专利摘要

一种将聚合度为2～8的低聚木糖中的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖制备分离的方法，其特征在于先用截留分子量为5000的超滤膜将低聚木糖和未降解的高聚物分离，再将超滤得到的低聚木糖混合物用聚丙烯酰胺凝胶为层析介质在层析分离柱上进行多次制备分离。采用本方法，可以将低聚木糖各组分进行有效的制备分离，纯度达到90％以上，可以为低聚木糖的生物活性研究和产品质量检测提供系列的单组分低聚木糖标准样品。

权利要求

1.一种将聚合度为2～8的低聚木糖混合物中的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖制备分离的方法，其特征在于：

a.用截留分子量为5000的超滤膜，将低聚木糖和未降解的高聚物分离，获得纯度较高的聚合度为2～8的低聚木糖混合物；

b.将超滤得到的聚合度为2～8的低聚木糖混合物，用聚丙烯酰胺凝胶为层析介质在层析分离柱上进行多次制备分离。

说明书

一、技术领域

本发明属于生物化学中采用物理方法制备分离低聚木糖的技术领域。

二、背景技术

低聚木糖是指主要由2～8个木糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。与其它功能性低聚糖相比，低聚木糖具有不被人和动物消化酶系统所分解、对肠道双歧杆菌有高选择性增殖效果、极高的酸稳定性和热稳定性、与食物或饲料的配伍性好等优良特性。低聚木糖可作为促进肠道双歧杆菌增殖的因子，广泛用作人体保健食品添加剂和动物饲料添加剂等。

将富含木聚糖的植物纤维原料(如玉米芯、甘蔗渣、桦木、杨木等)提取获得木聚糖后，用生物或化学的方法进行催化降解，可将木聚糖降解制得低聚木糖。CNZL 02112568.6《一种植物纤维原料酶降解制备低聚木糖的方法》提供了一种将木聚糖经酶降解制备功能性食品添加剂低聚木糖的方法，其特征是以植物纤维原料提取的木聚糖为原料，以里氏木霉木聚糖酶进行降解得到聚合度为2～5的低聚木糖产品；CN 200410065146.0《木聚糖高温降解制备低聚木糖的方法》提供了一种用高温降解工艺制备聚合度为2～10的低聚木糖的方法。也有选用其它细菌、放线菌、真菌和酵母菌等制备木聚糖酶之后，将木聚糖经酶降解制备低聚木糖的技术报道。

但是，迄今为止的技术报道，制备的都是低聚木糖各组分的混合物。美国某公司虽有木二糖产品出售，但价格昂贵，且制备、分离工艺并不对外公开。其他单组分低聚木糖目前尚无商品出售，也未见制备、分离低聚木糖各组分的系统技术报道。

低聚木糖各组分的制备是其生物活性研究的关键。低聚木糖的生物活性虽然已被证实，但对其各组分生物活性的研究在国内外尚属空白，这使得人们单纯以低聚木糖总含量作为产品质量的衡量指标并不全面。因此，制备分离出低聚木糖的各组分，研究各组分增殖双歧杆菌能力的相对大小，探讨双歧杆菌代谢低聚木糖各组分的规律和机理，对于高活性低聚木糖产品的研究与开发，制定适当的低聚木糖产品衡量指标，均具有重要的指导作用和科学意义。

低聚木糖各组分的制备也是低聚木糖产品检测的需要。由于国内外市场上没有木二糖以外的标准品出售，无法对低聚木糖产品中的各组分进行定性和定量检测，使得低聚木糖的含量无法准确计算，也无法科学制定该类产品的质量控制标准。

三、发明内容

本发明的目的是寻找一种低聚木糖各组分的高效制备分离方法，为低聚木糖的生物活性研究和产品质量检测提供单组分低聚木糖标准样品，即从聚合度为2～8的低聚木糖混合物中分别获得木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖等。

本发明的技术解决方案为：采用超滤和多次凝胶层析法，将多组分低聚木糖混合物中的木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖分离，从而制得聚合度分别为2～8的低聚木糖单组分产品。其特征在于：

a.用截留分子量为5000的超滤膜，将低聚木糖和未降解的高聚物分离，获得纯度较高的聚合度为2～8的低聚木糖混合物；

b.将超滤得到的聚合度为2～8的低聚木糖混合物，用聚丙烯酰胺凝胶为层析介质在层析分离柱上进行多次分离。

即可获得木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖的低聚木糖单组分产品。

用聚丙烯酰胺凝胶在层析分离柱上进行分离的次数，一般依产品的纯净度要求而定，当产品的纯净度要求低于90％时，层析分离1～2次即可。

详细制备分离过程、制备分离材料和制备分离参数，参见实施例。

四、附图说明

图1为低聚木糖层析洗脱图谱。层析介质为聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P-4)，脱气超纯水洗脱，洗脱速度0.05ml/min，示差折光检测器在线检测。峰1是木糖(单糖)，峰2～8分别是聚合度为2～8的低聚木糖。

图2为聚合度2～8的低聚木糖各组分分别进行两次制备分离后的洗脱图谱。层析介质为聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P-2)。A～G分别为聚合度为2～8的低聚木糖各组分。

图3为木六糖的高效液相色谱和电喷雾电离质谱分析图谱。其中，A是木六糖的层析两次制备分离图谱，B是木六糖的高效液相色谱分析图谱，C是木六糖的电喷雾电离质谱图谱。

木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木七糖和木八糖的高效液相色谱和电喷雾电离质谱分析图谱与图3类似，故未予罗列。

五、具体实施方式

多组分低聚木糖混合物的制取：

低聚木糖的制取方法可参见CNZL 02112568.6《一种植物纤维原料酶降解制备低聚木糖的方法》，采用该法获得的多组分低聚木糖混合物中，主要成分为聚合度为2～5的低聚木糖，木六糖、木七糖和木八糖的成分较少。

当采用CN 200410065146.0《木聚糖高温降解制备低聚木糖的方法》时，可以获得聚合度为2～10的多组分低聚木糖混合物。

还可以用其它细菌、放线菌、真菌和酵母菌等制备木聚糖酶之后，将木聚糖经酶降解制备获得多组分低聚木糖混合物。

不论采用何种制取方法获得的多组分低聚木糖混合物，均可使用以下典型实施例中的方法进行制备分离。

实施例一：

制备分离工艺主要由超滤和凝胶层析两个过程构成：

a.超滤——多组分低聚木糖混合物中往往含有少量的高聚合度组分，因此必须将得到的低聚木糖溶液用超滤方法，将聚合度为8以下的低聚木糖与其他高聚合度组分分离。超滤设备用美国Millipore公司生产的Pellicon切向流超滤装置，超滤膜的过滤面积为0.5m²，截留分子量为5000。超滤过程中，截留液返回到母液瓶中循环使用，透过液收集到容器中。间歇添加蒸馏水到母液瓶中，以保证超滤正常进行。当添加的蒸馏水体积为母液的4～5倍时，母液中90％以上的聚合度为8以下的低聚木糖被收集到透过液中。

b.凝胶层析——超滤得到的低聚木糖溶液经浓缩后，采用快速液相层析系统(KTA FPLC系统，瑞典Pharmacia Biotech公司)分离。层析柱为XK 50/60(直径50mm，长度60cm)，层析介质为聚丙烯酰胺凝胶(美国Bio-Rad公司，Bio-Gel P-4)，柱温48℃，脱气超纯水洗脱，洗脱速度0.05ml/min，进样量2.0ml，RID-10A型示差折光检测器和280nm紫外线同时在线检测。洗脱图谱如附图1所示。高效液相色谱分析表明，峰1是木糖(单糖)，峰2～8分别是聚合度为2～8的低聚木糖。

收集到的峰2到峰8各组分溶液，即为木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖的低聚木糖单组分溶液，但其纯度较低(纯度一般低于85％)。

实施例二：

制备分离工艺仍由超滤和凝胶层析两个主要过程构成，但为了提高成品的纯度，可以进行两次凝胶层析：

a.超滤——同实施例1。

b.凝胶层析1——同实施例1。

c.凝胶层析2——将凝胶层析1中收集到的峰2到峰8各组分溶液，经浓缩后分别进行两次凝胶层析，以得到纯度更高的低聚木糖各组分。制备分离条件同凝胶层析1，但层析柱为XK16/100(直径16mm，长度100cm)，层析介质为Bio-Gel P-2。制备分离得到的各组分层析图谱见附图2。

将两次凝胶层析制备分离得到的低聚木糖各组分作高效液相色谱(HPLC)分析，色谱仪的操作条件如下：

糖柱：Bio-Rad Aminex HPX-42A(300×7.8mm)

保护柱：Micro-Guard Carbo-P和Micro-Guard Deashing Cartridges

柱温：85℃

流动相：高纯水，超声波脱气；流速：0.6ml/min

检测器：差示折光检测器(RI)

对两次凝胶层析制备分离得到的低聚木糖各组分作电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。操作条件如下：

电喷雾电离质谱仪：美国Finnigan公司，LCQ^TM型

电喷雾电压：4.55KV

毛细管温度：200℃

进样速度：200μL/min

流动相：甲醇

数据采集方式：为Full Scan，m/z＝200～2000，正负离子同时收集。

高效液相色谱和电喷雾电离质谱检测结果表明，经两次凝胶层析得到的各组分分别为聚合度为2～8低聚木糖，即木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、木七糖和木八糖，纯度均为90％以上。附图3给出了木六糖的检测图谱。其中，A是木六糖的两次凝胶层析制备分离图谱；B是木六糖的高效液相色谱分析图谱，表明该组分纯度高；C是木六糖的电喷雾电离质谱图谱，该组分主要有833、1238、1643三个峰，分别是[X₆+Na]⁺离子、[3X₆+2Na]²⁺离子和[2X₆+Na]⁺离子(木六糖分子量为810，Na原子量为23)。

因此，采用本发明提供的方法，可以将低聚木糖各组分进行有效的制备分离，可以为低聚木糖的生物活性研究和产品质量检测提供系列的单组分低聚木糖标准样品。

一种聚合度为2～8的低聚木糖各组分的制备分离方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。