IPC分类号 : C07J63/00,C07J69/00,C07C255/31,C07C253/00,A61K31/56,A61K31/277,A61P35/00
专利摘要
一种具有抗癌活性的甘草次酸修饰物及其制备方法，涉及一种甘草次酸的结构改造技术，将甘草次酸30位羧基与氯代烷进行酯化反应后，再将A环进行改造以达到对甘草次酸的结构修饰，得到一系列甘草次酸衍生物(Ⅰ1-5，Ⅱ1-5，Ⅲ1-5，Ⅳ1-5，Ⅴ1-5)。并测定其对人体宫颈癌HeLa细胞、人肝癌HepG2细胞和人胃癌BGC-823细胞具有一定的抑制作用。其中甘草次酸衍生物的结构如下所示：。
说明书
技术领域
本发明涉及一种天然产物甘草次酸结构改造方法，尤其是涉及一类抗肿瘤活性的甘草次酸修饰物及其制备方法。
背景技术
甘草次酸（Glycyrrhetinic acid, GA) 属五环三萜类化合物，又名甘草亭酸，化学名为3β-羟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-酸，分子式为C30H46O4，白色晶体，熔点289~291℃。GA是甘草酸的苷元，它广泛分布于植物界，以游离形式或多与糖结合成苷的形式存在。研究证明，GA具有促肾上腺皮质激素(ACTH)样的生物活性，抗CCl4对肝脏的急性中毒，抗免疫抗炎等，同时还抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭，能诱导细胞凋亡，对肿瘤细胞表现出较强的细胞毒活性，甘草次酸对胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用。
甘草次酸的化学结构式：
研究表明，GA除了抑制11β-HSD2（11β-羟基类固醇脱氢酶）同工酶的活性提高氢化可的松的抗肠癌细胞增殖作用，上调细胞内游离Ca2+水平而抑制人乳腺癌细胞（MCF-7）增值和诱导凋亡外，还能阻滞细胞周期G0∕G1期，上调P21、P27蛋白表达抑制BGC823细胞增殖，，是潜在的癌症化学预防产物，具有良好的药用前景和开发价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的甘草次酸作为先导化合物，设计出一系列甘草次酸酸的衍生物。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种具有抗肿瘤活性的甘草次酸修饰物，其所述的甘草次酸修饰物包括：
一类结构式如下的甘草次衍生物
，
其中，R1为 或 或 或 ；R2为是羰基或氢；R2为甲酰氧乙酯，甲酰氧苄酯，甲酰氧乙酸乙酯，甲酰氧异丙酯，甲酰氧正丁酯，其中：
R1为 ，R2为氢时，为化合物Ⅰ： ，
其中，R3表示 -COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3 ；
R1为 ，R2为羰基时，为化合物Ⅱ： ，
其中，R3表示 -COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3；
R1为 ，R2为羰基时，为化合物Ⅲ： ，
其中，R3表示 -COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3；
R1为 ，R2为羰基时，为化合物Ⅳ: ，
其中，R3 表示-COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3 ；
R1为 ，R2为羰基时，为化合物Ⅴ： ，
其中，R3表示 -COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3。
所述的一种具有抗肿瘤活性的甘草次酸修饰物，其所述的甘草次酸修饰物具有抗肿瘤活性，可用于治疗肿瘤疾病。
一种具有抗肿瘤活性的甘草次酸修饰物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1) 甘草次酸与锌汞齐试剂反应得到11-脱氧甘草次酸；
(2)11-脱氧甘草次酸和甘草次酸分别与卤代烃进行酯化反应得到11-脱氧甘草次酸羧酸酯类化合物和甘草次酸酯类化合物；
(3)11-脱氧甘草次酸羧酸酯类化合物与甲基磺酰氯0℃反应得到3β-甲基磺氧基-齐墩果烷型-12-烯-30羧酸酯类化合物；
(4) 3β-甲基磺氧基-齐墩果烷型-12-烯-30羧酸酯类化合物与碳酸锂168℃回流齐墩果烷型-2,12-烯-30羧酸酯类化合物得到化合物Ⅰ1-5；
(5)甘草次酸羧酸酯类化合物与甲基磺酰氯0℃反应得到3β-甲基磺氧基-11-羰基齐墩果烷型-12-烯-30羧酸酯类化合物；
(6) 3β-甲基磺氧基-11-羰基齐墩果烷型-12-烯-30羧酸酯类化合物与碳酸锂168℃回流得到11-羰基齐墩果烷型-2,12-二烯-30羧酸酯类化合物Ⅱ1-5；
(7) 甘草次酸羧酸酯类化合物在氯仿中与无水CH3COONa和PCl5反应，并用NaHCO3溶液处理得到A环重排为五元环的衍生物11-氧代-A-新-齐墩果型-3,12-二烯-30-羧酸酯类化合物Ⅲ1-5；
(8) 甘草次酸羧酸酯类化合物经Jone’s试剂氧化制得3-氧代甘草次酸羧酸酯，再与盐酸羟胺在吡啶中回流生成3-肟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-羧酸酯类化合物Ⅳ1-5；
(9) 3-肟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-羧酸酯类化合物与SOCl2反应，通过贝克曼重排生成A环开环衍生物3-氰基-11-氧代-3,4-裂齐墩果型-4,12-二烯-30-羧酸酯类化合物Ⅴ1-5。
具体实施方式
下面对本发明进行详细说明：
1.甘草次酸与锌汞齐试剂反应得到11-脱氧甘草次酸，与卤代烃进行酯化反应，与甲基磺酰氯0℃反应，再在DMAC中与碳酸锂168℃回流得到化合物Ⅰ1-5。
其中：R1为 ，R2为氢，R3表示-COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3。
2. 甘草次酸与卤代烃进行酯化反应，与甲基磺酰氯0℃反应，之后在DMAC中与碳酸锂168℃回流得到化合物Ⅱ1-5。
其中：R1为 ，R2为羰基，R3表示-COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3。
3. 甘草次酸与卤代烃进行酯化反应后在氯仿中与无水CH3COONa和PCl5反应，并用NaHCO3溶液处理得到A环重排为五元环的衍生物Ⅲ1-5。
其中：R1为 ，R2为羰基，R3表示-COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3。
4. 甘草次酸与卤代烃进行酯化反应后用Jone’s试剂氧化，再与盐酸羟胺在吡啶中回流得到化合物Ⅳ1-5。
其中：R1为 ，R2为羰基，R3表示-COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3。
5. 化合物Ⅳ1-5与SOCl2反应，通过贝克曼重排生成A环开环衍生物Ⅴ1-5。
其中：R1为 ，R2为羰基，R3表示-COOC2H5，-COOBn，-COOCH2COOC2H5，-COOCH(CH3)2，-COO(CH2)3CH3。
以吉非替尼和VP-16为阳性对照物，采用MTT法对熊果酸及所合成的化合物进行初步的体外抗肿瘤活性测试。研究表明所合成的化合物对人体宫颈癌(HeLa)细胞、人肝癌细胞(HepG2)和胃癌(BGC-823)细胞具有明显的抑制作用，化合物结构及体外试验结果如表1~表3所示。
表1 目标化合物对HeLa细胞的体外抗肿瘤活性
注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率 ；b. IC50表示半数有效抑制浓度。
表2 目标化合物对HepG2细胞的体外抗肿瘤活性
注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率; b. IC50表示半数有效抑制浓度。
表3 目标化合物对BGC-823细胞的体外抗肿瘤活性
注：a.化合物浓度在10-5mol/L时测得的抑制率;b. IC50表示半数有效抑制浓度。
下面结合实例对本发明进一步说明：
实施例1
11-脱氧甘草次酸的制备
将HgCl2(0.2g)溶解于20mL3%稀盐酸中，加入锌粉(20g)，充分振摇均匀后，除去液体，固体用二氧六环充分洗涤，制备得锌汞齐试剂。将甘草次酸(110mg, 0.23mmol)溶解于8mL二氧六环中，向其加入1g上述制得的锌汞齐，室温下搅拌30分钟后滴加浓盐酸。出现大量白色泡沫后加入二氧六环直至溶液变澄清，TLC检测反应终点。反应完毕后，抽滤，得白色固体11-脱氧甘草次酸(100mg,0.22mmol)。IR(KBr): 3438, 2945, 2855, 1707, 1465, 1384, 1228, 1176, 1027, 996 cm-1。
11-脱氧甘草次酸乙酯和甘草次酸乙酯的制备
将11-脱氧甘草次酸或甘草次酸(100mg,0.21mmol)溶解于4 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入无水碳酸钾(0.06g)，缓慢滴加溴乙烷3滴(0.88mmol)，室温反应，TLC检测反应终点，减压蒸出剩余的溴乙烷后，用饱和的食盐和乙酸乙酯萃取三次，合并有机相水洗至中性后，浓缩，真空干燥，得到11-脱氧甘草次酸乙酯或甘草次酸乙酯90.6mg,产率89%。
实施例2
3β-甲基磺酰氧基-齐墩果型-12-二烯-30-羧酸乙酯的制备
将11-脱氧甘草次酸乙酯(100mg,0.21mmol)溶解于5mL二氯甲烷和1.5mL三乙胺中，冰浴下向此混合液中滴加1mL甲基磺酰氯(MSCl)，控制反应温度在0℃左右。滴加完毕后，反应化合物搅拌3小时，TLC检测反应终点。抽滤，滤液以1mol/L盐酸溶液洗涤至微酸性，再水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸，得到化合物3β-甲基磺酰氧基-齐墩果烷-12-烯-30-羧酸乙酯。IR(KBr): 3429, 2954, 1726, 1463, 1355, 1332, 1217, 1173, 1159, 1088, 942 cm-1。
齐墩果型-2,12-二烯-30-羧酸乙酯（化合物Ⅰ1）的制备
将3β-甲基磺酰氧基-齐墩果型-12-二烯-30-羧酸乙酯加入6mL N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)使其完全溶解，加入碳酸锂(70mg,0.94mmol)。反应混合液168℃回流半小时。当反应液冷却后，过滤，滤液用水和乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，1mol/L盐酸溶液洗涤至微酸性，再水洗至中性。无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏得齐墩果型-2,12-二烯-30-羧酸乙酯。粗品经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=65/1（V/V），真空干燥得白色粉末33.3mg，产率34%。mp:128.6-133.2℃. IR(KBr):3430, 2956, 1727, 1465, 1381, 1212, 1174, 1152, 1089, 1018, 727 cm-1; ESI-MS m/z: 467.4 (M+H)+,490.9[M+23]+。
实施例3
3β-羟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯
在装有磁力搅拌的25 mL茄形瓶中将甘草次酸(100mg,0.21mmol)溶解于4mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入无水碳酸钾(0.06g)，缓慢滴加溴乙烷3滴(0.88mmol)，室温反应，TLC检测反应终点，减压蒸出剩余的溴乙烷后，加入适量饱和的食盐水2mL，用乙酸乙酯每次4mL萃取3次，合并有机相水洗至中性后，浓缩，无水硫酸镁干燥，无需进一步处理可进行下一步反应，得到3β-羟基-11-羰基-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯白色固体95.4mg, 产率91%。
3β-甲基磺酰氧基-11-羰基-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯的制备
将3β-羟基-11-羰基-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯(100mg,0.20mmol)溶解于5mL二氯甲烷和1.5mL三乙胺中，冰浴下向此混合液中滴加1mL甲基磺酰氯(MSCl)。控制反应温度在0℃左右。滴加完毕后，反应化合物搅拌3小时，经TLC检测反应终点。过滤，滤液以1mol/L盐酸溶液洗涤至微酸性，再水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸,得到化合物3β-甲基磺酰氧基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸乙酯。IR(KBr): 3429, 2954, 1726, 1463, 1355, 1332, 1217, 1173, 1159, 1088, 942 cm-1。
11-羰基齐墩果型-2,12-二烯-30-羧酸乙酯(化合物Ⅱ1)的制备
将上3β-甲基磺酰氧基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸乙酯 (100mg,0.20 mmol)溶解于5mL二氯甲烷和1.5mL三乙胺中，冰浴下向此混合液中滴加1mL甲基磺酰氯(MSCl)。控制反应温度在0℃左右。滴加完毕后，反应化合物搅拌3小时，经TLC检测反应终点。过滤，滤液以1mol/L盐酸溶液洗涤至微酸性，再水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸,得到化合物3β-甲基磺酰氧基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸乙酯。IR(KBr):3417, 2957, 2927, 1717, 1651, 1359, 1175, 913cm-1; 1H-NMR (300MHz, CDCl3): 5.65 (s, 1H, H-12), 4.35~4.41 (dd, 1H, H-3), 4.13~4.18 (m, 2H, OCH2CH3), 3.02 (s, 3H, CH3S), 2.85~2.90 (dd, 1H, H-1), 2.34 (s, 1H, H-9), 1.24~1.36 (s, 9H, 3×CH3), 1.16 (s, 3H, CH3), 1.14 (s, 3H, CH3), 1.12 (s, 3H, CH3), 0.89 (s, 3H, CH3), 0.80(s, 3H, CH3)。
实施例4
11-氧代-A-新-齐墩果型-3,12-二烯-30-羧酸乙酯(化合物Ⅲ1)的制备将甘草次酸乙酯溶解于6mL氯仿中，控制反应温度在4℃左右，加入(63mg,0.77mmol)无水醋酸钠搅拌15分钟，之后加入(62mg,0.3mmol)五氯化磷，TLC检测反应终点。用5mL 3.3%的碳酸氢钠溶液处理并搅拌3小时，分离氯仿层，水洗至中性，无水硫酸镁干燥。过滤，减压蒸馏得11-氧代-A-新-齐墩果型-3,12-二烯-30-羧酸乙酯。粗品经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=20/1(V/V)，得白色无定形固体32.15mg，产率31.8%。mp: 209.3-210.7℃,IR (KBr): 3420, 2872, 1721, 1650, 1456, 1386, 1217, 1156cm-1; 1H-NMR (300MHz, CDCl3): δ7.27 (s, 2H, OCH2), δ5.71 (s, 1H, 12-H), 4.13~4.20 (m, 2H, OCH2CH3), δ2.78 (t, 1H, 1β-H), δ2.36(s, 1H, 9α-H), δ2.20 (t, 1H, 18β-H), δ1.76 (s, 3H, =CCH3),δ1.61 (s, 3H, =CCH3), δ1.16 (s, 3H, CH3), δ1.15 (s, 3H, CH3), δ1.13 (s, 3H, CH3), δ0.89 (s, 3H, CH3), δ0.82 (s, 3H, CH3). ESI-MS: 481.5[M+1]+。
实施例5
3-肟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯(化合物Ⅳ1)的制备
将甘草次酸乙酯溶于4mL丙酮中，冰浴下逐滴加入0.4mL新制Jone’s试剂，TLC检测反应终点，加入4mL异丙醇搅拌30分钟，过滤残渣，滤液浓缩用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸镁干燥。过滤，减压蒸馏，真空干燥得粗品。将其溶解于4mL吡啶中，加入(200mg,2.88mmol)盐酸羟胺回流3小时，冷却至室温并加入冷水使其充分沉淀，抽滤，水洗滤饼至中性，真空干燥得白色粉末(3-肟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯)。粗品经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=8/1(V/V)，得白色固体45.43mg，产率42.3%。mp:226.9-231.5℃,IR(KBr): 445, 2927, 2858, 1727, 1657, 1458, 1386, 1216, 1153, 1088, 922cm-1; ESI-MS:534.0 [M+23]+。
实施例6
3-腈基-11-氧代-3,4-断-齐墩果型-4,12-二烯-30-羧酸乙酯(化合物Ⅴ1)的制备
将3-肟基-11-氧代-齐墩果型-12-烯-30-羧酸乙酯溶于8mL二氧六环，滴加0.8mL氯化亚砜，控制反应温度在10℃左右，搅拌20分钟后，加入冷的1%KOH使其完全沉淀，抽滤，水洗滤饼至中性，真空干燥得浅黄色粉末(3-腈基-11-氧代-3,4-断-齐墩果型-4,12-二烯-30-羧酸乙酯)。粗品经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=10/1(V/V)，得白色固体54mg，产率25.1%。mp: 180.7-182.7℃,IR (KBr): 3433, 2960, 2927, 2869, 2245, 1725, 1649, 1455, 1387, 1217, 1174, 1088, 1031, 898cm-1; 1H-NMR(300MHz, CDCl3): 0.82 (s, 3H, CH3-28), 1.15 (s, 3H, CH3-28), 1.27 (s, 3H, CH3-26), 1.40 (s, 3H, CH3-25), 1.76, 1.58 (CH3-29, CH3-23), 1.97~2.18 (m, CH, CH2), 4.13~4.19 (m, 2H, COOCH2CH3), 4.93 (s, 1H, H-12), 5.70 (s, 2H, =CH2-24). ESI-MS:516.0[M+23]+。
一种具有抗肿瘤活性的甘草次酸修饰物及其制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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