，乳糖，亮氨酸，甘露糖，甘露醇，乙酸盐，山梨糖，苹果酸盐，丙酸盐，蔗糖，海藻糖，乳酸盐，谷氨酸，精氨酸，果糖，缬氨酸，乙醇，苯并氨酸，肌醇均为阳性；阿东醇，麦芽糖，阿拉伯糖，赖氨酸，卫矛酸为阴性。

4.如权利要求1所述的红串红球菌，其特征在于：本发明的菌株Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ 16S rRNA基因序列如下：

GGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGG

GGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGC

CCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATA

TGACCTCCTATCGCATGGTGGGTGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAG

GATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACC

AAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACAC

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG

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TTGATACTGCAGGGGAGATGGAATTCTGG。

5.如权利要求1所述的红串红球菌，其特征在于：使用混合硫源培养该Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的休止细胞液通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。

6.一种权利要求1～5任一权利要求所述红串红球菌在脱除化石燃料中有机硫的应用。

7.一种权利要求1～5任一权利要求所述红串红球菌在加氢精制柴油脱硫、加氢精制汽油脱硫中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一株耐受硫酸盐的红串红球菌及其在脱除化石燃料中有机硫的应用。

技术背景

背景技术

化石燃料煤和石油中所含有的有机硫和无机硫是环境的重要污染源，这些硫化物燃烧时排放出大量的二氧化硫等毒性气体，由此造成大面积酸雨严重污染大气和水源，破坏生态平衡，危害人类生存。多年的持续开发使得现存含硫量低的化石燃料越来越少。随着能源危机的逐步加剧，高硫化石燃料的开采成为必然。高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用。物理的和化学的脱硫方法成本巨大，而微生物脱硫工艺由于操作压力、温度低，运转成本少，具有广阔的前景。化石燃料中含有的有机硫化合物成分复杂，大部分是杂环化合物，其中的C-S化学共价键十分牢固，用一般常规的物理和化学方法无法较有效地除去有些杂环中的有机硫。

随着环保法规的日益严格和可持续发展战略的提出，化石燃料中硫化物的脱除受到重视，世界许多国家和国际组织对燃料中的硫含量提出了越来越严格的要求。如何降低化石燃料中的硫含量成为各国研究者关注的焦点。

现今主要的燃油脱硫方法是物理化学及生物处理这两种方法。物理化学的加氢脱硫方法(Hydrodesulfurization，简称HDS)是脱除燃料油中硫的主要的方法，HDS通过催化过程，将有机硫转化成H₂S气体，反应需要2～15MPa的压力和250-450℃的高温。大部分的无机硫及沸点较低的有机硫化合物在此过程中很容易的脱去，但是沸点较高的杂环类含硫化合物却很难脱除。

生物脱硫方法(Biodesulfurization，简称BDS)条件温和，设备简单，且具有高度的专一性，能够脱除燃料中杂环含硫化合物中的有机硫且不损失燃料的热值，是一种很有前途的脱硫方法，应用前景十分广泛。该方法具有成本廉价、高度专一性、反应的条件温和等一系列的优点已被许多厂家所关注，很多国内外的研究机构也对BDS方法进行了深入的研究。

生物脱有机硫的研究是以二苯并噻吩(Dibenzothiophene，简称DBT)为模式化合物进行的。微生物脱除有机硫主要的研究对象为一些能够走“4S”途径(如图1)专一性进行脱硫的微生物，如红球菌属(Rhodococcus)、假单孢菌属(Pseudomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)等的一些菌株。微生物的这种方式的脱硫并没有破坏化合物的烃环结构，即没有降低燃料的热值。

催化柴油馏分中的含硫化合物主要是DBT和苯并噻吩(Benzothiophene，简称BT)及各种烷烃取代物。随着噻吩类含硫化合物的环数的增加，多环噻吩因空间位阻效应使加氢脱硫催化剂反应活性迅速降低。其中DBT较易脱除，但随着烷烃取代基的增加微生物的降解能力下降。一些通过专一途径脱硫的微生物，如红球菌(Rhococcus sp.)SY1、红串红球菌(R.erythropolis)D-1和戈登氏菌(Gordona sp.)CYKS1，它们既能在含DBT的培养基上生长，也能在其它的含硫化合物上生长。DBT的衍生物，如烷基化的DBT是化学法难以脱除的，生物法是否能够有效降解这些有机硫化合物也是生物脱硫研究的重点。

能够专一性降解BT的菌株，主要有Gordonia sp.213E，类芽孢杆菌A11-2(Paenibacillus)，红球菌T09(Rhodococcus)，根瘤菌KT55(Sinorhizobium)及红球菌KT462。它们的降解途径已经分析的较为清楚(如图2)。其中Paenibacillus sp.A11-2，Sinorhizobium sp.KT55和Rhodococcus KT462菌株的BT降解途径和DBT的“4S”途径比较类似。而Gordonia sp.213E和Rhodococcussp.T09菌株BT降解途径和上面的类似，只不过降解BT的终产物不是氧-羟基苯乙烯，而是2-(2’-羟苯基)乙醛。

脱硫酶的活力受到脱硫产物硫酸盐的抑制，Ohshiro等(Ohshiro T.；SuzukiK.；Izumi Y.J.Ferment.Bioeng.1996，81，121)指出培养基中含0.5mM(表示mmol/L，下同)硫酸钠，完全阻遏酶的产生；Rhee等(Rhee S.K.；Chang J.H.；Chang Y.K.；Chang H.N.Appl.Environ.Microbiol.1998，64，2327)报道当硫酸盐加到培养基中后，DBT即不被降解表明硫酸盐完全阻遏降解DBT酶产生；Omori等(Omori T.；Saiki Y.；Kasuga K.；Kodama T.Biosci.Biotech.Biochem.1995，59，1195)和Wang & Krawiec(Wang P.；Krawiec S.Appl.Environ.Microbiol.1996，62，1670)在研究中也发现类似的结果。在生物脱硫工艺中，昂贵的诱导剂DBT的使用直接影响着脱硫催化剂制备的成本。

因此，围绕筛选一些较有价值的、可专一性地脱除DBT和BT及其烷烃取代化合物中有机硫的菌株，并且菌株的脱硫活力不受或者少受产物硫酸盐的抑制，并进一应用于化石燃料的脱硫工作，也是目前本领域急需研究和解决的课题。

但是，上述诸菌及其在脱硫的实际应用中，存在如：脱硫活力低，脱硫活力受到产物硫酸盐的抑制，菌株能够作用的底物范围窄等缺点。而关于利用具有硫酸盐耐受性，宽泛底物范围的红串红球菌在脱除化石燃料中的有机硫的应用的专利及相关文献，至今未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服以上红球菌的缺陷，提供一株可以降解DBT，BT及其甲基衍生物，并在硫酸盐存在的情况下，脱硫活力还可以表达，从而可以使用混合硫源制备脱硫催化剂，并能够降解多种含硫有机化合物的红串红球菌。

本发明提出一种红串红球菌及在脱除化石燃料有机含硫化合物中的硫的应用。该红串红球菌株为Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ，已于2004年3月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.1129。

该Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株是从油田、炼油厂等处，采集土样或水样，以二苯并噻吩为惟一硫源，经过富集传代培养，纯化获得的；

其具体筛选步骤如下：

从炼油厂污水排放口等地取得土样、水样，用基本无机盐培养基(培养基组成：1升蒸馏水中含：2.44g的KH₂PO₄，5.57g的Na₂HPO₄，2g的NH₄Cl，0.2g的MgCl₂，2g的甘油，1mL的微量元素混合液。其中微量元素混合液组成为：1升蒸馏水中含：1g的CuCl₂·2H₂O，4g的CoCl₂·6H₂O，2g的ZnCl₂，40g的CaCl₂，0.5g的H₃BO₃，2g的NaMoO₄·2H₂O，40g的FeCl₃·7H₂O，1g的AlCl₃·6H₂O，8g的MnCl₂·4H₂O。)浸泡过夜，于30℃，200rpm振荡培养48h。培养液离心去除土样后离心得菌体，0.85％生理盐水洗涤菌体两次，悬浮于pH7.0磷酸钾缓冲液中。将此菌液1mL加入到含有0.5mM的DBT的上述基本无机盐培养基试管中30℃培养48h，转入新鲜的含有0.5mM的DBT的基本无机盐培养基中继续培养2d以上用基本无机盐培养基管作对照，有明显生长的，将此管的培养液稀释培养挑出单菌落，扩大培养，得到能降解DBT的菌株。

该Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株适宜在中常温条件下培养，其细菌学特征：为革兰氏阳性菌，形态为杆状和多形态。菌落颜色为橘黄色。

该Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ生理生化特征，见表1：菌株好氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不能水解淀粉，酪素，明胶，酯酶(Tween80)阳性，硝酸盐还原阳性，可以利用柠檬酸，精氨酸双水解酶阴性，反硝化阴性，VP实验阴性，MR实验阴性；碳水化合物等有机物产酸结果如下：葡萄糖，乳糖，亮氨酸，甘露糖，甘露醇，乙酸盐，山梨糖，苹果酸盐，丙酸盐，蔗糖，海藻糖，乳酸盐，谷氨酸，精氨酸，果糖，缬氨酸，乙醇，苯并氨酸，肌醇均为阳性；阿东醇，麦芽糖，阿拉伯糖，赖氨酸，卫矛酸为阴性。

表1生理生化实验结果

实验项目结果实验项目结果革兰氏染色阳性产酸实验结果(续) 细胞形状杆装、多形态甘露糖 + 菌落颜色橘黄色甘露醇 + 与氧的关系好氧麦芽糖 - 接触酶 + 乙酸盐 + 氧化酶 - 山梨糖 + 水解淀粉 - 苹果酸盐 + 水解酪素 - 丙酸盐 + 水解明胶 - 阿拉伯糖 - 酯酶(Tween80) + 蔗糖 + 硝酸盐还原 + 海藻糖 + 利用柠檬酸盐 + 乳酸盐 + 精氨酸双水解酶 - 谷氨酸 + 反硝化 - 赖氨酸 - VP实验 - 精氨酸 + MR实验 - 果糖 + 产酸实验结果缬氨酸 + 葡萄糖 + 乙醇 + 阿东醇 - 卫矛醇 - 乳糖 + 苯丙氨酸 + 亮氨酸 + 肌醇 +

本发明的菌株Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ 16S rRNA基因序列如下：

GGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGG

GGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGC

CCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATA

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通过在美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)查阅国际相关的基因库，本发明的菌株SDUZAWQ与其中有关菌株的16S rRNA基因虽有相识性(如表2所示)，但却不完全相同，说明本菌株是首次分离鉴定。

表2菌株SDUZAWQ 16S rDNA与GenBank提交菌株序列相似性比较

登陆路径及菌相关菌株名称分值 (Bits) 相似性 gb|AY147846.1|Rhodococcus erythropolis strain NVI 1146 99.2％ emb|AJ237967.1|RER237967 Rhodococcus erythropolis 1146 99.2％ gb|AY249053.1|Rhodococcus sp.BDC14 1146 99.2％ gb|AF420422.1|Rhodococcus sp.871-AN053 1146 99.2％ gb|AF420419.1|Rhodococcus sp.ENG-AN033 1146 99.2％ gb|AF420417.1|Rhodococcus sp.ARG-AN025 1146 99.2％ gb|AF420416.1|Rhodococcus sp.ARG-AN024 1146 99.2％

登陆路径及菌相关菌株名称分值 (Bits) 相似性 gb|AF420415.1|Rhodococcus sp.870-AN019 1146 99.2％ gb|AF420414.1|Rhodococcus sp.IND-AN014 1146 99.2％ gb|AF420412.1|Rhodococcus sp.ANT-AN007 1146 99.2％ gb|AY044096.1|Rhodococcus sp.67-BEN001 1146 99.2％ gb|AY044095.1|Rhodococcus sp.122-AN065 1146 99.2％ gb|AF501339.1|Rhodococcus erythropolis strain HAMBI2390 1146 99.2％ gb|AY077846.1|Rhodococcus sp.lawq 1146 99.2％ gb|AY167968.1|Swine manure bacterium 37-6 1146 99.2％ emb|AJ457058.1|RER457058 Rhodococcus erythropolis 1146 99.2％ emb|AJ313018.1|RSP313018 Rhodococcus sp.MN38 1146 99.2％ gb|AY024343.1|Rhodococcus sp.DTB 1146 99.2％ |gb|AY512641.1|Rhodococcus sp.Amico42 1146 99.2％ gb|U81990.1|NSU81990 Nocardioides simplex 1146 99.2％ dbj|AB010911.1|Rhodococcus sp.SRB1948-A07 1146 99.2％ gb|AF512838.1|Rhodococcus erythropolis CNCM2207 1142 99.2％ emb|AJ551166.1|RSP551166 Rhodococcus sp.An28 1138 99.0％ gb|AF046885.1|AF046885 Rhodococcus sp.Q15 1138 99.0％ emb|AJ505559.1|RSP505559 Rhodococcus sp.4115 1138 99.0％ emb|AJ244660.2|RSP244660 Rhodococcus sp.V4.BO.16 1138 99.0％ dbj|AB037105.1|Nocardia calcarea D3213 1138 99.0％ emb|X80618.1|NC16SR3 Rhodococcus erythropolis DSM43188T 1134 98.9％ gb|AF487704.1|Nocardia sp.H17-1 1132 99.0％ gb|AY162062.1|Actinobacterium PII_GH2.2.C11 1132 99.0％ dbj|AB037104.1|Nocardioides SNK120 1132 99.0％ gb|AY345526.1|Bacterium W14 1130 98.9％

登陆路径及菌相关菌株名称分值 (Bits) 相似性 emb|X89240.1|RSP16SRNA Rhodococcus sp. 1130 98.9％ gb|AF501338.1|Rhodococcus erythropolis HAMBI2393 1128 99.0％ dbj|AB071951.1|Rhodococcus baikonurus 1122 98.7％ gb|AF001265.1|AF001265 Rhodococcus erythropolis IGTS8 1116 98.7％ gb|AF500326.1|Rhodococcus sp.PG6 1114 99.2％ gb|AF442524.1|AF442524 Bromate-reducing bacterium B8 1112 98.5％ emb|AJ250929.1|RER250929 Rhodococcus erythropolis GJ70 1106 99.0％

进一步通过软件在美国生物工程信息中心使用BLASTN程序比对，对给出的序列使用VectorNTI软件构建进化树，SDUZAWQ和红球菌位于同一个分支上，鉴定SDUZAW为Rhodococcus erythropolis。

本发明的Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株既可以在营养培养基上生长，也可以在含有硫源(无机硫如Na₂SO₄，或有机含硫化合物如二甲基亚砜等)的基本无机盐培养基中生长。

本发明的菌株SDUZAWQ的应用方法有：(1)用硫酸钠为惟一硫源培养，收集菌体，直接用DBT诱导后用于化石燃料的脱硫；(2)用冷冻干燥的菌体细胞进行脱硫；(3)用该细胞的片段或者细胞提取液进行脱硫；(4)用该菌株中提纯的生物活性物质进行脱硫；(5)该菌进一步诱变处理后进行脱硫。

可有效降解二苯并噻吩(DBT)和苯并噻吩(BT)及它们的甲基衍生物。在2d内，BT与DBT可同时完全降解，0.5mM的BT在1d内可降解掉86％，降解速度好于DBT的降解。BT甲基衍生物5-MBT的降解情况也要好于DBT甲基衍生物4，6-DMDBT和4-MDBT。4-MDBT的降解较困难，要差于4，6-DMDBT的降解，在2d内，红球菌SDUZAWQ可降解62％的4，6-DMDBT，而相同条件下，4-MDBT仅能被降解36％。证实了该菌对硫酸盐较不敏感的特点，较适合于石油生物脱硫的实际应用所述的含硫化合物为有机含硫化合物，本发明的红串红球菌尤其可以脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的有机含硫化合物中的硫元素。在脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的一大类化石燃料中的含硫化合物时，专一性的攻击碳硫键，对碳碳键不起作用，保留的化合物的碳架结构。

本发明提供的红串红球菌是从自然界分离筛选获得的；该菌株不论是生长细胞还是休止细胞，不论是游离细胞还是固定化细胞，不论是完整的菌株细胞还是破碎的菌体片段，不论是细胞粗液还是分离纯化的酶组分均能够表现出专一的有效脱除含硫化合物，特别是石油及其产品中的硫，如可应用于加氢精制汽油、加氢精制柴油的深度脱硫过程。

附图说明

附图1为菌株代谢二苯并噻吩(DBT)的“4S”专一性途径；

附图2为菌株代谢苯并噻吩(BT)的硫专一途径：

附图3为红串红球菌Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ培养液的色谱图；

附图4产物2-羟基联苯(2-HBP)质谱图(图下部分为2-HBP的标准质谱图)

附图5底物二苯并噻吩(DBT)质谱图(图下部分为DBT的标准质谱图)

附图6产物二苯并噻吩砜(DBTO₂)质谱图(图下部分为DBTO₂的标准质谱图)

附图7二苯并噻吩降解气相色谱检测结果

附图8 4-甲基二苯并噻吩降解气相色谱检测结果

附图9 4，6-二甲基二苯并噻吩降解气相色谱检测结果

附图10 苯并噻吩降解气相色谱检测结果

附图11 5-甲基苯并噻吩降解气相色谱检测结果

附图12 不同Na₂SO₄浓度对红球菌SDUZAWQ脱硫活力的影响

具体实施方式

实施例1：Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的筛选

菌株筛选从炼油厂污水排放口等地取得土样、水样，用基本无机盐培养基(培养基组成：1升蒸馏水中含：2.44g的KH₂PO₄，5.57g的Na₂HPO₄，2g的NH₄Cl，0.2g的MgCl₂，2g的甘油，1mL的微量元素混合液。其中微量元素混合液组成为：1升蒸馏水中含：1g的CuCl₂·2H₂O，4g的CoCl₂·6H₂O，2g的ZnCl₂，40g的CaCl₂，0.5g的H₃BO₃，2g的NaMoO₄·2H₂O，40g的FeCl₃·7H₂O，1g的AlCl₃·6H₂O，8g的MnCl₂·4H₂O)浸泡过夜，于30℃，200rpm振荡培养48h。培养液离心去除土样后离心得菌体，0.85％生理盐水洗涤菌体两次，悬浮于pH7.0磷酸钾缓冲液中。将此菌液1mL加入到含有0.5mM的DBT的上述基本无机盐培养基试管中30℃培养48h，转入新鲜的含有0.5mM的DBT的基本无机盐培养基中继续培养2d以上用基本无机盐培养基管作对照，有明显生长的，将此管的培养液稀释培养挑出单菌落，扩大培养，得到能降解DBT的菌株。取培养液，使用10％HCl调节pH≤2后，加入等体积乙酸乙酯萃取，30℃震荡30min，离心取萃取液经N₂吹干浓缩大约100倍后用于气相色谱一质谱检测。SDUZAWQ菌株培养液经萃取用GC/MS分析，色谱图有三个明显的色谱峰(如图3)，分别从图左到右命名为A，B和C峰。三个峰的质谱图如图4～6所示。色谱图中3.697min峰的质谱图为图4，说明此峰为2-HBP(分子量170)。色谱图中5.35min峰的质谱图为图5，说明此峰为DBT(分子量184)。色谱图中7.05min峰的质谱图为图6，说明此峰为DBTO₂(分子量216)。该菌株定名为Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ，2004年3月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.1129。

实施例2：制备Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的细胞液体培养物：

挑取营养琼脂斜面培养红串红球菌Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株一环接种在装有灭菌50ml的基本无机盐培养基的300ml锥形瓶中，加入已灭菌的DBT-二甲基甲酰胺储液，使DBT浓度为0.5mM，于30℃，180转/分在摇床上培养36-48h。吸取培养获得的菌液5ml接种在装有100ml的基本无机盐培养基的500ml锥形瓶中，再加入已灭菌的DBT-二甲基甲酰胺储液，使DBT浓度为0.1-0.5mM。将该锥形瓶放在摇床中，30℃，180转/分培养48h，制得Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ细胞的液体培养液。

实施例3：制备Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株休止细胞液：

将通过实施例2的方法获得菌株SDUZAWQ的细胞的液体培养液5000转/分，离心10min，倒去上清液。用适量生理盐水洗涤离心3次，将所获得的离心沉淀物悬浮于生理盐水中，然后冷冻保藏于冰箱中，即制得Rhodococcuserythropolis SDUZAWQ菌株的休止细胞。

实施例4：红球菌SDUZAWQ在脱除二苯并噻吩(DBT)中有机硫的应用：

(1)将DBT配成50mM的DBT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；

(2)在300ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基50ml，DBT-二甲基甲酰胺储液0.5ml，使锥形瓶中DBT的浓度为0.2mM；

(3)将实施例2制得的Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的细胞培养液，或将实施例3制得的休止细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于30℃，180转/分培养，隔24h取样测定。其DBT降解的测定结果见图7，结果表明，菌株SDUZAWQ可以较好的脱除DBT中的硫，在48h可以将0.5mM的DBT降解完全。

实施例5：红球菌SDUZAWQ在脱除4-甲基-二苯并噻吩(4MDBT)中有机硫的应用：

将4MDBT配制成50mM的4MDBT-二甲基甲酰胺储液；将实施例4中的硫源DBT换成4MDBT，其他操作步骤和方法同实施例4，其4MDBT的降解结果如图8所示，在48h可以将0.5mM的4MDBT降解掉36％。

实施例6：红球菌SDUZAWQ在脱除4，6-甲基-二苯并噻吩(DMDBT)中有机硫的应用：

将DMDBT配制成50mM的DMDBT-二甲基甲酰胺储液；将实施例4中的硫源DBT换成DMDBT，其他操作步骤和方法同实施例4，其DMDBT的降解结果如图9所示，在48h可以将降解62％的0.5mM的DMDBT。

实施例7：红球菌SDUZAWQ在脱除苯并噻吩(BT)中有机硫的应用：

将BT配制成50mM的BT-二甲基甲酰胺储液；将实施例4中的硫源DBT换成BT，其他操作步骤和方法同实施例4，其BT的降解结果如图10所示，在48h可以将0.5mM的BT降解完全。

实施例8：红球菌SDUZAWQ在脱除5-甲基-苯并噻吩(MBT)中有机硫的应用：

将MBT配制成50mM的MBT-二甲基甲酰胺储液；将实施例4中的硫源DBT换成MBT，其他操作步骤和方法同实施例4，其MBT的降解结果如图11所示，在48h可以降解88％的0.5mM的MBT。

实施例9：无机硫对红球菌SDUZAWQ脱硫活力的影响

(1)将DBT配成50mM的DBT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；

(2)在300ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基50ml，DBT-二甲基甲酰胺储液0.5ml，使锥形瓶中DBT的浓度为0.2mM和不同浓度的Na₂SO₄；

(3)将实施例2制得的Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的细胞培养液，或将实施例3制得的休止细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于30℃，180转/分培养，培养40h后收集，离心，5000转/分，离心10min，用pH7.0磷酸缓冲液离心洗涤2次，并使用pH7.0磷酸缓冲液稀释细胞到1.8g/L，加入0.5mM的DBT，反应体积为5mL，置于30℃水浴恒温振荡器中，180/分转震荡反应1h后，用高压液相，可变波长紫外检测器(VWD)在280nm检测，使用反相色谱填充柱，流动相为80∶20的甲醇和水，流速为0.7mL/min，柱子恒温30℃。测定所产生的2-HBP浓度。以单位时间一定量的菌体降解DBT产生2-HBP的量来衡量红球菌SDUZAWQ脱硫活力。如图12所示，虽然随着无机硫硫酸盐浓度的增大，红球菌SDUZAWQ的脱硫活力下降，但在硫酸盐在较大浓度1.0mM以后，细胞仍具脱硫活力。这个现象表明，硫酸盐的存在虽然会阻遏红球菌SDUZAWQ脱硫酶系活力，但与文献报道不同的是，在较大的无机硫浓度范围内，未完全阻遏酶的产生。Ohshiro等指出培养基中含0.5mmol/L硫酸钠，完全阻遏酶的产生；Rhee等报道当硫酸盐加到培养基中后，DBT即不被降解表明硫酸盐完全阻遏降解DBT酶产生；Omori等和Wang & Krawiec在研究中也发现类似的结果。红球菌SDUZAWQ由于这一对硫酸盐不敏感的特点，较适合于石油生物脱硫的实际应用。

实施例10：混合硫源制备的细胞柴油脱硫

(1)将DBT配成50mM的DBT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；

(2)在500ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基100ml，DBT-二甲基甲酰胺储液0.2ml，50mM Na₂SO₄水溶液0.2ml，使锥形瓶中DBT的浓度为0.1mM的DBT和Na₂SO₄的浓度为0.1mM；

(3)将实施例2制得的Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的细胞培养液，或将实施例3制得的休止细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于30℃，180转/分培养，培养40h后，5000转/分，离心10min收集，用pH 7.020mM的磷酸缓冲液离心洗涤2次，并使用pH 7.0 20mM磷酸缓冲液稀释细胞到8.0g/L，制得混合硫源培养制备的Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的休止细胞；

(4)将步骤3制得的Rhodococcus erythropolis SDUZAWQ菌株的休止细胞45ml放置在500ml的锥形瓶中，加入5ml硫含量为165μg/g的加氢精制处理过的柴油，于30℃，180rpm的摇床中振荡反应，24h，48h取样，10,000转/分离心10min，获得油相，然后用WK-2D型库仑综合分析仪(江苏江分电分析仪器有限公司)测定柴油中的总硫含量，如表3所示，24h与48h后的脱硫率分别达到了68.2％和79.5％。

表3混合硫源制备的细胞用于柴油脱硫结果

取样时间(h) 总硫含量(μg/g) 硫脱除率(％) 0 24 48 165 52.6 33.9 0 68.2 79.5