专利摘要

本发明公开了新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖及其制备方法与应用，包括由四个岩藻糖残基依次连接而成的链，岩藻糖残基由1→3和1→4交替发生化合，硫酸基分布在第二糖残基的C2和C3上，以及第三糖残基的C2上。本发明中提供的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖中的岩藻糖残基(固定结构)的数量为4个或6个，扩大了具有固定结构的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的数量，进而扩大了岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的使用范围，为预防或者治疗特应性皮炎和湿疹、胃肠道感染的药物提供了更多的组分来源。

权利要求

1.一种新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，其特征在于：包括由四个岩藻糖残基依次连接而成的链，岩藻糖残基由1→3和1→4交替发生化合，硫酸基分布在第二岩藻糖残基的C₂和C₃上，以及第三岩藻糖残基的C₂上。

2.根据权利要求1所述的新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，其特征在于：还包括侧链，侧链由两种非硫酸化的岩藻糖残基通过1→2糖苷键连接而成，侧链通过1→4糖苷键连接在第三岩藻糖残基上。

3.根据权利要求1或2所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，其特征在于：选自以下两种：

4.权利要求3所述新型岩藻聚糖硫酸低聚糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

将重组岩藻多糖酶FFA1和铜藻岩藻多糖溶液在Tris-HCl缓冲液中混合，得到混合液，保温反应、加热灭酶、分离，得到分子式I和II的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：其中所述分离步骤包括用沉淀剂沉淀大分子水解产物的步骤，所述沉淀剂为75％的乙醇水溶液或75％的丙酮水溶液。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述分离步骤还包括将沉淀大分子水解产物得到的沉淀物离心提取的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述分离步骤包括将提取沉淀物后的上层清液倒入阴离子交换吸附柱中，进行梯度洗脱的步骤。

8.权利要求1-3任一所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可药用盐在作为岩藻多糖酶、岩藻糖苷酶和硫酸酯酶的基质中的应用。

9.权利要求1-3任一所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可药用盐在制备用于预防或治疗特应性皮炎和湿疹、胃肠道感染的药物中的应用。

10.一种药物组合物，其特征在于：其包含治疗有效量的权利要求1-3任一所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可药用盐；

优选的，所述药物组合物，其进一步包含可药用载体。

说明书

技术领域

本发明具体涉及新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖及其制备方法与应用。

背景技术

岩藻多糖是一种硫酸化的褐藻杂多糖，生物活性具有广谱性[Fitton,J.H.,Stringer,D.N.,and Karpiniec,S.S.(2015).Therapies from Fucoidan:An Update.Marin Drugs 13,5920-5946.]。然而，由于多糖制剂具有异质性且多糖制剂不能被标准化，在医学上几乎是不可能使用聚合物分子的。因此，如何从岩藻多糖中提取具有固定结构和标准特性的低聚糖就成了一个难题。使用酶实现岩藻多糖的解聚作用并且提取出具有生物活性低聚糖，为其在药剂学和整容整形中使用这类化合物提供了新的可能[Kusaykin,M.I.,Silchenko,A.S.,Zakharenko,A.M.,and Zvyagintseva,T.N.(2016).Fucoidanases.Glycobiology 26,3-12]。

在混合物中使用岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，用来预防或者治疗特应性皮炎和湿疹[RU2586776C2，2016年6月10日]、胃肠道感染[WO2016139333A1，2016年9月9日]的说法已经得到公开发表。有人建议使用新型N-岩藻聚糖硫酸酯低聚糖刺激血管[RU 2559629 C2，2015年8月10日]，并且将新型硫酸化低聚糖衍生物作为高效肝素结合蛋白抑制剂[RU 2483074 C2，2013年5月27日]加以使用。现已得知，岩藻糖基化低聚糖可用于保护植物免受病原体之害[US 6984630B1，10.01.2006]。

与多步骤采取有机合成的方法制取硫酸化低聚糖相比，从岩藻多糖中通过酶制剂制取类似的低聚糖的独特之处在于：更简单可行，制取低聚糖的步骤从数量上来说更少，得到的反应产物得率更高。

最初，我们通过酶的水解作用从枯墨角藻(Fucus evanescens)中获取到的是岩藻多糖低聚糖。为达到这一结果，我们把岩藻多糖和从福尔摩沙藻类(Formosa algae)海洋微生物中获取的原生岩藻多糖FFA混合在一起，放入0.015M磷酸钠缓冲液，pH值为7.2，并在25℃的温度环境人工培养72h。用75％的乙醇水溶液沉淀出高分子水解产物，10,000g离心30min，将上清液放在旋转式蒸发器中进行蒸发浓缩，蒸馏水复溶后将上清液倒入含有P-6生物凝胶柱中，用水平衡，然后以0.7mL/min的速率洗脱岩藻糖基化低聚糖。把低分子量的低聚糖集中起来，在旋转式蒸发器中进行浓缩和再次色谱分离。其结果是，通常得到的是结构为A和B的二糖[希尔钦科A.C.，福尔摩沙藻类海洋微生物KMM 3553T和海洋软体动物蜘蛛螺中的岩藻多糖和褐藻胶裂解酶：化学副博士学位答辩论文。俄罗斯国家科学院远东分院太平洋生物有机化学研究所，符拉迪沃斯托克，2014年，第69页]。但是结构为A和B的二糖，受限于分子中岩藻糖残基的数量和种类，应用范围较小。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供了一种新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，该岩藻聚糖硫酸酯低聚糖中的岩藻糖残基(固定结构)的数量为4个或6个，扩大了具有固定结构的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的数量。

本发明的另一个目的是提供上述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的制备方法。该方法是利用酶制剂在铜藻岩藻多糖溶液中制取岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，更简单可行，反应产物的得率更高。

本发明的第三个目的是提供上述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的应用。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，包括由四个岩藻糖残基依次连接而成的链，岩藻糖残基由1→3和1→4交替发生化合，硫酸基分布在第二岩藻糖残基的C₂和C₃上，以及第三岩藻糖残基的C₂上。

优选的，上述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖还包括侧链，侧链由两种非硫酸化的岩藻糖残基通过1→2糖苷键连接而成，侧链通过1→4糖苷键连接在第三岩藻糖残基上。

优选的，所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，选自以下两种：

上述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的制备方法，包括如下步骤：

将重组岩藻多糖酶FFA1和铜藻岩藻多糖溶液在Tris-HCl缓冲液中混合，得到混合液，保温反应、加热灭酶、分离，得到分子式I和II的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖。

有人通过其他已知的方法可以制取出重组岩藻多糖酶FFA1[希尔钦科A.C.，福尔摩沙藻类海洋微生物KMM 3553T和海洋软体动物蜘蛛螺中的岩藻多糖和褐藻胶裂解酶：化学副博士学位答辩论文。俄罗斯国家科学院远东分院太平洋生物有机化学研究所，符拉迪沃斯托克，2014年，第110页]。

优选的，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0-7.5。

优选的，所述重组岩藻多糖酶FFA1和铜藻岩藻多糖的质量比为0.01％-0.03％。

优选的，所述培育的方法为，在25℃-38℃的温度范围内，培育72-75h。

优选的，所述加热灭酶的温度为95-105℃，加热时间为5-10min。

优选的，其中所述分离步骤包括用沉淀剂沉淀大分子水解产物的步骤，所述沉淀剂为75％的乙醇水溶液或75％的丙酮水溶液。

进一步优选的，所述分离步骤还包括将沉淀大分子水解产物得到的沉淀物离心提取的步骤。

更进一步优选的，所述离心提取的条件为：9000-10000g，离心时间20-30min。

优选的，所述分离步骤包括将提取沉淀物后的上层清液倒入阴离子交换吸附柱中，进行梯度洗脱的步骤。

进一步优选的，在所述阴离子交换吸附柱中，以碳酸氢铵作为洗脱剂，以1ml/min的洗脱速度进行梯度洗脱。

所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可药用盐在作为岩藻多糖酶、岩藻糖苷酶和硫酸酯酶的基质中的应用。

所述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可药用盐在制备用于预防或治疗特应性皮炎和湿疹、胃肠道感染的药物中的应用。

一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖或其可药用盐。

优选的，上述药物组合物，其进一步包含可药用载体。

本发明的有益效果为：

本发明中提供的新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖中的岩藻糖残基(固定结构)的数量为4个或6个，扩大了具有固定结构的新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的数量，进而扩大了岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的使用范围，为预防或治疗特应性皮炎和湿疹、胃肠道感染的药物提供了更多的组分来源。

利用本发明的方法可以制备出两种新型岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，丰富了岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的种类。本方法简单可行，反应产物的得率更高。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

把重组岩藻多糖酶FFA1(1mg)放入pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液中，和5％的铜藻(Sargassum horneri)岩藻多糖溶液混合在一起，将混合物在37℃的温度条件下人工培养72h，然后加热至100℃，加热时间5min。生成的沉淀物用离心法进行分离并弃去不用。在上层清液中加入乙醇，直到其浓度达到75％。形成的沉淀物(高分子成分)离心处理，9000g，离心时间20min。上层清液(低分子成分)被倒入到含有Q-琼脂糖凝胶吸附剂的柱体中，用纯水平衡。然后以1mL/min的速度，用碳酸氢铵对低聚糖进行线性梯度洗脱。先操作得到分子式为II的硫酸化岩藻糖基化低聚糖，然后操作得到分子式为I的硫酸化岩藻糖基化低聚糖，随后把得到的产物进行冷冻干燥，得到的目标产物的产率占低分子成分总量的5-15％。

实施例2

把重组岩藻多糖酶FFA1(1mg)放入pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液中，和10％的铜藻(Sargassum horneri)岩藻多糖溶液混合在一起，将混合物在37℃的温度条件下人工培养75h，然后加热至100℃，加热时间10min。生成的沉淀物用离心法进行分离并弃去不用。在上层清液中加入丙酮，直到其浓度达到75％。形成的沉淀物(高分子成分)加以离心处理，10000g，离心时间30min。上层清液(低分子成分)被倒入到含有Q-琼脂糖凝胶吸附剂的柱体中，用纯水平衡。然后以1mL/min的速度，用碳酸氢铵对低聚糖进行线性梯度洗脱。先操作得到分子式为II的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，然后操作得到分子式为I的岩藻聚糖硫酸酯低聚糖，随后把得到的产物进行冷冻干燥，得到的目标产物的产率占低分子成分总量的7-20％。

得到的低聚糖的结构用核磁共振光谱加以确定。

在分子式为I的低聚糖的¹H-光谱上，我们发现了四个不同的α-甲基-L-岩藻吡喃糖苷残基发生了化学位移，这四个残基在表格1中分别用字母a-d来表示。借助1DTOXY光谱和COSY光谱，可以确定出每一个残基发生的化学位移，以及它们的化学序列。从HSQC-光谱中可以确定出¹H化学位移和¹³C化学位移之间的关系。ROESY光谱表明，在d残基H1和c残基H4之间，c残基H1和a残基H3之间，b残基H1和H3残基及d残基H4之间具有关联性。在HMBC光谱上，可以观察到，在d残基С1和c残基H4之间，c残基С1和a残基H3之间，b残基С1和d残基H3之间具有关联性。同样地，质子d1,c1和b1相应地分别与碳原子c4,a3和d3具有关联性。

在此基础上可以得出结论，分子式为I的低聚糖具有一个碳架：α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp。

表1分子式为I的岩藻糖基化低聚糖的化学位移(ppm)

根据700兆赫兹、308K条件下的¹H光谱，丙酮2.225的化学位移可以测得各种化学位移。根据700兆赫兹、308K条件下的¹³С光谱，丙酮31.45的化学位移可以测得各种化学位移。

通过同样的方式，可以确定出分子式为II的低聚糖的结构。¹H-光谱显示，存在六种不同的单糖残基。1DTOXY光谱、COSY光谱和HSQC光谱都能够确定出，每一种单糖残基的质子化学位移和碳化学位移。这些单糖残基在图表2中都有所体现。

在ROESY光谱上可以观察到，在a’残基H1和d’残基H4之间，在e’残基H1和d’残基H3之间，在d’残基H1和c’残基H4之间，在c’残基H1和b’残基H3之间，在f’残基H1和a’残基H2之间，都存在相关性。在HMBC光谱上，碳原子a’1,d’1,e’1,f’1,c’1分别和质子d’4,c’4,d’3,a’2和b’3具有相关性，而质子a’1,e’1,f’1,d’1，则和碳原子d’4,d’3,a’2,c’4分别具有相关性。此外，在HMBC光谱上可以观察到，碳原子b’3和质子c’1或者d’1具有相关性。

表2分子式为II的岩藻糖基化低聚糖的化学位移(ppm)

根据700兆赫兹、308K条件下的¹H光谱，丙酮2.225的化学位移可以测得各种化学位移。根据700兆赫兹、308K条件下的¹³С光谱，丙酮31.45的化学位移可以测得各种化学位移。

基于以上论述可以得出结论：分子式为II的低聚糖具有以下形式的支链结构：

硫酸盐在单糖类残基中的位置，可以通过将其质子位移和岩藻糖(H1＝5,19,H2＝3,76,H3＝3,85,H4＝3,80,H5＝4,19,H6＝1,20)进行对比加以确定，也可以通过将其碳原子位移与α-甲基-L-岩藻吡喃糖苷(C1＝100,5,C2＝69,0,С3＝70,6,С4＝72,9,С5＝67,5,С6＝16,5)进行对比加以确定。根据岩藻糖H2在弱场0.8-0.9ppm的移动，和α-甲基-L-岩藻吡喃糖苷在弱场4-6ppm的移动，可以计算出，在位置2发生了硫酸盐化作用。根据H3在弱场0.9-1.0ppm的移动，和C3在弱场4-6ppm的移动可以确定出，在位置3存在硫酸盐。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

岩藻聚糖硫酸酯低聚糖及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。