专利摘要

本发明提供了一种低分子量卡拉胶寡糖，其糖骨架由1,3-β-D半乳糖和1,4-α-D半乳糖交替连接而成，重均分子量为1-3kD，结构式表述为G4S-[A-G4S]n-，其中，n=1-7，硫酸根含量为8-12%。本发明的卡拉胶寡糖不仅可在体外抵抗甲型H1N1亚型流感病毒的感染；还能显著减轻病毒感染引起的小鼠肺部炎症，降低死亡率，延长生存时间；本发明的卡拉胶寡糖来源于海洋红藻，具有来源广泛，低毒高效等诸多优点，能很好地抑制甲型流感病毒的体内外感染，在甲型流感病毒的防治方面具有广阔的市场应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于海洋药物领域，尤其涉及一种低分子量卡拉胶寡糖及其制备方法和应用。

背景技术

甲型流感病毒(Influenza A Virus，IAV)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是具有包膜的负链RNA病毒；根据其表面的血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)的结构及基因特性的不同可分为若干亚型，如H1N1，H5N1等。甲型流感病毒(IAV)在上个世纪至少引起三次大规模的流感爆发，其中最严重的是1918-1919年间爆发的西班牙流感造成了超过4000万人死亡(Lamb et al.，Nat.Med.，2001，7：1286-1288)。自09年4月份以来，发源于墨西哥的H1N1亚型的甲型流感病毒造成了世界范围的流感爆发，给人类的健康带来了巨大威胁。据世界卫生组织统计，全球每年约有6亿人感染流感，约30万人死于流感，直接经济损失超过100亿美元。

目前治疗甲型流感病毒的药物主要是两大类，分别是以离子通道蛋白(M2)为靶点的金刚烷胺和金刚乙胺以及以神经氨酸酶(NA)蛋白为靶点的扎那米韦(zanamivir)和奥司他韦(oseltamivir)(Krug et al.，Trends Pharmacol.Sci.，2009，30：269-277；Kim et al.，J.Am.Chem.Soc.，1997，119：681-690)。但是由于流感病毒是分节段的RNA病毒，容易发生变异，所以很容易对现有药物产生耐药性；目前已经有研究指出在全球范围内特别是欧洲出现了对金刚烷胺甚至奥司他韦产生耐药性的IAV毒株(Moscona，N.Engl.J.Med.，2009，360：953-956)。另外，现有的抗流感病毒药物大多具有不同程度的毒副作用，尤其是离子通道阻断剂具有神经毒性等副作用(Hayden et al.，J.Infect.Dis.，2006，194(Suppl.2)：S119-S126)。因此，研发针对新作用靶点的低毒有效的抗IAV药物十分迫切。

卡拉胶(Carrageenan)是从海洋红藻中提取的一种硫酸半乳聚糖，是由1，3-β-D半乳糖和1，4-α-D半乳糖交替连接形成的骨架结构。卡拉胶及其降解产物具有免疫调节，抗病毒，抗肿瘤等多种生物活性；特别是其抗病毒活性已引起药物学家的高度重视。目前国内外学者已经报道了一些关于卡拉胶多糖及其衍生物在抗流感病毒方面的应用(CN100435805C，WO2009027057)。但是还没有关于卡拉胶寡糖应用在抗甲型H1N1亚型流感病毒方面的报道。

发明内容

针对现有技术中甲型流感病毒容易对现有药物产生耐药性和现有的抗流感病毒药物大多具有不同程度的毒副作用的缺陷，本发明的目的是提供一种低分子量卡拉胶寡糖及其制备方法和在抗甲型H1N1亚型流感病毒感染和增殖中的应用。所述卡拉胶寡糖是来源于海洋红藻的新型低分子量寡糖，它在体外可以显著抑制甲型H1N1亚型流感病毒的增殖，具有很好的抗流感病毒作用；而且它在一定浓度下，没有任何细胞毒性；还具有来源广泛，成本低廉，安全性高等诸多优点，并且在体内外水平上都具有较好的抗甲型H1N1流感病毒感染和增殖的活性，为该类药物的开发提供了新的途径。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种低分子量卡拉胶寡糖，它的糖链骨架结构为1，3-β-D半乳糖和1，4-α-D半乳糖交替连接而成，其糖链结构为G4S-[A-G4S]n-，n＝1-7，重均分子量为1-3kD。

对技术方案的进一步改进：所述卡拉胶寡糖的硫酸根含量为8-12％。

本发明还提供了所述的低分子量卡拉胶寡糖的制备方法，在反应容器中将精制κ-卡拉胶加入水中置于80℃水浴下溶解得均匀溶液，再将反应容器转移至60℃恒温水浴中，在搅拌的情况下加入0.4mol/L硫酸溶液，使κ-卡拉胶终浓度为5～10mg/ml，硫酸终浓度为0.1mol/L，在60℃下水浴搅拌反应3～4h；反应结束后用BaCO₃中和反应液，精密测定pH6～7，再逐滴加入NaOH溶液，调节pH7～8，将溶液浓缩、冷冻干燥得到κ-卡拉胶寡糖。

本发明还提供了所述的低分子量卡拉胶寡糖在制备用于抗甲型H1N1亚型的流感病毒药物中的应用。

对技术方案的进一步改进：所述卡拉胶寡糖在浓度为50uM以上可显著抑制甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞中的感染和增殖。

对技术方案的进一步改进：所述卡拉胶寡糖在40mg/kg/day的剂量下作用可显著减轻IAV感染引起的小鼠肺部炎症。

对技术方案的进一步改进：肺指数抑制率达到47.0％，对于小鼠的死亡保护率达到60％。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明提供的卡拉胶寡糖KCO由于其分子量小，溶解性和稳定性都比卡拉胶多糖有了很大提高；并且此寡糖在体内外实验中可以显著抑制甲型H1N1亚型流感病毒的增殖，都呈现出很好的抗甲型H1N1流感病毒的活性。

本发明证实新型卡拉胶寡糖KCO可以很好地抑制H1N1亚型的甲型流感病毒对于MDCK细胞的感染和增殖过程；不仅可以显著缓解甲型流感病毒感染引起的小鼠肺部炎症，减轻流感引起的小鼠体重下降症状；而且还能显著减少IAV感染引起的小鼠死亡，降低死亡率，延长生存时间。本发明产品来源于海洋天然产物，具有资源丰富易于产业化，低毒高效等诸多优点，能很好地抑制甲型H1N1流感病毒的感染和增殖，在甲型流感病毒的防治方面具有广阔的市场应用前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1表明本发明中卡拉胶寡糖KCO对于感染甲型流感病毒小鼠的死亡保护作用，图1中，模型组为不加药的病毒对照组，利巴韦林为阳性对照组，寡糖KCO为卡拉胶寡糖组，给药剂量为40mg/kg/day，模型组给予同样体积的生理盐水。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明采用酸降解法从红藻多糖卡拉胶中分离获得低分子量的新型κ-卡拉胶寡糖KCO，并试验其在制备抗甲型H1N1亚型流感病毒药物中的应用。

实施例1：新型卡拉胶寡糖的制备

将0.5～1g精制κ-卡拉胶加入75ml水中，置于80℃水浴下溶解得均匀溶液。再将反应容器转移至60℃恒温水浴中，待体系温度稳定后，在搅拌的情况下加入25ml的0.4mol/L硫酸溶液，使κ-卡拉胶终浓度为5～10mg/ml，硫酸终浓度为0.1mol/L，在此温度下水浴搅拌反应3～4h；反应结束后用BaCO₃中和反应液，精密测定pH 6～7，再逐滴加入0.4mol/LNaOH溶液，调节pH7～8，将溶液浓缩至5ml，冷冻干燥得到κ-卡拉胶寡糖(KCO)。

制得的所述κ-卡拉胶寡糖(KCO)为一种低分子量卡拉胶寡糖，它的糖链骨架结构是由1，3-β-D半乳糖(4-硫酸半乳糖，G4S)和1，4-α-D半乳糖(3，6-内醚半乳糖，A)交替连接而成，重均分子量约为1-3kD，其糖链结构可表述为G4S-[A-G4S]n-，其中，n＝1-7，硫酸根含量为8-12％。

实施例2：卡拉胶寡糖抗甲型H1N1亚型流感病毒的活性评价

将得到的所述卡拉胶寡糖按照本领域通用的测试对流感病毒作用的方法，评价它对甲型H1N1亚型的流感病毒的体内外感染和增殖的影响，具体实验和结果如下。

1、卡拉胶寡糖KCO体外抗甲型H1N1流感病毒复制作用

利用甲型流感病毒小鼠适应株H1N1(A/PR/8/34，中科院武汉病毒所提供)感染狗肾上皮细胞(MDCK)建立细胞模型，并利用此细胞模型结合CPE抑制试验、病毒滴度测定实验(TCID₅₀法)和MTT法分别检测卡拉胶寡糖KCO对于IAV的抑制活性以及细胞毒性的大小，并且计算半数抑制浓度IC₅₀和半数细胞毒性浓度CC₅₀，阳性对照药物选择利巴韦林。

实验结果如表1所示，卡拉胶寡糖KCO对于IAV的抑制活性非常显著(IC₅₀＝12.8μM)，且细胞毒性较小(CC₅₀＝342.8μM)，治疗指数SI(CC₅₀/IC₅₀)达到26.8。与广谱的抗病毒药物利巴韦林相比，卡拉胶寡糖KCO起效的药物浓度更低，IC₅₀值远小于利巴韦林(IC₅₀＝112.3μM)，且两者的治疗指数相近(SI＞25.0)。说明卡拉胶寡糖具有较好的体外抑制甲型流感病毒感染和增殖的作用。

表1卡拉胶寡糖KCO体外抗甲型H1N1流感病毒结果

2、卡拉胶寡糖KCO在体内抗甲型H1N1流感病毒复制作用

A：KCO对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺病变与体重的影响

利用鼠肺适应株H1N1(A/PR/8/34)病毒液滴鼻感染SPF级的昆明小鼠建立动物模型，并以此检验卡拉胶寡糖KCO在体内抗IAV感染的效果：将14-16g的SPF级的雌性昆明小鼠40只按体重分为病毒对照组，正常对照组，阳性药利巴韦林组和卡拉胶寡糖组，每组10只。除正常对照组外，其它各组均在乙醚轻度麻醉下以10LD₅₀的IAV病毒液滴鼻感染，每鼠40μL。利巴韦林组和寡糖药物组从病毒感染前1天开始腹腔注射给药，连续给药7天后断食8h，称重后解剖并测定小鼠的肺指数(肺指数＝(肺重/体重)×100)和肺指数抑制率(肺指数抑制率＝(病毒组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒组平均肺指数×100％)。

具体结果见表2。结果表明在每天每千克体重给药40mg的情况下，卡拉胶寡糖处理的小鼠肺指数明显降低，仅有0.97±0.34，显著低于病毒组的1.83±0.39(P＜0.01)；其肺指数抑制率高达47.0％，甚至优于阳性药组(39.9％)。此外，卡拉胶寡糖处理还可以显著改善病毒感染引起的小鼠体重降低症状(P＜0.01)。这些结果说明卡拉胶寡糖可以显著减轻IAV感染引起的小鼠肺部炎症，从而对小鼠起到保护作用。

表2卡拉胶寡糖KCO对于甲型流感病毒致小鼠肺炎的抑制效果

##P＜0.01，与正常对照组相比；^*P＜0.05，^**P＜0.01，与模型组(病毒对照组)相比；(n＝10；X±SD)。

B：KCO对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的生存率与平均生存时间的影响

同样利用小鼠动物模型检验卡拉胶寡糖KCO对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的生存率与平均生存时间的影响。在病毒感染14天后，统计各组小鼠的死亡情况，并计算药物对于小鼠的死亡保护率(死亡保护率＝病毒组死亡率-实验组死亡率)。

具体结果见表3和图1。实验结果表明在每天每千克体重给药40mg的情况下，卡拉胶寡糖KCO处理的小鼠死亡率与病毒对照组相比显著降低(P＜0.01)，死亡保护率达到60％，甚至优于阳性药组(50％)。此外，卡拉胶寡糖还可显著延长小鼠的平均生存时间(P＜0.01)。这些结果说明卡拉胶寡糖KCO可以显著减轻IAV感染引起的小鼠死亡，延长生存时间。

表3卡拉胶寡糖KCO对于感染甲型流感病毒小鼠的死亡保护作用

超过14天仍不死亡者以14天计，2天内死亡者不计。^*P＜0.05，^**P＜0.01，与模型组相比。

综上，本发明实验结果表明卡拉胶寡糖KCO在一定浓度下，没有任何细胞毒性；卡拉胶寡糖KCO在体外可以显著抑制甲型H1N1亚型流感病毒的增殖，具有很好的抗流感病毒作用；在小鼠攻毒保护实验中通过存活率、平均存活时间、鼠肺病变、肺指数抑制率、平均体重等多个参数评定显示卡拉胶寡糖KCO具有较好的抗甲型流感病毒活性。

本发明的产品来源于海藻，具有来源广泛，成本低廉，安全性高等诸多优点，并且在体内外水平上都具有较好的抗甲型H1N1流感病毒感染和增殖的活性，为该类药物的开发提供了新的途径。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

一种低分子量卡拉胶寡糖及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。