专利摘要

本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用。本发明通过对热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌进行基因工程改造，引入ribC(G199D)点突变，并依次敲除purR、purA、ccpN、ldh基因，然后向改造后的工程菌中导入携带有核黄素合成基因簇的表达载体而构建得到一系列高温产核黄素的地芽孢杆菌工程菌。经测定，经过基因工程改造后的地芽孢杆菌发酵24h核黄素产量为520mg/L；通过对菌株进行葡萄糖和木糖进行混合发酵，产量可以达到1g/L以上。本发明提供的工程菌具有生长温度高，代时短，可利用廉价碳源等优点，可以低成本地用于核黄素的大规模生产。

权利要求

1.热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)工程菌GT-01S，其特征在于，工程菌GT-01S是通过基因工程技术在热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)DSM 2542的ribC基因上引入点突变，使其编码蛋白的第199位氨基酸残基由G变为D，将改造后的菌株命名为GT-01，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-01中构建得到的；其中，ribC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-02S，其特征在于，工程菌GT-02S是通过基因工程技术敲除菌株GT-01中的purA基因，将改造后的菌株命名为GT-02，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-02中构建得到的；其中，purA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

菌株GT-01的定义同权利要求1中所述。

3.热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-03S，其特征在于，工程菌GT-03S是通过基因工程技术敲除菌株GT-02中的purR基因，将改造后的菌株命名为GT-03，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-03中构建得到的；其中，purR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

菌株GT-02的定义同权利要求2中所述。

4.热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-04S，其特征在于，工程菌GT-04S是通过基因工程技术敲除菌株GT-03中的ccpN基因，将改造后的菌株命名为GT-04，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-04中构建得到的；其中，ccpN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

菌株GT-03的定义同权利要求3中所述。

5.热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-05S，其特征在于，工程菌GT-05S是通过基因工程技术敲除菌株GT-04中的ldh基因，将改造后的菌株命名为GT-05，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-05中构建得到的；其中，ldh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

菌株GT-04的定义同权利要求4中所述。

6.根据权利要求1-5任一项所述的工程菌，其特征在于，携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体为pUCG3.8-R2；

所述热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌为DSM 2542。

7.热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、pUB31-sfGFP质粒的构建

A1、以pUB31质粒为模板，用引物Vm-F和Vm-R扩增得到的pUB31质粒的骨架序列；

A2、以热脱氮地芽孢杆菌的基因组DNA为模板，用引物Pm-F和Pm-R扩增得到启动子片段；其中，启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

A3、以pTAC-RiboJ-gfp质粒为模板，用引物sfGFP-F和sfGFP-R扩增得到GFP片段；

A4、将上述骨架序列、启动子片段和GFP片段通过Gibson组装得到质粒pUB31-sfGFP；

B、GT-01菌株的构建

B1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用含有点突变的引物ribCm1和ribCa以及引物ribCs和ribCm2分别扩增得到含有点突变的ribC基因的上、下游片段；

B2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB31s和pUB31a扩增得到载体片段；

B3、将B1的上、下游片段与B2的载体片段通过Gibson组装得到ribC点突变质粒pUB31-ribC，将该质粒导入热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542中，通过同源重组的方法突变ribC，得到菌株GT-01；

C、GT-02菌株的构建

C1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物purA up-F和purA up-R以及引物purA down-F和purA down-R分别扩增得到purA基因的上、下游片段；

C2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

C3、将C1的上、下游片段与C2的载体片段通过Gibson组装得到purA基因敲除质粒pUB31-purA，将该质粒导入菌株GT-01中，通过同源重组的方法敲除purA，得到菌株GT-02；

D、GT-03菌株的构建

D1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物purR up-F和purR up-R以及引物purR down-F和purR down-R分别扩增得到purR基因的上、下游片段；

D2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

D3、将D1的上、下游片段与D2的载体片段通过Gibson组装得到purR基因敲除质粒pUB31-purR，将该质粒导入菌株GT-02中，通过同源重组的方法敲除purR，得到菌株GT-03；

E、GT-04菌株的构建

E1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物ccpN up-F和ccpN up-R以及引物ccpN down-F和ccpN down-R分别扩增得到ccpN基因的上、下游片段；

E2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

E3、将E1的上、下游片段与E2的载体片段通过Gibson组装得到purR基因敲除质粒pUB31-ccpN，将该质粒导入菌株GT-03中，通过同源重组的方法敲除ccpN，得到菌株GT-04；

F、GT-05菌株的构建

F1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物ldh up-F和ldhup-R以及ldh down-F和ldh down-R分别扩增得到ldh基因的上、下游片段；

F2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

F3、将F1的上、下游片段与F2的载体片段通过Gibson组装得到purR基因敲除质粒pUB31-ldh，将该质粒导入菌株GT-04中，通过同源重组的方法敲除ldh，得到菌株GT-05；

G、将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体pUCG3.8-R2导入菌株GT-05中构建得到热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌；

所用引物序列如下：

其中，ribC、purA、purR、ccpN、ldh基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-5所示。

8.权利要求1-6任一项所述工程菌或按照权利要求7所述方法构建得到的工程菌在发酵生产核黄素中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用改良的ASYE培养基进行菌种发酵，培养基中卡那霉素的浓度为12.5μg/mL；发酵条件为50-70℃，250rpm。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用葡萄糖和木糖按1:5-4:5重量比混合得到的混合糖替换培养基中的葡萄糖成分。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用。

背景技术

核黄素，即维生素B2，是细菌和动物必需的维生素之一，在生物体内通常以FMN和FAD的形式存在，参与细胞内氧化还原反应。它主要应用在制药，饲料添加剂，食品添加剂和化妆品等领域，目前，核黄素生产工艺是微生物发酵法。在早期其生产菌株为真菌，像解朊假丝酵母(Candida famata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)等(Stahmann et al，2016，Appl Microbiol Biotechnol 100：2107-2119)。但由于真菌生产核黄素存在着一些问题，例如发酵周期长(6-7天)、产量较低(小于5g/L)、原料成分配比复杂、菌体粘度大、后期分离困难、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素合成等。随后，又开发了以细菌为宿主菌的基因工程菌。这些基因工程菌的原料要求简单、产量高、成熟的原核细胞基因工程技术等优点，迅速替代了利用真菌的生产技术。目前，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过遗传改造成为主要的核黄素工业生产菌(Susanne et al，2016，Appl Microbiol Biotechnol 100：2107-2119)，但其生产过程属于常温发酵。

枯草芽孢杆菌发酵生产属于常温发酵，与热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的高温发酵相比，发酵生产核黄素具有明显的劣势：一是能耗高。首先在常温发酵生产过程中需要大量的冷却水来缓解发酵过程的生物热，以维持常温发酵过程中生产菌种的最适生长温度，常温发酵过程中冷却水的耗费约占生产成本的30％，而高温发酵可以减少甚至不使用冷却水。其次设备原料等高温灭菌冷却时间较少，节能节水。二是生产周期长，枯草芽胞杆菌生长代时达40-120min。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌代时最快可达16min，比枯草芽孢杆菌的代时要短。因为地芽孢杆菌生长速度快相应的细胞内酶的反应速率提高，合成核黄素的酶反应速度快就可以更快的生产核黄素。三是专利壁垒明显，枯草芽孢杆菌生产核黄素的专利大多被国外大公司掌握，对国内枯草芽孢杆菌的研究与应用造成困扰。四是原料较贵。热葡糖苷酶地芽孢杆菌可以利用更廉价的碳源木质纤维素水解物，比枯草芽孢杆菌发酵过程中使用葡萄糖等原料更便宜；五是简化发酵工艺。枯草芽孢杆菌等常温菌生产核黄素是37℃发酵，而大量的杂菌都能在37℃条件下生长导致发酵过程中很容易染菌。然而，很少有杂菌能在50℃以上的温度下生长，因此地芽孢杆菌的高温发酵是一道天然防止杂菌染菌的屏障，不需要投入大量的设备来防止发酵过程中染菌，简化发酵工艺。因此，与枯草芽孢杆菌工程菌相比，嗜热菌地芽孢杆菌具有独特的优势和应用价值。因此，开发核黄素高温生产工艺是未来核黄素工业发展的方向。

发明内容

本发明的目的是提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-01S，工程菌GT-01S是通过基因工程技术在热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的ribC基因上引入点突变，使其编码蛋白的第199位氨基酸残基由G变为D，将改造后的菌株命名为GT-01，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-01中构建得到的；其中，ribC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌为DSM 2542。

第二方面，本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-02S，工程菌GT-02S是通过基因工程技术敲除菌株GT-01中的purA基因，将改造后的菌株命名为GT-02，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-02中构建得到的；其中，purA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第三方面，本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-03S，工程菌GT-03S是通过基因工程技术敲除菌株GT-02中的purR基因，将改造后的菌株命名为GT-03，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-03中构建得到的；其中，purR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

第四方面，本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-04S，工程菌GT-04S是通过基因工程技术敲除菌株GT-03中的ccpN基因，将改造后的菌株命名为GT-04，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-04中构建得到的；其中，ccpN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

第五方面，本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌GT-05S，工程菌GT-05S是通过基因工程技术敲除菌株GT-04中的ldh基因，将改造后的菌株命名为GT-05，然后将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体导入菌株GT-05中构建得到的；其中，ldh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，本发明中，携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体为pUCG3.8-R2。参见CN 108641992A。质粒pUCG3.8-R2的具体构建方法如下：

(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列；然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列；将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3进行EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S；

(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.81s和pucG3.81a进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列；

(3)以热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)CGMCC 1.5331基因组为模板，用引物Dnribs和Dnriba扩增得到核黄素合成基因簇dnrib；

(4)将上述步骤(2)含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列与步骤(3)的核黄素合成基因簇dnrib进行Gibson组装，转化JM109，筛选得到重组质粒pUCG3.8-R2。

所用引物序列见表1：

表1

质粒pTAC-RiboJ-gfp可参见Lou，C.，Stanton，B.，Chen，Y.J.，Munsky，B.，&Voigt，C.A.(2012).Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context.Nature biotechnology，30(11)，1137。

第六方面，本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：

A、pUB31-sfGFP质粒的构建

A1、以pUB31质粒为模板，用引物Vm-F和Vm-R扩增得到的pUB31质粒的骨架序列；

A2、以热脱氮地芽孢杆菌的基因组DNA为模板，用引物Pm-F和Pm-R扩增得到启动子片段；其中，启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

A3、以pTAC-RiboJ-gfp质粒为模板，用引物sfGFP-F和sfGFP-R扩增得到GFP片段；

A4、将上述骨架序列、启动子片段和GFP片段通过Gibson组装得到质粒pUB31-sfGFP；

B、GT-01菌株的构建

B1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用含有点突变的引物ribCm1和ribCa以及引物ribCs和ribCm2分别扩增得到含有点突变的ribC基因的上、下游片段；

B2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB31s和pUB31a扩增得到载体片段；

B3、将B1的上、下游片段与B2的载体片段通过Gibson组装得到ribC点突变质粒pUB31-ribC，将该质粒导入热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542中，通过同源重组的方法突变ribC，得到菌株GT-01；

C、GT-02菌株的构建

C1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物purA up-F和purA up-R以及引物purA down-F和purA down-R分别扩增得到purA基因的上、下游片段；

C2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

C3、将C1的上、下游片段与C2的载体片段通过Gibson组装得到purA基因敲除质粒pUB31-purA，将该质粒导入菌株GT-01中，通过同源重组的方法敲除purA，得到菌株GT-02；

D、GT-03菌株的构建

D1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物purR up-F和purR up-R以及引物purR down-F和purR down-R分别扩增得到purR基因的上、下游片段；

D2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

D3、将D1的上、下游片段与D2的载体片段通过Gibson组装得到purR基因敲除质粒pUB31-purR，将该质粒导入菌株GT-02中，通过同源重组的方法敲除purR，得到菌株GT-03；

E、GT-04菌株的构建

E1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物ccpN up-F和ccpN up-R以及引物ccpN down-F和ccpN down-R分别扩增得到ccpN基因的上、下游片段；

E2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

E3、将E1的上、下游片段与E2的载体片段通过Gibson组装得到purR基因敲除质粒pUB31-ccpN，将该质粒导入菌株GT-03中，通过同源重组的方法敲除ccpN，得到菌株GT-04；

F、GT-05菌株的构建

F1、以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组DNA为模板，用引物ldh up-F和1dh up-R以及ldh down-F和ldh down-R分别扩增得到ldh基因的上、下游片段；

F2、以质粒pUB31-sfGFP为模板，用引物pUB1-F和pUB31-R扩增得到载体片段；

F3、将F1的上、下游片段与F2的载体片段通过Gibson组装得到purR基因敲除质粒pUB31-ldh，将该质粒导入菌株GT-04中，通过同源重组的方法敲除ldh，得到菌株GT-05；

G、将携带有表达热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体pUCG3.8-R2导入菌株GT-05中构建得到热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌。

所用引物序列见表2：

表2

第七方面，本发明提供所述工程菌或按照上述方法构建得到的工程菌在发酵生产核黄素中的应用。

所述应用包括：使用改良的ASYE培养基进行菌种发酵，培养基中卡那霉素的浓度为12.5μg/mL；发酵条件为50-70℃(优选60℃)，250rpm。

优选地，用葡萄糖和木糖按1∶5-4∶5重量比混合得到的混合糖替换培养基中的葡萄糖成分。更优选地，混合糖中葡萄糖∶木糖重量比为1∶2，混合糖的总浓度为0.2M。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一系列高温产核黄素的地芽孢杆菌(热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌)。因地芽孢杆菌具有生长温度高，代时短，可利用廉价碳源等优点，从而解决了常温菌生产核黄素面临的耗能高，生产周期长，成本高以及发酵工艺复杂等缺陷。从而达到核黄素产业升级的目的。通过核黄素紫外吸收建立的标曲对发酵液内核黄素浓度进行估算，经过基因工程改造后的菌株(GT-05S)G.thermoglucosidasius DSM2542(ribC(G199D)，^ΔpurR，ΔpurA，^ΔccpN，Δldh)发酵24h核黄素产量为520mg/L；通过对菌株进行葡萄糖和木糖进行混合发酵，产量可以达到1g/L以上。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中基因编辑质粒pUB31-sfGFP的结构示意图。

图2为本发明较佳实施例中验证pyrE基因敲除胶图。其中，1-12为实验组，″+″表示阳性对照，″-″表示阴性对照。其中1，2，5，8，10为敲除成功的单克隆菌株。

图3为本发明较佳实施例中ribC(G199D)点突变编辑质粒pUB31-ribC的结构示意图。

图4为本发明较佳实施例中热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌基因组上的ribC(G199D)测序结果。图上部分是基因组上的ribC部分序列，图下部分为测序结果。其中199位氨基酸由G突变为D，突变成功。

图5为本发明较佳实施例中核黄素含量和444nm吸收值的标准曲线。

图6为本发明较佳实施例中含有核黄素基因簇的菌株GT-00S和GT-01S的发酵产量。GT-00S的核黄素产量为28.7mg/L，GT-01S的核黄素产量为84.5mg/L。

图7为本发明较佳实施例中pUB31-purA质粒的结构示意图。

图8为本发明较佳实施例中菌株GT-01的purA敲除验证胶图。

图9为本发明较佳实施例中菌株GT-01的purA敲除测序验证。

图10为本发明较佳实施例中菌株GT-01S和菌株GT-02S的核黄素产量。

图11为本发明较佳实施例中质粒pUB31-purR的结构示意图。

图12为本发明较佳实施例中GT-02菌株的purR敲除跑胶验证。

图13为本发明较佳实施例中GT-02菌株的purR敲除测序验证。

图14为本发明较佳实施例中GT-02S菌株和GT-03S菌株的核黄素产量。

图15为本发明较佳实施例中pUB31-ccpN的质粒结构示意图。

图16为本发明较佳实施例中GT-03菌株的ccpN敲除跑胶验证。

图17为本发明较佳实施例中GT-03菌株的ccpN敲除测序验证。

图18为本发明较佳实施例中菌株GT-03S和菌株GT-04S的核黄素产量。

图19为本发明较佳实施例中pUB31-ldh的质粒结构示意图。

图20为本发明较佳实施例中GT-04菌株的ldh敲除跑胶验证。

图21为本发明较佳实施例中GT-04菌株的ldh敲除跑胶验证。

图22为本发明较佳实施例中菌株GT-04S和菌株GT-05S的核黄素产量。

图23为本发明较佳实施例中菌株GT-05S在以葡萄糖或者以葡萄糖木糖混合糖为碳源的的核黄素产量。

具体实施方式

本发明提供高温产核黄素的地芽孢杆菌(热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌)及其构建方法及应用。

目前嗜热菌的基因编辑工具盒还不完善，只有很少的Marker可用(如耐高温的kan^R抗性)，造成同源重组的反筛困难。通过在温敏型编辑质粒pUB31上引入sfGFP得到含有kan^R和绿色荧光双Marker的编辑质粒pUB31-sfGFP。通过荧光Marker可快速筛选得到想要的双交换菌株。大大提高了使用同源重组进行基因编辑的效率。

在确立了基因编辑方法后，构建基因编辑质粒，具体改造的基因包括ribC(AOT13_09320)，purA(AOT13_03190)，purR(AOT13_02815)，ccpN(AOT13_16900)，ldh(AOT13_05975)。其序列是从NCBI获取的。根据注释，选取purA(AOT13_03190)，purR(AOT13_02815)，ccpN(AOT13_16900)，ldh(AOT13_05975)的上下游片段各1kb左右长度，设计引物，PCR获取每个基因的上下游片段。对ribC(AOT13_09320)，改造位点为(G199D)，设计引物扩增突变位点上下游片段各1kb左右长度，突变位点是通过引物引入的。然后设计引物以pUB31-sfGFP为模板PCR扩增得到载体片段，将载体和每个基因的上下游片段共3片段分别进行Gibson组装得到编辑质粒pUB31-ribC，pUB31-purA，pUB31-purR，pUB31-ccpN，pUB31-ldh。构建的质粒经过酶切验证质粒正确。

将基因编辑质粒通过电转转化到地芽孢杆菌中，通过荧光蛋白辅助同源重组进行基因编辑。通过PCR验证和测序验证编辑是否成功。构建成功的菌株进行发酵。发酵培养基为改良的ASYE培养基。50-70℃(优选60℃)，250rpm进行发酵。因为产物核黄素在444nm有紫外吸收峰，故先根据吸光值建立标准曲线，然后根据标准曲线估算发酵液内核黄素浓度(Shi，T.，Wang，Y.，Wang，Z.，Wang，G.，Liu，D.，Fu，J.，...&Zhao，X.(2014).Deregulation of purine pathway in Bacillus subtilis and its use in riboflavin biosynthesis.Microbial cell factories，13(1)，101)。发酵结果显示，每进行一步发酵，其产量相比上一步改造都有明显的提高。最后，通过使用葡萄糖和木糖进行混合发酵，产量进一步提高。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中，电转方法及改良的ASYE培养基可参见Lin，P.P.，Rabe，K.S.，Takasumi，J.L.，Kadisch，M.，Arnold，F.H.，&Liao，J.C.(2014).Isobutanol production at elevated temperatures in thermophilic Geobacillus thermoglucosidasius.Metabolic engineering，24，1-8。

以下实施例中所用引物序列见表2。

实施例1高温产核黄素的地芽孢杆菌的构建

1、基因编辑方法的建立

1.1 pUB31-sfGFP质粒的构建

用primer 6.0软件设计扩增pUB31质粒(Acetate metabolism in Geobacillus thermoglucosidasius and strain engineering for enhanced bioethanol production Hills，C..1Jul 2015)的骨架的引物Vm-F/Vm-R，扩增得到pUB31载体。热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2菌株为实验室储存菌株(Garg，N.，Tang，W.，Goto，Y.，Nair，S.K.，&van der Donk，W.A.(2012).Lantibiotics from Geobacillus thermodenitrificans.Proceedings of the National Academy of Sciences，109(14)，5241-5246)，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取G.thermodenitrificans NG80-2的基因组，用primer 6.0软件设计引物Pm-F/Pm-R扩增基因组得到启动子片段(SEQ ID NO：6)。以pTAC-RiboJ-gfp质粒(Lou，C.，Stanton，B.，Chen，Y.J.，Munsky，B.，&Voigt，C.A.(2012).Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context.Nature biotechnology，30(11)，1137)为模板，设计引物sfGFP-F/sfGFP-R扩增得到GFP片段，将这三个片段通过Gibson组装得到编辑质粒pUB31-sfGFP(图1)。

1.2基因编辑方法

①挑取电转后有抗平板长出的单克隆四区划线到新的有抗平板上，放到68℃培养箱中培养。②挑选第四区上没有绿色荧光的单克隆到无抗LB液体培养基中(含有Mg²⁺，Fe²⁺，Ca²⁺)，60℃，220rpm摇床培养过夜。③取100μL菌液到900μL水中，记为10^-1，混均后取100μL菌液到900μL水中，记为10^-2，依次稀释到10^-5，取10^-4，10^-5梯度稀释的菌液各100μL均匀涂布到TSA无抗固体平板上，60℃培养箱培养。④挑选没有荧光的单克隆分别涂布到无抗TSA固体平板和有抗(含12.5μg/mL卡那霉素)固体平板上60℃培养箱培养。⑤挑选在有抗(含12.5μg/mL卡那霉素)平板上不长，在无抗平板上生长的单克隆进行菌落PCR。在菌落PCR时，以基因组为模板的PCR产物跑胶为阴性对照，以编辑质粒为模板的PCR产物跑胶为阳性对照。以单克隆为模板的PCR产物跑胶为实验组。通过跑胶验证条带的大小进行验证及测序验证。

1.3通过敲除pyrE基因验证基因编辑方法的可行性

1.3.1 pyrE基因敲除质粒pUB31-pyrE的构建

从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组信息，通过注释找到pyrE(AOT13_08755)，并与枯草芽孢杆菌的pyrE基因序列通过BLAST进行比较，确定其有较高的相似性，其基因结构相似。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌G.thermoglucosidasius DSM 2542为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取地芽孢杆菌的基因组，用primer6.0软件设计扩增pyrE基因上游的引物pyrE up-F/pyrE up-R和pyrE基因下游的引物pyrE down-F/pyrE down-R。通过PCR扩增得到pyrE基因的上下游片片。设计引物pUB31-F/pUB31-R并以质粒pUB31-sfGFP为模板通过PCR扩增得到载体片段，然后通过Gibson组装得到pyrE敲除的编辑质粒pUB31-pyrE。

1.3.2验证基因编辑方法的可行性

通过上述″基因编辑方法″对热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌DSM 2542的基因组上的pyrE基因进行敲除，然后通过对长出的单克隆进行菌落PCR，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行跑胶验证，由胶图可知完成了对基因组上pyrE基因的敲除(图2)。

2、ribC(G199D)菌株的构建

2.1基因编辑质粒的构建

从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组信息，通过注释找到ribC(AOT13_09320)，并与枯草芽孢杆菌的ribC基因序列通过BLAST进行比较，确定其有较高的相似性，其基因结构相似。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌G.thermoglucosidasius DSM 2542为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取地芽孢杆菌的基因组，用primer6.0软件设计扩增ribC(G199D)点突变上游的引物ribCm1/ribCa和ribC点突变下游的引物ribCs/ribCm2。通过PCR扩增得到ribC(G199D)的上下游片段。设计引物pUB31s/pUB31a并以质粒pUB31-sfGFP为模板通过PCR扩增得到载体片段，然后通过Gibson组装得到ribC点突变编辑质粒pUB31-ribC(质粒图谱见图3)。

2.2 G.thermoglucosidasius DSM2542(ribC(G199D))的基因组编辑

基因编辑方法同上述″基因编辑方法″，因为点突变仅仅改变基因组上的单个碱基，无法通过胶图看条带大小的变化看点突变是否成功。因此通过测序进行验证，测序结果显示点突变成功(测序结果见图4)得到菌株GT-01。

2.3导入核黄素基因簇及发酵

将含有G.thermodenitrificans NG80-2核黄素基因簇的质粒pUCG3.8-R2(参见CN108641992A)通过电转的方法转入到野生型菌株G.thermoglucosidasius DSM 2542中得到菌株GT-00S，转入到菌株GT-01中得到菌株GT-01S。对于GT-01S菌株进行发酵，发酵时间为24小时，选用改良的ASYE培养基进行发酵，卡那霉素的浓度为12.5μg/mL。发酵条件为60℃，250rpm。

2.4核黄素产量测定方法及发酵结果

因为核黄素在444nm有紫外吸收(Shi，T.，Wang，Y.，Wang，Z.，Wang，G.，Liu，D.，Fu，Zhao，X.(2014).Deregulation of purine pathway in Bacillus subtilis and its use in riboflavin biosynthesis.Microbial cell factories，13(1)，101)，故可以通过建立核黄素标准样品和紫外吸收的标准曲线，然后通过紫外分光光度计测定样品在444nm吸收值算出核黄素的产量。根据标准曲线得到的计算公式为y＝66.605x-1.3864(R²＝0.9993)。标准曲线见图5。通过发酵24h后的吸光值为产量进行计算得到菌株GT-00S的产量为28mg/L，菌株GT-01S的核黄素产量为84mg/L(图6)。由发酵结果可知，通过在基因上引入ribC(G199D)，使核黄素的产量提高3倍。

3、purA敲除菌株的构建

3.1基因编辑质粒的构建

从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组信息，通过注释找到purA(AOT13_03190)，并与枯草芽孢杆菌的purA基因序列通过BLAST进行比较，确定其有较高的相似性，其基因结构相似。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌G.thermoglucosidasius DSM 2542为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取地芽孢杆菌的基因组，用primer 6.0软件设计扩增purA基因上游的引物purA up-F/purA up-R和purA基因下游的引物purA down-F/purA down-R。通过PCR扩增得到purA基因的上下游片段。设计引物pUB1-F/pUB31-R并以质粒pUB31-sfGFP为模板通过PCR扩增得到载体片段，然后通过Gibson组装得到purA敲除的编辑质粒pUB31-purA(质粒图谱见图7)。

3.2 GT-01菌株的purA敲除

基因编辑方法同上述″基因编辑方法″，通过胶图检测菌株GT-01菌株的purA基因是否敲除(胶图见图8)。由胶图可知，单克隆2，3，5，6，7，8，9已经成功完成purA的敲除，并进一步测序验证(测序验证图见图9)将测序正确的purA敲除的GT-01菌株命名为GT-02。

3.3导入核黄素基因簇及发酵

将核黄素基因簇质粒pUCG3.8-R2通过电转的方法转入到菌株GT-02中得到菌株GT-02S。对于GT-02S菌株进行发酵，发酵时间为24小时，选用改良的ASYE培养基进行发酵，卡那霉素的浓度为12.5μg/mL。发酵条件为60℃，250rpm。

3.4核黄素产量测定

通过发酵24h后的吸光值为产量进行计算得到菌株GT-02S的产量为150.4mg/L，菌株GT-01S的核黄素产量为84mg/L(图10)。由发酵结果可知，通过敲除purA(AOT13_03190)基因，使核黄素的产量提高1.79倍。

4、purR敲除菌株的构建

4.1基因编辑质粒的构建

从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组信息，通过注释找到purR(AOT13_02815)，并与枯草芽孢杆菌的purR基因序列通过BLAST进行比较，确定其有较高的相似性，其基因结构相似。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌G.thermoglucosidasius DSM 2542为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取地芽孢杆菌的基因组，用primer 6.0软件设计扩增purR基因上游的引物purR up-F/purR up-R和purR基因下游的引物purR down-F/purR down-R。通过PCR扩增得到purR基因的上下游片段。设计引物pUB1-F/pUB31-R并以质粒pUB31-sfGFP为模板通过PCR扩增得到载体片段，然后通过Gibson组装得到purR敲除的编辑质粒pUB31-purR(质粒图谱的示意图见图11)

4.2 GT-02菌株的purR敲除

基因编辑方法同上述″基因编辑方法″，通过胶图检测菌株GT-02菌株的purR基因是否敲除(胶图见图12)。由胶图可知，已经成功完成purR的敲除，并进一步通过测序进行验证(测序验证结果见图13)，将测序正确的purR敲除的GT-02菌株命名为GT-03。

4.3导入核黄素基因簇及发酵

将核黄素基因簇质粒pUCG3.8-R2通过电转的方法转入到菌株GT-03中得到菌株GT-03S。对于GT-03S菌株进行发酵，发酵时间为24小时，选用改良的ASYE培养基进行发酵，卡那霉素的浓度为12.5μg/mL。发酵条件为60℃，250rpm。

4.4核黄素产量测定

通过发酵24h后的吸光值为产量进行计算得到菌株GT-03S的产量为180.2mg/L，而菌株GT-02S的核黄素产量为150.4mg/L(图14)。由发酵结果可知，通过敲除purR(AOT13_02815)基因，使核黄素的产量提高1.2倍。

5、ccpN敲除菌株的构建

5.1基因编辑质粒的构建

从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组信息，通过注释找到ccpN(AOT13_16900)，并与枯草芽孢杆菌的ccpN基因序列通过BLAST进行比较，确定其有较高的相似性，其基因结构相似。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌G.thermoglucosidasius DSM 2542为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取地芽孢杆菌的基因组，用primer 6.0软件设计扩增ccpN基因上游的引物ccpN up-F/ccpN up-R和ccpN基因下游的引物ccpN down-F/ccpN down-R。通过PCR扩增得到ccpN基因的上下游片段。设计引物pUB1-F/pUB31-R并以质粒pUB31-sfGFP为模板通过PCR扩增得到载体片段，然后通过Gibson组装得到ccpN敲除的编辑质粒pUB31-ccpN(质粒图谱的示意图见图15)。

5.2 GT-03菌株的ccpN敲除

基因编辑方法同上述″基因编辑方法″，通过胶图检测菌株GT-03菌株的ccpN基因是否敲除(胶图见图16)。由胶图可知，已经成功完成ccpN的敲除，并进一步通过测序进行验证(测序验证结果见图17)，将测序正确的ccpN敲除的GT-03菌株命名为GT-04。

5.3导入核黄素基因簇及发酵

将核黄素基因簇质粒pUCG3.8-R2通过电转的方法转入到菌株GT-04中得到菌株GT-04S。对于GT-03S菌株进行发酵，发酵时间为24小时，选用改良的ASYE培养基进行发酵，卡那霉素的浓度为12.5μg/mL。发酵条件为60℃，250rpm。

5.4核黄素产量测定

通过发酵24h后的吸光值为产量进行计算得到菌株GT-04S的产量为295.12mg/L，而菌株GT-03S的核黄素产量为180.2mg/L(图18)。由发酵结果可知，通过敲除ccpN(AOT13_16900)基因，使核黄素的产量提高1.6倍。

6、ldh敲除菌株的构建

6.1基因编辑质粒的构建

从NCBI获取热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的基因组信息，通过注释找到ldh(AOT13_05975)，并与枯草芽孢杆菌的ldh基因序列通过BLAST进行比较，确定其有较高的相似性，其基因结构相似。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌G.thermoglucosidasius DSM 2542为实验室储藏菌株，用北京天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取地芽孢杆菌的基因组，用primer 6.0软件设计扩增ldh基因上游的引物ldh up-F/ldh up-R和ldh基因下游的引物ldh down-F/ldh down-R。通过PCR扩增得到ldh基因的上下游片段。设计引物pUB1-F/pUB31-R并以质粒pUB31-sfGFP为模板通过PCR扩增得到载体片段，然后通过Gibson组装得到ldh敲除的编辑质粒pUB31-ldh(质粒图谱的示意图见图19)。

6.2 GT-04菌株的ldh敲除

基因编辑方法同上述″基因编辑方法″，通过胶图检测菌株GT-04菌株的ldh基因是否敲除(胶图见图20)。由胶图可知，已经成功完成ldh的敲除，并进一步通过测序进行验证(测序验证结果见图21)，将测序正确的ldh敲除的GT-04菌株命名为GT-05。

6.3导入核黄素基因簇及发酵

将核黄素基因簇质粒pUCG3.8-R2通过电转的方法转入到菌株GT-05中得到菌株GT-05S。对于GT-05S菌株进行发酵，发酵时间为24小时，选用改良的ASYE培养基进行发酵，卡那霉素的浓度为12.5μg/mL。发酵条件为60℃，250rpm。

6.4核黄素产量测定

通过发酵24h后的吸光值为产量进行计算得到菌株GT-05S的产量为553.3mg/L，而菌株GT-04S的核黄素产量为295.12mg/L(图22)。由发酵结果可知，通过敲除ldh(AOT13_05975)基因，使核黄素的产量提高1.9倍。

7、木糖以及葡萄糖和木糖混合糖发酵

改良的ASYE培养基的具体配方参见Lin，P.P.，Rabe，K.S.，Takasumi，J.L.，Kadisch，M.，Amold，F.H.，&Liao，J.C.(2014).Isobutanol production at elevated temperatures in thermophilic Geobacillus thermoglucosidasius.Metabolic engineering，24，1-8。使用该培养基进行发酵，仅将培养基成分中的葡萄糖换成木糖以及葡萄糖和木糖的混合糖(葡萄糖和木糖的总浓度为0.2M，葡萄糖∶木糖重量比为1∶5-4∶5)进行发酵，卡那霉素的浓度为12.5μg/mL。发酵条件为60℃，250rpm。通过发酵24h后测量上清液的吸光值，通过核黄素标曲计算不同碳源的培养基核黄素的产量，菌株GT-05S在以木糖(0.2M)为碳源的培养基中核黄素的产量为445.8mg/L，在以葡萄糖和木糖的混合糖(葡萄糖∶木糖重量比为1∶2)培养基中核黄素的产量为1034.4mg/L(图23)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

华东理工大学

<120> 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400> 1

atgaaaacac tatttatttc gcatccccat cagatgaaaa aagaagaatt gccgccgacc 60

gttatggcgc ttggctattt tgacggcatc catcttgggc atcagaaagt gattcgcact 120

gcggtccaaa tcgcggcgga gaaaggatat aaaagcgcgg tgatgacatt tcacccccat 180

ccttccgtcg tgcttggaaa gaaggataaa catgttcatt tgataacgcc gcttaagaaa 240

aaagagcagt taattggcga acttggcatc gattatttat atattgtcga gtttacctct 300

tcgtttgcgc aactattccc gcaagaattt gttgatcaat acattatcgg ccttcatgtg 360

aagcatgtcg ttgccgggtt tgactttact tacgggcgcc tcggaaaagg gacgatggaa 420

actttgccgt tccattcgcg cgagcaattt acgcagacgg tgattccaaa attaagcatc 480

gacggcgaga aaataagctc cacttatgtc cggcaattgc tgaaaaatgg cgatgtcgac 540

cagctcccgc gtctgctcgg ccgcttttat gaagtggaag gaacggtggt gggcggtgaa 600

cgccgcggaa gaacgattgg gtttccaacg gcgaatatag cgttaaaaga tgactatttg 660

ttgccggcgc tcggcgtata tgcagtaaaa gtaaaaattg gttcagacat ttttgaagga 720

gtgtgcaacg ttggctataa accgactttt tactcaactc gtgaaggatt gccaagcatc 780

gaagtgcaca ttttcgattt tgccaaagac atttatggag aaacgatgac gatcgagtgg 840

catatgcgct taagaagcga acaaaaattc gcgggtgtgg atgaattaat cgcgcaaatt 900

cagcgggata aggaaaaagc gcaagcatat ttccgcaatt tcgccgaaac tacttgcatt 960

ttatcgcaaa aagaggtatt ctaa 984

<210> 2

<211> 1287

<212> DNA

<213> 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400> 2

atgacgtcag tcgtcgttgt cgggacgcaa tggggcgatg aaggaaaagg aaaaattacc 60

gattttctat cagaaaacgc ggaagtgatt gcgagatatc aaggaggaaa caacgcgggg 120

catacgatcg tttttaacgg agaaaaatat aagttacatt taattccatc gggaattttt 180

tataaagata aaatttgcgt catcggaaac ggaatggtaa tcgacccgaa agcattagta 240

agcgagttga attatttgca tgaccacggc atttcaaccg ataatttacg catcagcaac 300

cgcgcgcacg tcattttgcc ttatcattta aaattggatc aattagagga agaacgtaaa 360

ggggcaaaca aaatcggcac gaccaaaaaa ggcatagggc ctgcgtatat ggataaagcg 420

gcgcgcgtcg gcatccgtat cgttgatttg cttgaccgcg aagtgtttga agaaaaatta 480

gcgcgcaact tgcaggaaaa aaatattctt tttgaaaaag tgtacggtgt tgaaggattt 540

aaactggaag atatattaga tgaatactat gaatatggac agcaaattgc caaatatgtt 600

tgcgatacgt ccgttgtgtt aaataatgcg cttgatgaag ggcgccgtgt tctttttgag 660

ggtgcgcaag gcgtcatgct cgatattgac caagggacgt atccgtttgt tacttcatcg 720

aatccagttg ccggcggtgt gacaattggt tccggcgttg ggccaacgaa aattaaacat 780

gtcgtcgggg ttgcgaaagc gtacacgact cgcgttggcg acggcccgtt tccaactgaa 840

ttgcatgatg aaatcggcga ccgcatccgt gaagtcggcc gcgaatatgg aacaacgacg 900

ggacgtccgc gccgcgtcgg ttggttcgac agcgtcgttg ttcgccatgc tcgccgggtt 960

agcggcatca cagatttatc gttaaattcg atcgatgtcc ttactggcat tgaaacatta 1020

aaaatttgtg ttgcttatcg ttataaaggg aaagtgcttg aagagtttcc ggcaagttta 1080

aaagtgctgg cagaatgtga gccgatttac gaagagctgc caggatggtc agaagatatt 1140

accggtgtta agagcttgga tgaactgccg gctaacgccc gccattatgt ggaacgcatt 1200

tcgcaattaa cgggcattcc attatcgatt ttctctgtcg gtccagaccg ttcgcaaaca 1260

aacgttgttc gcagcgtata tgcgtaa 1287

<210> 3

<211> 825

<212> DNA

<213> 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400> 3

atgaaattaa ggcgcagcgg ccgtttagtc gatatgactc attatcttct tgaacggcct 60

catcagctta taccgcttac gttttttgca gagcgttatg aatcggcaaa gtcatcgatt 120

agtgaggact tagcgattat aaaacaaacg tttgaacaac aaggaatcgg aacgatcaaa 180

acgctgccag gagcggcggg cggagttcaa tatattccga aaatgtcgag acaggaagca 240

gacgggatcg ttacatattt atgtgagcag ctgtcgcgcc cagaccggct gctgcctggc 300

ggatatttat atatgacgga tattcttggc gaccctcgcg ttgtcaacaa aatcggccgt 360

ctgtatgcat ccatcttcgc tgaccgcccg gtagatgttg tcatgacgat cgcgacaaaa 420

ggaattcccc tcgcttatgc ggtcgcccac tttttgtatg ttcccgtcgt gattgtccgc 480

catgacaaca aagtgacgga aggatcgatg gtcagcatta actatgtttc tggttcttct 540

aaacgaattc aaacgatggt gttggcgaaa cggagtctgg ccgaaggggc aaacgtttta 600

attatcgatg attttatgaa agcgggcggg acggtaaacg gcatgataaa cttattaaat 660

gaatttaacg ccaaactttc cggcatcggc gtcctcgttg aatctgaaga aacgaaagag 720

cggcttgtcg atgaatatat ttcgctcgta aagctgtctt ccgttgatgt gaaagaaaaa 780

caaattaccg taaaagcagg aaattatatt cactttatgg aataa 825

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400> 4

ttgcaaatcg tcaaagatca tggcccgatt acgggggaga gcattgcgga aaaattgaat 60

ttaacaagag cgacattgcg tccggactta gcgatattaa cgatggccgg atatttggaa 120

gcgcggcccc gggtgggata tttttataca gggaaaaccg gttctcagct gcttgctgat 180

aaaataaaaa agataaaagt agaagattac caatcgattc cagttgttgt caatgaaaat 240

gttagtgtat atgatgcgat tgtcaccatg tttcttgaag atgtcggcac gctgtttgtc 300

gttgatgacg aagcgcttct ggctggcgtg ttatccagaa aagatttatt gcgcgcaagc 360

attggcaaac aagagttaac gacgattcct gtcaatatta ttatgacaag aatgccgaat 420

gtagctgttt gttataaaga tgatccgctt attgaggtag cggagcggtt aattgaaaag 480

cagattgatg cgatgccggt agtgcggaag acagagaagg gatacgaggt cattggccga 540

ataacgaaaa caaatatgac aaaggcgttc gtcgcgctag cgaaagacga tttgttatag 600

<210> 5

<211> 960

<212> DNA

<213> 热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400> 5

atgaaacaac aaggcatgaa tcgagtagca cttataggaa cggggttcgt tggggccagc 60

tatgcatttg cccttatgaa ccaaggaata gcagatgagt tagtattgat tgatgtaaat 120

aagaataagg cagagggcga tgtgatggat ttaaatcacg gaaaagtatt cgcgccgaag 180

ccgatgaata tttggtttgg agattatcaa gattgccaag acgccgattt ggtggtgatt 240

tgtgcagggg ctaaccaaaa gccgggagaa acaagactgg atcttgttga caaaaatatt 300

aatatcttca aaacgattgt cgattctgtg atgaaatccg gatttgatgg cgtttttctt 360

gtggcaacga acccagtgga tattttaacg tatgctactt ggaaatttag cgggttaccg 420

aaagagcggg taatcggctc aggaacgatt cttgatacag caagattccg cttcttgcta 480

agtgaatatt ttcaagtggc tccgaccaat gtacatgcgt atattattgg cgagcatggg 540

gatacagagc tgcctgtttg gagccatgcg gaaattggaa gcattccagt tgagcaaata 600

ttgatgcaaa acgataacta tagaaaagag gatttagaca atatctttgt taatgttcgt 660

gatgcggcat atcaaatcat tgagaaaaaa ggggcaacgt attacggcat tgcaatggga 720

ttagtccgta tcactcgtgc tattttgcac aatgaaaatg ccatcttaac cgtttctgct 780

catttggacg gccaatatgg cgaacgaaat gtttatattg gcgtgcctgc cattatcaac 840

cgaaacggta ttcgtgaagt gatggaattg acgctaaatg aaacagaaca acaacaattc 900

catcatagtg taactgtatt aaaagacatt ctttcccgtt attttgatga tgtaaaataa 960

<210> 6

<211> 159

<212> DNA

<213> 热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)

<400> 6

ggagttaact gcctcgtcca tttttttgct taatggaggt tgtcatgaaa atgacaaaca 60

acgtccaaac aattgccata atcgtttacg catagtttcg atttcatcgc gtaaaataat 120

ttgtgaatgt attcacaata ataagaaggg agaatagtg 159

热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。