专利摘要

本发明公开了倍半萜环化酶基因peniA及其重组表达载体和应用，倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQIDNO.3所示，本发明通过在酵母体内异源表达peniA基因，对其催化产物进行了分离及结构鉴定，表明倍半萜环化酶基因peniA可在酵母中合成角三环倍半萜silphinene；同时，还在大肠杆菌中表达peniA基因，获得可溶性的PeniA重组蛋白也具有催化底物FPP反应生成silphinene的活性，因此可用于体内或体外合成silphinene。

权利要求

1.一种倍半萜环化酶基因peniA，其特征在于：所述倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.含有权利要求1所述倍半萜环化酶基因peniA的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上而得。

4.权利要求1所述的倍半萜环化酶基因peniA或权利要求2~3任一项所述的重组表达载体在酵母中合成角三环倍半萜silphinene中的应用。

5.通过在酵母中表达倍半萜环化酶基因peniA合成角三环倍半萜silphinene的方法，其特征在于，包括如下步骤：将peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上，得到重组质粒 pCMU 1，然后将重组质粒 pCMU 1转化酵母，获得含有重组质粒 pCMU 1的菌株，经发酵培养，即获得含有角三环倍半萜silphinene的发酵液；所述倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：发酵培养后还包括分离纯化，具体为：将发酵液离心收集菌体，经收集的菌体用乙酸乙酯提取，上清用正己烷萃取，减压浓缩，获得浸膏；再将浸膏采用凝胶柱分离，洗脱溶剂为正己烷与二氯甲烷体积比为1：1的混合溶液，最终分离得到角三环倍半萜silphinene纯品。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述酵母为酵母BJ 5465-NpgA。

8.根据权利要求 6所述的方法，其特征在于：所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。

9.利用权利要求1所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：将倍半萜环化酶基因peniA通过NdeI和Hind Ⅲ连入表达载体pColdI上，得到重组质粒 pCMU 2，然后将含重组质粒 pCMU 2的大肠杆菌BL 21阳性转化子进行蛋白的诱导表达，纯化获得PeniA重组蛋白。

10.根据权利要求9所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法，其特征在于：所述纯化为离心收集菌体，加入Buffer重悬，冰水浴上超声裂解菌体；离心收集上清，用0.22 μm滤膜过滤，加入到Buffer平衡的镍柱中，先用适量50 mM低浓度咪唑洗脱液除去杂蛋白，再用250 mM浓度咪唑洗脱液洗脱PeniA蛋白，收集流出液，获得PeniA重组蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及倍半萜环化酶基因peniA，还涉及该基因在酵母中异源表达合成silphinene的方法。

背景技术

倍半萜类天然产物生物合成途径中，涉及到的酶催化反应中最关键的酶为倍半萜环化酶，其能够催化线性前体FPP的C-O键的断裂，形成烯丙基碳正离子，进而引发一系列的C-C键生成或重排的环化反应形成不同的倍半萜骨架，包括单环、双螺环、双并环及三环等。目前植物来源的倍半萜环化酶研究报道较多，而真菌来源的则相对较少，但是基于对JGI数据库中所测序的真菌基因组中萜类环化酶的生物信息学分析显示，倍半萜合成酶是最主要的环化酶类型。随着基因组测序技术及生物信息学分析手段的快速发展，为真菌倍半萜环化酶的发现及其功能研究提供了前所未有的机会。因此，急需对真菌倍半萜环化酶合成基因进行研究，对阐明真菌合成倍半萜类化合物机理具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种倍半萜环化酶基因peniA；本发明的目的之二在于提供含有倍半萜环化酶基因peniA的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供所述的倍半萜环化酶基因peniA或所述重组表达载体在酵母中合成角三环倍半萜silphinene中的应用；本发明的目的之四在于提供通过在酵母中表达倍半萜环化酶基因peniA合成角三环倍半萜silphinene的方法；本发明的目的之五在于提供利用所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种倍半萜环化酶基因peniA，所述倍半萜环化酶基因peniA的核酸序列如SEQID NO.3所示。

2、含有所述倍半萜环化酶基因peniA的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体由peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上而得。

3、所述的倍半萜环化酶基因peniA或所述的重组表达载体在酵母中合成角三环倍半萜silphinene中的应用。

4、通过在酵母中表达倍半萜环化酶基因peniA合成角三环倍半萜silphinene的方法，包括如下步骤：将peniA基因通过NdeⅠ和PmlⅠ连接到酵母表达载体pYEU上，得到重组质粒pCMU 1，然后将重组质粒pCMU 1转化酵母，获得含有重组质粒pCMU 1的菌株，经发酵培养，即获得含有角三环倍半萜silphinene的发酵液。

优选的，发酵培养后还包括分离纯化，具体为：将发酵液离心收集菌体，经收集的菌体用乙酸乙酯提取，上清用正己烷萃取，减压浓缩，获得浸膏；再将浸膏采用凝胶柱分离，洗脱溶剂为体积比为1：1的正己烷-二氯甲烷，最终分离得到角三环倍半萜silphinene纯品。

优选的，所述酵母为入酵母BJ 5465-NpgA。

优选的，所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。

优选的，所述乙酸乙酯提取为将菌体用乙酸乙酯反复提取3次。

优选的，所述萃取为使用正己烷萃取三遍。

5、利用所述倍半萜环化酶基因peniA表达PeniA重组蛋白的方法，包括如下步骤：将倍半萜环化酶基因peniA通过Nde I和HindШ连入表达载体pColdI上，得到重组质粒pCMU2，然后将含重组质粒pCMU 2大肠杆菌BL 21的阳性转化子进行蛋白的诱导表达，纯化获得PeniA重组蛋白。

优选的，所述纯化为离心收集菌体，加入Buffer A重悬，冰水浴上超声裂解菌体；离心收集上清，用0.22μm滤膜过滤，加入到Buffer A平衡的镍柱中，先用适量50mM低浓度咪唑洗脱液除去杂蛋白，再用250mM浓度咪唑洗脱液洗脱PeniA蛋白，收集流出液，获得PeniA重组蛋白。

本发明的有益效果在于：本发明公开了倍半萜环化酶基因peniA，通过在酵母体内异源表达peniA基因，对其催化产物进行了分离及结构鉴定。同时，还在大肠杆菌中表达peniA基因，获得可溶性的PeniA重组蛋白进行体外酶活实验，从体内和体外两方面对PeniA的催化功能进行研究。而且peniA基因的发现，对研究真菌倍半萜类天然产物的合成具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pCMU 1重组质粒的构建(a：pCMU 1重组质粒图谱；b：pCMU 1重组质粒酶切验证)。

图2为peniA酵母异源表达产物分析结果(a：GC-MS分析基因peniA酵母异源表达产物；b：化合物A与silphinene标准品的MS碎片比较)。

图3为化合物silphinene结构及核磁数据归属。

图4为pCMU 2重组质粒的构建(a：pCMU 2重组质粒图谱；b：pCMU 2重组质粒酶切验证)。

图5为不同浓度咪唑洗脱PeniA蛋白。

图6为PeniA纯蛋白的SDS-PAGE检测。

图7为PeniA与FPP体外酶活实验。

图8为PeniA与GPP,FPP,GGPP体外酶活实验。

图9为倍半萜环化酶PeniA可能的环化机制推导。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、PeniA基因克隆

以P.griseofulvum NRRL 35584cDNA为模板，PeniA-F和PeniA-R为引物，克隆peniA基因。PeniA-F和PeniA-R引物序列如下：

PeniA-F：(5’-atggaggttatacaaccaac-3’)(SEQ ID NO.1)；

PeniA-R：(5’-ctaggccttcaggtcaatg-3’)(SEQ ID NO.2)。

将扩增产物进行测序，结果显示peniA基因编码区全长1116bp，编码372个氨基酸，具体核酸序列如SEQ ID NO.3所示。采用Computer p I/Mw Tool(http://cn.expasy.org/tools/protparam.htmL)分析PeniA蛋白理化特性，推测该蛋白的分子量(Mw)和理论等电点(pI)分别为43.3kDa和5.06。

实施例2、基因peniA在酵母中异源表达及产物分析

(1)基因peniA在酿酒酵母BJ 5464-NpgA中异源表达重组质粒的构建

以P.griseofulvum NRRL 35584cDNA为模板，pYEU-PeniA-F和pYEU-PeniA-R为引物进行扩增，得到不含内含子的peniA基因。pYEU-PeniA-F和pYEU-PeniA-R引物序列如下：

pYEU-PeniA-F：(5’-ggaattccatatggaggttatacaaccaacaacg-3’)(SEQ ID NO.4)；

pYEU-PeniA-R：(5’-gtgatgcacgtgctaggccttcaggtcaatgagttc-3’)(SEQ IDNO.5)；

采用酶切连接法通过NdeⅠ和PmlⅠ将peniA基因克隆到酵母表达载体pYEU上，得到重组质粒pCMU 1。pCMU 1重组质粒采用KpnⅠ和HindⅢ酶切验证，pCMU 1图谱及其酶切验证结果如图1所示。结果显示，pCMU 1重组质粒构建成功。

(2)基因peniA酵母异源表达菌株发酵检测

将重组质粒pCMU 1导入酵母BJ 5465-NpgA感受态中，在缺U培养基上培养，菌落PCR验证。挑取阳性转化子在缺U液体培养基中，28℃，250rpm培养过夜。然后将种子液按5％接种量转接至25mL YPD液体培养基中，28℃，250rpm发酵培养两天，同时在相同条件下发酵BJ 5465-NpgA野生型作为对照。取适量发酵液，等体积正己烷萃取，减压浓缩干后，进行GC-MS检测。结果显示，与野生型对照相比，peniA基因在酵母中表达后能够检测到一个单一明显的分子量为204的信号峰(图2，a)，且该信号峰的MS数据与数据库中silphinene标准品的MS数据一致(图2，b)。因此，推断倍半萜环化酶PeniA的催化产物(A)可能是角三环倍半萜silphinene。为了确定催化产物的具体结构，对基因peniA酵母异源表达菌株进行大量发酵，积累目标化合物进行分离及结构鉴定。

实施例3、半萜环化酶PeniA的催化产物的分离及结构鉴定

大量发酵异源表达菌株BJ 5465-NpgA::peniA，发酵结束后，离心，菌体用乙酸乙酯反复提取三遍，上清用正己烷萃取三遍，减压浓缩干，共得6.7g粗浸膏。采用SephadexLH-20凝胶柱(长2m，直径2cm)分离，洗脱溶剂为正己烷-二氯甲烷(v/v,1:1)，最终分离得到7mg纯品。用CDCl3溶解样品，进行一维(1H、13C)和二维(HMBC、HSQC)核磁鉴定，核磁数据归属见表1。另外，将半萜环化酶PeniA的催化产物与已报道的silphinene碳谱数据进行比较，证实了倍半萜环化酶PeniA的催化产物是角三环倍半萜silphinene，结构见图3，核磁数据归属如表1所示。

表1.化合物silphinene核磁数据归属

(400MHz for 1H NMR,100MHz for 13C NMR)

实施例4、PeniA蛋白体外酶催化功能验证

(1)基因peniA蛋白表达重组质粒的构建

用引物对pColdI-PeniA-F和pColdI-PeniA-R从P.griseofulvum NRRL 35584cDNA扩增得到peniA基因，采用酶切连接法克隆到蛋白表达载体pColdI上，得到重组质粒pCMU2。其中引物对pColdI-PeniA-F和pColdI-PeniA-R序列具体如下：

pColdI-PeniA-F：(5’-ggaattccatatggaggttatacaaccaacaacg-3’)(SEQ IDNO.6)；

pColdI-PeniA-R：(5’-gttacccaagcttctaggccttcaggtcaatgagttc-3’)(SEQ IDNO.7)。

将获得的pCMU 2重组质粒图谱及其酶切验证结果见图4，结果显示，pCMU 2重组质粒构建成功。

(2)PeniA蛋白表达、纯化及浓度测定

诱导表达：将重组质粒pCMU 2导入大肠杆菌BL 21中，挑取阳性转化子于3mL LB液体培养基(含Amp抗性)，37℃，220rpm培养过夜。按1％比例转接至适量LB液体培养基进行扩大培养，37℃，220rpm培养约1.5h至OD600＝0.4-0.6，16℃静置30min。加入IPTG溶液(终浓度0.2mM)诱导蛋白表达，16℃，220rpm，培养20h。

重组蛋白可溶性检测及纯化：离心收集菌体，加入适量Buffer A重悬菌体，冰水浴上超声波裂解菌体，3mm变幅杆，30％功率，超3s，停7s，合计30min。4℃，12000rpm，离心30min。取上清和沉淀样进行10％SDS-PAGE电泳检测，结果发现，PeniA蛋白表达量很高，且大部分呈可溶性表达。然后用不同浓度咪唑洗脱液摸索PeniA蛋白最佳洗脱浓度；具体如下：取上清蛋白，0.22μm滤膜过滤，加入到Buffer A平衡的镍柱中，依次用20mM、50mM、100mM、250mM、500mM浓度咪唑洗脱液洗脱，分别收集流出液，用10％SDS-PAGE电泳检测。结果显示，当咪唑浓度为250mM时洗脱效果最好，PeniA蛋白纯度高，且蛋白量也最大，见图5。大量(200mL)诱导PeniA蛋白表达并进行纯化：取上清蛋白，0.22μm滤膜过滤，加入到BufferA平衡的镍柱中，自然流速回收流出液，再次上样，重复三次。先用适量50mM咪唑洗脱液除去非特异性结合杂蛋白，再用250mM浓度咪唑洗脱液洗脱PeniA蛋白，收集流出液。

蛋白脱盐及浓缩：采用Amicon Ultra-15mL(Millipore)超滤管浓缩蛋白，使用前加入适量Buffer A，4℃，3750rpm，离心以平衡超滤管，弃流出液。加入蛋白液，4℃，3750rpm，离心浓缩至2.5mL。将2.5mL蛋白液全部转至已用Buffer A平衡好的PD-10脱盐柱(GE)，自然流速，待蛋白液全部进入柱子后，加入3.5mL Buffer C洗脱蛋白，从加样开始计，收集1.0～3.5mL流出液，即为脱盐蛋白。最后用Buffer C平衡的超滤管继续浓缩，4℃，3750rpm，离心浓缩至少于250μL，50μL/管分装，液氮速冻，-80℃保存，同时用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图6所示，结果显示，PeniA蛋白目的条清晰且没有杂带。

蛋白浓度测定：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)进行蛋白浓度测定，结果PeniA蛋白浓度为0.5mM。

(3)PeniA蛋白体外酶活测定

体外酶活反应体系为50μL，样品组与对照组反应体系中各成分及其用量见表2，28℃水浴锅中孵育4h。然后加入60μL正己烷萃取，离心，取正己烷相，用无水硫酸钠干燥处理，进行GC-MS检测。结果显示，PeniA蛋白与底物FPP反应能够检测到silphinene的产生(图7)，进而从体外证明了PeniA为silphinene合成酶。

表2、PeniA蛋白体外酶活测定体系

成分PeniA蛋白底物FPP2]]>Tris-HCl buffer(pH 7.5)Control/50μM10mM补足至50μLPeniA+FPP5μM50μM10mM补足至50μL

实施例5、PeniA蛋白的底物宽泛性研究

倍半萜环化酶PeniA可以识别15个碳链长的FPP，催化其环化得到倍半萜化合物silphinene。为了考察其对不同碳链长异戊烯基(如GPP与GGPP)的识别作用，通过体外酶活实验，以FPP为阳性对照，将PeniA蛋白分别与底物GPP及GGPP进行反应。利用GC-MS检测发现，PeniA与GPP或GGPP反应均没有检测到对应的环化产物(图8)，说明PeniA对FPP具有严格的底物选择性，并不能识别其他碳链长的底物。

本发明通过酵母异源表达及蛋白体外酶活实验证实了PeniA为silphinene合成酶，由此推导了PeniA催化线性FPP到角三环倍半萜silphinene的整个环化机理：倍半萜环化酶PeniA识别并结合底物FPP，催化FPP去磷酸化形成法呢基碳正离子，其经过C1-C11及C2-C10成环形成β-石竹烯碳正离子。然后引发碳正离子重排得到三环结构中间体，再经1,3-氢转移，最后经过一步Wagner-Meerwein重排缩环后去质子化得到三环倍半萜silphinene(图9)。

由于真菌可以产生不同碳骨架类型的倍半萜类天然产物，包括线性、双环及三环等，其中三环骨架倍半萜又包括线性三环、角三环及桥三环。通过结构导向的萜类环化酶系统进化树分析，发现PeniA类聚到催化产物为角三环倍半萜的萜类合酶分支中，如presilphiperfolan-8β-ol、pentalenene。本发明中，为了阐明PeniA的催化功能，在酵母宿主中异源表达peniA基因，对其催化产物进行了分离与核磁鉴定，证实催化产物为三环倍半萜silphinene，因此peniA为之前并未报道过的silphinene倍半萜环化酶基因。同时还通过在大肠杆菌中异源表达peniA基因，获得了可溶性的PeniA重组蛋白，体外酶活实验证实了PeniA能够催化FPP环化得到化合物silphinene，且PeniA对FPP具有严格的底物选择性，并不能识别其他碳链长的底物，包括GPP及GGPP，故从体内和体外两方面证明PeniA的催化功能。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>重庆医科大学

<120>倍半萜环化酶基因peniA及其在酵母中异源表达合成silphinene的方法

<160>7

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggaggtta tacaaccaac20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

ctaggccttc aggtcaatg 19

<210>3

<211>1119

<212>DNA

<213>灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)

<400>3

atggaggtta tacaaccaac aacgcagatc ttcgcagaca atgagaagac ggtttcccaa60

gttgccgagg agatttctag caatgaactg cgggaaacca cagtctatct cccagacttg 120

ttcgtctctt tttgcagccg agctcccaag accaatccgt actatgccga agtcaaagca 180

gagtctgatg cctggtttgc gaagttatac tccctgagca cggaaaaaga acttagcagg 240

ctcaccaagg cagacttcgc tctattcgcc gcatggtgga cagccgatgc tggaaagtct 300

gaattccgca ccatttgcga ttggtgtaac tgggttttct acttcgatga ccaatttgat 360

gagggccatc tgtgcgagga tgaggcgaag gcgcagagag aggccgatat tcttacccaa 420

atcatgactg tcggtcttag ggacgatgag tatcctgacg acttgccacg agcgagagcc 480

cttcgttatg ctttccgctc agtgtgggaa cgtatctctc agcgtgcctc tgctggtgtc 540

caaagacggt tcagagaagc gatgcaagaa ttctgcaaag gccttgtcgg gcaagttgga 600

gtccgagcgg atattgacac cagagaactc gatccgtatc tcgcatttcg ccgccaatcg 660

atcggggttg tcccttgcat agtatttgct gagtactacc acgatctgcg tctccccgac 720

gaattcttcg agcatccctc ggtgaagact atcatggatc ttgccgctga gatcacagtg 780

ctccacaacg atgtgctctc ctaccataag gaatacgaaa tgggagccat ccataacatc 840

gtgattattc tccgggagcg tggcatgacg cagcaagaag cgtataacga gaccgataag 900

ctaattcaaa agcgccttcg ggaatggcac cttgcggtga accagctccc tttctacggc 960

gaggcgcttg atctccaggt tcagaagttc gttcaggcct gccaggaggt tgctgtaggc 1020

aatttgcact ggagctttgc caccgaacgg tactttggaa accaaaacaa cctcatcaga 1080

aagacccgac aggttgaact cattgacctg aaggcctag1119

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

ggaattccat atggaggtta tacaaccaac aacg34

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

gtgatgcacg tgctaggcct tcaggtcaat gagttc36

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

ggaattccat atggaggtta tacaaccaac aacg34

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

gttacccaag cttctaggcc ttcaggtcaa tgagttc 37

倍半萜环化酶基因peniA及其在酵母中异源表达合成silphinene的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。