专利摘要

一种广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂，即2－单羧基取代酞菁锌－寡聚赖氨酸偶合物及其制备方法和用途。该杀菌剂是以醋酸锌，邻苯二甲酸酐和偏苯三甲酸酐为起始原料，经固相合成、水解、层析柱分离而得到较纯的2－单羧基取代酞菁锌，然后将2－单羧基取代酞菁锌与寡聚赖氨酸偶合得到最终产物。这种新型的杀菌剂具有多种用途，能杀死不同种类的细菌，具有一定的广谱性。另一方面，该杀菌剂含有能与细菌表面特异性结合的标记物质，可达到特异性杀死细菌而不伤及正常细胞的低毒性的目的。研究发现，该药物在很小的浓度和光剂量下对牙周病的主要致病菌牙龈卟啉菌的杀伤率高于97％，但同时对人牙周膜细胞的影响很小，因此可作为治疗牙周病的有效药物。

权利要求

1.一种广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂，即2-单羧基取代酞菁锌-寡聚赖氨酸偶合物，其特征在于，它的表达式为2-ZnPcC₁-PL(其中C₁代表单个羧基，PL代表寡聚赖氨酸)，它的结构式为：

2.如权利要求1所述的杀菌剂2-ZnPcC₁-PL，其特征在于，它是由2-单羧基取代酞菁锌与寡聚赖氨酸偶合而得到的，其中2-单羧基取代酞菁锌的结构式为：

3.一种权利要求1的广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂2-ZnPcC₁-PL的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)以无水醋酸锌为模板剂，钼酸铵为催化剂，使前驱物邻苯二甲酸酐与偏苯三甲酸酐的摩尔比大于3∶1，并在160℃-190℃的固相条件下合成出2-单酰胺取代酞菁锌；

(2)将步骤(1)的产物在90℃-100℃下水解，生成2-单羧基取代酞菁锌的粗产物；

(3)利用液相色谱分离的办法将步骤(2)所得的粗产物分离纯化，具体方法是，以硅胶作为固定相，DMF与丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行色谱分离，并收集后洗脱下来的组分；再将收集到的样品根据前面所述的分离步骤反复多次，即可得到较纯的2-单羧基取代酞菁锌；

(4)将步骤(3)所得的产物在常温下将其所带的羧酸基团活化，并与寡聚赖氨酸进行偶合得到2-ZnPcC₁-PL。

4.一种权利要求1的广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂2-ZnPcC₁-PL的用途，其特征在于，它作为临床上治疗牙周病等由细菌引起的疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一类具有选择性的新型酞菁类光敏剂的制备方法，及其作为一种广谱低毒的杀菌剂在牙周病治疗方面的应用。

背景技术

使用细胞毒性物质是抑制或杀灭细菌的方案之一(Photodynamicantimicrobial chemotherapy(PACT).J Antimicrobial Chemotherapy.1998，42：13-28)，与传统的抗菌素相比，具有可抑制或杀灭的细菌种类范围广的优点，但同时它也有选择性差的弱点。本项发明设计并发展一种对细菌具有选择亲和力的新型杀菌剂，以克服这个选择性差的弱点。

光动力灭菌化学疗法(Photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)是一种新的治病方法，其特点是利用药物在特定波长光的作用下产生单线态氧以杀死细菌。本发明的目的是制备对牙龈卟啉菌具有一定的靶向作用的金属酞菁化合物，使其在光的作用下能杀死牙龈卟啉菌，而对邻近的正常细胞不至有大的伤害，从而成为治疗牙周病的有效药物。通常的光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)主要用于某些实体恶性肿瘤的治疗，已成功地应用于膀胱癌、食管癌、支气管癌、口腔癌、皮肤癌、肋膜间皮瘤、鼻咽癌、喉癌、肝癌、乳腺癌、以及脑癌。最近，光动力疗法也开始用于其他方面的治疗。例如2000年，经美国食品药物管理局批准的用于光动力疗法治疗老年性视网膜黄斑变性(age related macular degeneration，AMD)的光敏剂Visudyne，是第一个能够有效治疗老年性黄斑变性的药物。1993年，光动力治疗新药光敏素(photofrin)在加拿大被批准上市，标志着PDT正式成为除手术、放疗和化疗以外的第四种成熟的肿瘤治疗方法，同时也掀起了医药界寻找第二代和第三代PDT药物的高潮。酞菁及其衍生物不但可以用作染料，而且在光电材料、非线性光学材料、催化剂、光记录介质材料等高科技领域也得到了广泛的应用。酞菁及其衍生物以其良好的光热稳定性，光毒性小，在600nm-800nm之间的某一特定波长有强的吸收等优点，成为新一代光敏剂中的佼佼者。本项发明主要是制备一类新型酞菁类光敏剂，并在此基础上使其与对细菌表面有亲和力的标记物耦合，以增加该光敏剂的选择性，同时也减少了它对正常细胞的毒性。

口腔疾病中最常见的主要有龋齿和牙周病等。第二次全国口腔健康流行病学调查显示，我国成人的恒牙患龋率为49.88％，儿童的乳牙患龋率为76.55％。牙周疾病是由口腔病原菌，如格兰氏阴性的牙龈卟啉菌的过度增殖所引起的。如不及时治疗，牙周炎将导致牙齿周围空洞的形成，造成牙齿松动，甚至牙齿的早期脱落。抑制或消除口腔病菌的生长，能有效地防治牙周炎或控制疾病的急性发作，是治疗牙周炎的关键。口腔病菌也与身体健康的其他方面有关，越来越多的研究报告指出，口腔病菌可能与血管硬化、心脏病突发、中风、早产、甚至肿瘤的发病有关。例如，引发牙周病的细菌牙龈卟啉菌，曾在人体消化道以及堵塞血管、造成心脏病的堵塞物里面被检测出。目前临床上治疗牙周病的洁治术和根面平整，主要是用机械的方法去除牙斑或齿垢，近年来，也越来越经常附加上抗菌素疗法。然而，后者往往会引发细菌的抗药性及对口腔微环境的破坏。因而相当多的病人在治疗后出现重复感染，需要进一步治疗。由此可见，用光动力疗法消除口腔病菌在龋齿和牙周病防治上有独特的优点和重大的实际意义。

发明内容

本项发明的目的在于公开一种新型酞菁类光敏剂，即2-单羧基取代酞菁锌与各种氨基酸、多肽及其带有氨基基团的化合物之间的偶合物的合成方法。本项发明以其中一种化合物2-单羧基取代酞菁锌-寡聚赖氨酸的偶合物(2-ZnPcC₁-PL，其中C₁代表单取代羧基，PL代表寡聚赖氨酸)的合成方法为例。并将该光敏剂2-ZnPcC₁-PL作为一种对细菌具有靶向性质的新型抗菌剂应用于牙周病方面的治疗。目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。

此项发明采用以无水醋酸锌为模板剂，钼酸铵为催化剂，使前驱物邻苯二甲酸酐与偏苯三甲酸酐的摩尔比大于3∶1，并在160℃-190℃的固相条件下反应3-4小时，合成出2-单酰胺取代酞菁锌，然后在90℃-100℃的温度条件下将2-单酰胺取代酞菁锌水解，24小时后得到2-单羧基取代酞菁锌的粗产物。接下来我们使用硅胶作为固定相，以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)与丙酮作为混合洗脱剂对2-单羧基取代酞菁锌的粗产物进行反复的分离，最终得到较纯的2-单羧基取代酞菁锌。最后对2-单羧基取代酞菁锌的羧基进行活化并与寡聚赖氨酸进行偶合得到最终产物2-ZnPcC₁-PL。

传统合成单取代金属酞菁衍生物的方法(Synthesis of UnsymmetricallySubstituted Subphthalocyanines，Chem.Eur.J.2000，6，No.12)一般是先合成无取代亚酞菁，然后再与含有取代基的前躯物(比如3-羧基邻苯二甲腈)和金属一起合成得到最终的单取代金属酞菁衍生物。而本发明所采用的方法不但可以减少合成的步骤和操作的复杂性，而且其中优化的分离提纯方法是重要的。

本项发明合成出的2-单羧基取代酞菁锌由于只带有一个羧酸基团，因此与多羧基取代酞菁锌相比，在与寡聚赖氨酸进行偶合的过程中避免了大量的交连而引起的产物溶解性的下降。因此单羧基取代酞菁锌在拓展合成方面更具潜力。

本项发明的最终产物2-ZnPcC₁-PL是通过引入一段具有生物活性的寡聚赖氨酸基团，使其表面带有大量的正电荷。这样，一方面，由于分子之间的静电相斥作用，减小了2-ZnPcC₁-PL分子之间的聚集；另一方面，由于带有足量的正电荷，因而促使2-ZnPcC₁-PL分子对表面带有负电荷的革兰氏阴性菌的靶向作用。本项发明通过涂板计数法与MTT法对细菌和细胞的体外活性实验表明：光敏剂2-ZnPcC₁-PL对革兰氏阴性的牙龈卟啉菌有很好的杀伤作用，但同时对人牙周膜细胞的影响很小(如图6、图7所示)。因此这项研究结果将在牙周病的治疗方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1为2-单酰胺取代酞菁锌的合成示意图。

图2为2-单羧基取代酞菁锌的合成示意图。

图3为利用HPLC分析仪在677nm下跟踪分析分离过程中收集的各组分的示意图：(1)为无取代酞菁锌的分析曲线；(2)为实施例一中的最终产物的HPLC分析曲线，根据曲线可以清楚的判断出一个组分为2-单酰胺取代酞菁锌而另一个组分为无取代酞菁锌；(3)为实施例三层析分离过程中先被洗脱下来的组分的分析曲线，因为曲线与(2)相当的吻合所以可以认为先被洗脱下来的组分中含有2-单酰胺取代酞菁锌和无取代酞菁锌；(4)为实施例三中第二次重复分离后洗脱下来的组分的分析曲线；(5)为实施例三中得到的最终样品的分析曲线；(6)为洗脱梯度流程，其中A为水，B为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。

图4为实施例三中得到的最终样品2-单羧基取代酞菁锌的质谱图。其中主峰621.8(理论值为621.92)为该化合物的分子离子峰，该峰经过ms/ms之后的576.4(理论值为576.9)的峰即为无取代酞菁锌的分子离子峰。

图5为2-单羧基取代酞菁锌与寡聚赖氨酸进行偶合的示意图。

图6中(1)为在波长670nm，能量密度1.2J/cm²的激光作用下，不同溶度的光敏剂2-ZnPcC1-PL对牙龈卟啉菌的抑菌率曲线；(2)为670nm下10uM的光敏剂在不同能量密度下的抑菌率曲线。其中所述的抑菌率＝(对照组个数平均值-实验组个数平均值)/对照组个数平均值。

图7为在波长670nm、能量密度15J/cm²的激光作用下10uM光敏剂2-ZnPcC1-PL对牙龈卟啉菌和人牙周膜细胞抑制作用的对比图。

具体实施方式

实施例一2-单酰胺取代酞菁锌的合成

在带有回流装置和搅拌子的500ml三颈瓶中加入充分研细的偏苯三甲酸酐2.40g(0.0125mol，Merck)，邻苯二甲酸酐12.96g(0.08750mol)，无水醋酸锌22.00g(0.1002mol)，尿素60g(1mol)，钼酸铵0.50g(0.4mmol)，氯化铵2.00g(0.0374mol)。在油浴中加热至170℃，反应4小时。反应结束后用0.5M的HCl洗涤数次，再用纯水洗至中性，得到22.25g固体。产率67％，由HPLC判断其中22％为2-单酰胺取代酞菁锌。

实施例二2-单羧基取代酞菁锌的合成

取15.00g实施例一所制备的2-单酰胺取代酞菁锌于250ml的三颈瓶中，加入1M的KOH 100ml，在100℃下搅拌回流24h。待反应结束后抽滤，得到绿色固体，加入0.5M KOH洗涤并抽滤，直到滤液无色为止。然后用1M的HCl洗涤数次，再用水洗至中性烘干。

实施例三2-单羧基取代酞菁锌的分离纯化

选用40cm长，内径为3cm的层析柱，以100目的硅胶为吸附剂，DMF∶丙酮＝3∶1的混合溶剂为洗脱剂，用DMF∶丙酮＝3∶1的混合溶剂湿法装柱，装柱高度为30cm。将上一步反应处理后的粗产品1.85g溶于37ml的DMF中。每次加样量为1ml，柱子可反复使用多次。在洗脱过程中可以发现蓝绿色的酞菁样品分为两个部分，收集第二部分(后洗脱下来的)。将收集下来的样品冷冻干燥。将干燥好的样品按照上述的方法再次进行过柱分离，如此反复三到四次即可除去无取代酞菁锌和2-单酰胺取代酞菁锌。最后再将样品用丙酮溶解并洗脱即可得到较纯的2-单羧基取代酞菁锌。纯化过程中收集的样品使用HPLC高效液相色谱跟踪分析。

实施例四2-单羧基取代酞菁锌-寡聚赖氨酸偶合物(2-ZnPcC₁-PL)的合成

称取20.95mg(0.0337mM)2-单羧基取代酞菁锌放入50ml带有搅拌子的圆底烧瓶，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺氢氯化物(EDC)9.68mg(0.0505mM)，N-羟基丁二酰亚胺5.81mg(0.0505mM)，最后加入6mlDMSO使固体样品溶解。常温避光条件下，使羧酸取代基活化。24h后加入寡聚赖氨酸56.2mg(0.0225mM)和0.6ml吡啶继续反应24h。待反应完全后，加入10ml纯水，用Maxi Dry Lyo真空浓缩/冻干机抽干，将抽干后的固体用50ml纯水溶解，离心后取上清液，清液用二氯甲烷反复萃取4-5次，以除去未反应完全的EDC，N-羟基丁二酰亚胺等杂质，取水层用同上的方法抽干，得水溶性的蓝色固体，即2-ZnPcC₁-PL 81.7mg。

实施例五光敏剂(2-ZnPcC₁-PL)对牙龈卟啉菌抑制作用的研究

用PBS稀释牙龈卟啉菌制成细胞悬浊液(2.5×10⁶-3.0×10⁶个细菌/ml)，以每孔92ul接种于96孔细胞培养板，往96孔板中加入8ul不同浓度光敏剂2-ZnPcC₁-PL，以达到最终设计的实验浓度(每个不同的浓度做3次重复实验)，实验中还设置了空白对照孔。室温下在暗室中用波长670nm的激光器照射相应的时间。光照后每孔取出10ul用PBS稀释10⁴倍后取100ul涂板(细菌培养板)，之后将细菌培养板放入厌氧培养袋中，在37℃下培养，待长出菌落后(约24小时)计数。研究结果如附图6的说明中所述，在很低能量密度作用下光敏剂2-ZnPcC₁-PL对牙龈卟啉菌就有很好的杀伤作用，在某一特定的药物浓度和能量密度下其抑制率甚至可以达到99％以上。

实施例六光敏剂(2-ZnPcC₁-PL)对牙周膜细胞影响的研究

将转接三代后的牙周膜细胞，用胰蛋白酶消化后以5×10⁴个细胞/ml接种于96孔细胞培养板，每孔200ul。待2小时后细胞贴壁，加入光敏剂2-ZnPcC₁-PL以达到最终的实验浓度(每个不同的浓度各做3次重复实验)，室温下在暗室中用波长670nm的激光器照射相应的时间。光照后吸出培养基，并加入新鲜的培养基放入37℃的CO₂培养箱中培养24小时。24小时后每孔加入5ul MTT试剂并继续培养4小时。吸出培养基，加入200ul DMSO溶解代谢后的固体颗粒，待完全溶解后用酶标仪在波长为578nm下检测其吸光度。图7显示了光敏剂2-ZnPcC₁-PL对细胞的影响，并与牙龈卟啉菌做了比较。

一种广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂及其制备方法和用途专利购买费用说明

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