专利摘要
本发明公开一类半菁类荧光染料，具有通式I的结构。通式I中，R1选自H、C1‑6烷基、苯基、C1‑6烷基任意取代的苯基、SO3R5和COOR5；所述的R5选自H和C1‑6烷基；R2选自H、C1‑6烷基、SO3R6和COOR6；所述的R6选自H和C1‑6烷基；R3和R4各自独立地选自H和C1‑6烷基；Y‑为Cl‑、Br‑或者I‑。本发明所述的半菁类荧光染料对人血清白蛋白具有良好的响应速度、可逆的热稳定性、优异的选择性和近红外的发射波长，并且能达到1.73mg/L的最低检测限。本发明的荧光染料可应用到人尿中血清白蛋白的检测和活细胞共聚焦荧光成像。
权利要求
1.半菁类荧光染料在制备白蛋白识别和检测试剂中的应用，所述的半菁类荧光染料，具有通式I的结构：
通式I中，
R
R
R
Y
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的R
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的R
4.根据权利要求1所述的应用，所述的半菁类荧光染料选自以下化合物：
说明书
技术领域
本发明属精细化工领域，涉及一类适用于生物样品中血清白蛋白检测的荧光染料及其在细胞成像中的应用。
背景技术
人血清白蛋白(Human Serum Albumin，简称HSA)是人血浆中重要的蛋白质，约占血浆总蛋白的60％。在生物体系中，体液中人血清白蛋白不仅起着维持血液正常渗透压作用，而且还承担着类固醇激素、胆色素、药物分子和代谢产物等运输功能。此外，血浆中人血清白蛋白含量的异常与一些疾病密切相关，例如肝炎、肝硬化和肾脏病等。
在医学上人血清白蛋白可用于治疗烧伤与休克，用于补充因手术、意外事故或者大出血所致的血液丢失，也可作为血浆的增容剂。对于健康人群，血清白蛋白在血清中的含量为35～50g/L，在尿中的含量低于30mg/L。在临床上，血清白蛋白含量被认为是一个关于肝脏和肾脏的生物功能以及相关疾病可靠的指标。例如，通过检测离体尿液样本，测得尿液样本中有过量的血清白蛋白，可用于肾功能损伤的辅助诊断，起到早期预警的作用。
荧光探针具有灵敏度高、选择性好、实时原位、检测限低和可视化检测等优点，并且还能克服传统方法中存在的样品预处理过程复杂、仪器价格昂贵、无法实时分析等缺点，因此在生物检测领域引起广泛的关注。然而到目前为止，尽管有一些针对人血清白蛋白的荧光探针已被报道，但是由于其检测限低(>30mg/L)、稳定性差和发射波长短(<600nm)，大多数探针都很难在复杂的生物样品中检测微量的人血清白蛋白。因此，开发对人血清白蛋白性能优良的小分子荧光探针具有重要的意义。
发明内容
本发明首先提供一种半菁类荧光染料，具有通式I的结构：
通式I中，
R1选自H、C1-6烷基、苯基、C1-6烷基任意取代的苯基、SO3R5和COOR5；所述的R5选自H和C1-6烷基；
R2选自H、C1-6烷基、SO3R6和COOR6；所述的R6选自H和C1-6烷基；
R3和R4各自独立地选自H和C1-6烷基；
Y
另一方面，本发明提供上述半菁类荧光染料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)化合物1和化合物2按照摩尔比1:1.2～1.5反应制备化合物3；
(2)化合物3和化合物4按照摩尔比1:1.0～1.2反应制备通式I的化合物，
本发明的上述半菁类荧光染料是本发明的发明人利用结构中存在多个扭曲位点的半菁染料为开发平台，基于扭曲分子内电荷转移(Twisted Intramolecular ChargeTransfer,简称TICT)机理设计合成的一类可与人血清白蛋白疏水空腔结合的增强型的荧光探针。该类荧光探针对人血清白蛋白具有良好的响应速度(5s)、可逆的热稳定性(5～60℃)、优异的选择性和近红外的发射波长(>680nm)，并且能达到1.73mg/L的最低检测限。并且还能应用到活细胞共聚焦荧光成像。
基于此，本发明提供上述本发明的半菁类荧光染料在白蛋白识别和检测中的应用。
具体地，本发明提供上述本发明的半菁类荧光染料在制备白蛋白识别和检测试剂中的应用。进一步，本发明的目的也在于提供一种白蛋白检测试剂，含有上述本发明的半菁类荧光染料。所述的白蛋白检测试剂中含有有效剂量的本发明所述的半菁类荧光染料。可用于实验室或临床生物样品中人血清白蛋白的检测。所述的生物样品可举例但不限于离体尿样。
附图说明
本发明附图25幅，如下所示：
图1是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入100μMHSA激发光谱与发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为归一化强度。激发光波长为580nm。
图2是本发明的10μM探针NIR-HSA在不同溶剂的荧光发射谱图(图2a)和相应在不同溶剂的吸光度(图2b)。横坐标为波长(nm)，激发光波长为580nm。
图3是本发明的10μM探针NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入20μMHSA搅拌后，扫描结合后的紫外可见吸收光谱(图3)。横坐标为波长(nm),纵坐标为吸光度。
图4是本发明的10μM探针NIR-HSA在不同的甘油/PBS(v/v)混合溶液体系中荧光发射图谱(图4)。激发光波长为580nm。
图5是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、70.0、90.0、95.0、100.0、105.0、110.0μM的HSA荧光强度的变化。横坐标为波长(nm)，激发光波长为580nm。
图6是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、70.0、90.0、95.0、100.0、105.0、110.0μM的HSA紫外吸收的变化。横坐标为波长(nm)。
图7是本发明的10μM探针NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0μM的HSA荧光强度的变化。横坐标为波长(nm)，激发光波长为580nm。
图8是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，提取荧光强度在F680nm随着不同HSA加入量的变化图。横坐标为不同HSA加入量(μM)，激发光波长为580nm。
图9是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μM的HSA荧光强度的变化。激发光波长为580nm，纵坐标为荧光强度。
图10本发明的10μM探针NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μM的HSA荧光强度的变化。激发光波长为580nm，纵坐标为荧光强度。
图11是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中时间稳定性,每隔5min扫描一次荧光强度。横坐标为不同的时间(min)，激发光波长为580nm。
图12是本发明的探针NIR-HSA的Job，s Plot曲线。[染料+HSA]＝10μM,横坐标[染料]/([染料+HSA])分别从0.1到1.0作图，激发光波长为580nm。
图13是本发明的5μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，加入50μM的HSA响应时间后在0～400s内每隔1s扫面一下荧光强度。激发光波长为580nm。
图14是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别加入1mM钠离子(2)、1mM镁离子(3)、1mM钙离子(4)、1mM锌离子(5)、1mM钾离子(6)、1mM铅离子(7)、1mM锰离子(8)、1mM铵根离子(9)、1mM镍离子(10)、100μM HSA(11)时F680nm处的荧光强度的变化。其中1为空白对照，激发光波长为580nm。
图15是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别加入1mM氟离子(2)、1mM氯离子(3)、1mM溴离子(4)、1mM碘离子(5)、1mM硝酸根离子(6)、1mM亚硝酸根离子(7)、1mM高氯酸根离子(8)、1mM硫酸根(9)、1mM硫氰酸根离子(10)、1mM醋酸根(11)、1mM磷酸氢根离子(12)、1mM碳酸根离子(13)、1mM碳酸氢根(14)、100μMHSA(15)时F680nm处的荧光强度的变化。其中1为空白对照，激发光波长为580nm。
图16是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别加入50μM组氨酸(2)、50μM甘氨酸(3)、50μM色氨酸(4)、50μM苯丙氨酸(5)、50μM丝氨酸(6)、50μM天冬酰胺(7)、50μM谷氨酰胺(8)、50μM天门冬氨酸(9)、50μM半胱氨酸(10)、100μMHSA(11)时F680nm处的荧光强度的变化。其中1为空白对照，激发光波长为580nm。
图17是本发明的10μM探针NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别加入1mM钠离子(2)、1mM镁离子(3)、1mM钙离子(4)、1mM锌离子(5)、1mM钾离子(6)、1mM铅离子(7)、1mM锰离子(8)、1mM铵根离子(9)、1mM镍离子(10)、100μM HSA(11)时F680nm处的荧光强度的变化。其中1为空白对照，激发光波长为580nm。
图18是本发明的10μM探针NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别加入1mM氟离子(2)、1mM氯离子(3)、1mM溴离子(4)、1mM碘离子(5)、1mM硝酸根离子(6)、1mM亚硝酸根离子(7)、1mM高氯酸根离子(8)、1mM硫酸根(9)、1mM硫氰酸根离子(10)、1mM醋酸根(11)、1mM磷酸氢根离子(12)、1mM碳酸根离子(13)、1mM碳酸氢根(14)、100μMHSA(15)时F680nm处的荧光强度的变化。其中1为空白对照，激发光波长为580nm。
图19是本发明的10μM探针NIR-HSA-2在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，分别加入50μM组氨酸(2)、50μM甘氨酸(3)、50μM色氨酸(4)、50μM苯丙氨酸(5)、50μM丝氨酸(6)、50μM天冬酰胺(7)、50μM谷氨酰胺(8)、50μM天门冬氨酸(9)、50μM半胱氨酸(10)、100μMHSA(11)时F680nm处的荧光强度的变化。其中1为空白对照，激发光波长为580nm。
图20是本发明的5μM探针NIR-HSA以及5μM探针NIR-HSA加入15μM HSA在pH值为4、5、6、7、7.4、8、9时F680nm荧光强度。激发光波长为580nm。
图21是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中，在不同温度下的荧光强度。图21a是温度从5℃～60℃的荧光图谱；图21b是60℃～5℃的荧光图谱。激发光波长为580nm。
图22是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中热稳定性。图22a是温度在60℃的环境下，每隔5min扫描一下荧光光谱；图22b为提取F697nm处的荧光强度，横坐标为时间(min)，激发光波长为580nm。
图23是本发明的10μM探针NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)缓冲溶液中5℃的荧光强度。1为5℃加热到60℃过程中取5℃的荧光强度；2为60℃加热到5℃过程中取5℃的荧光强度；3为在60℃环境下持续2h后降温到5℃的荧光强度，激发光波长为580nm。
图24是本发明探针NIR-HSA的细胞成像实验。用10μM探针NIR-HSA和100μMHSA混合无血清培养基孵育正常肝细胞HL-7702一个小时后，然后进行细胞成像(d-f)。a-c为无血清培养基培养的细胞成像。a、b两图为HL-7702细胞成像，a、d为荧光图，b、e为明场图。c、f为相应的叠加图细胞成像。
图25是本发明探针在检测人尿样中血清白蛋白测试。
具体实施方式
本发明所述的半菁类荧光染料，具有通式I的结构：
通式I中，
所述R1选自H、C1-6烷基、苯基、C1-6烷基任意取代的苯基、SO3R5和COOR5；所述的R5选自H和C1-6烷基；优选所述的R1选自H、C1-6烷基、苯基和C1-6烷基任意取代的苯基；更为优选地，所述的R1选自H、苯基和C1-4烷基；最为优选地，所述的R1是甲基或苯基。
所述R2选自H、C1-6烷基、SO3R6和COOR6；所述的R6选自H和C1-6烷基；优选所述的R2选自H和C1-6烷基。
所述R3选自H和C1-6烷基，优选C1-4烷基；
所述R4选自H和C1-6烷基，优选C1-4烷基；
Y
更为具体的实施方式中，所述的半菁类荧光染料选自以下化合物：
另一方面，本发明提供所述半菁类荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
(1)化合物1和化合物2按照摩尔比1:1.2～1.5反应制备化合物3；
(2)化合物3和化合物4按照摩尔比1:1.0～1.2反应制备通式I的化合物：
具体实施方式中，所述的半菁类荧光染料的制备方法包括如下步骤：
(1)以乙腈为反应溶剂，化合物1和化合物2按照摩尔比1:1.2～1.5回流反应，薄板层析色谱(TCL)监测反应进行程度，完全反应后体系冷却到室温；待固体完全沉淀后，真空抽滤，所得的固体用乙醚洗涤，最后将得到的固体产物放在真空干燥箱过夜干燥，即得到化合物3；
针对易挥发的化合物2，该反应过程中优选在N2气体保护下进行；
(2)以乙酸酐为溶剂，化合物3和化合物4按照摩尔比1:1.0～1.2，在N2保护下回流反应，薄板层析色谱(TCL)监测反应进行程度，完全反应后体系冷却到室温，加入冰水淬灭反应；乙酸乙酯萃取三次，然后用卤水洗涤有机相三次，无水硫酸钠干燥过夜，减压抽滤，旋蒸；经柱分离技术纯化得到通式I的化合物。
下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更加全面地理解本发明的内容，但不加以任何方式限制本发明。
实施例1
化合物NIR-HSA的合成
化合物NIR-HSA的合成步骤如下：
(1)化合物3的合成
将2-甲基苯并噻唑(0.50g，3.93mM)、碘乙烷(0.62g，4mM)溶于15ml乙腈中，在N2惰性气体保护下，回流8h。待反应体系冷却到室温后，加入20ml的乙醚，反应体系有大量的固体沉淀析出。然后，减压抽滤，用5ml的乙醚洗涤三次后，放在真空干燥箱过夜干燥。得到0.84g的化合物3，产率70％。
(2)化合物NIR-HSA的合成
将化合物3(0.31g，1mM)、4-二甲氨基肉桂醛(0.18，1mM)溶于10ml乙酸酐中，加热回流30min后，待反应体系冷却到室温，加入15ml蒸馏水淬灭反应。然后，用20ml的乙酸乙酯萃取三次，然后加入无水硫酸钠过夜干燥。减压抽滤，旋转蒸发仪蒸发后用硅胶柱分离提纯得到蓝绿色固体0.30g，产率65％。洗脱剂的极性：二氯甲烷/甲醇从100/1-50/1梯度淋洗。化合物的结构经过核磁和高分辨质谱表征。
HRMS-ESI:m/z理论值：C21H23N2S
实施例2
化合物NIR-HAS-2的合成
化合物NIR-HAS-2的合成步骤如下：
(1)化合物6的合成
将2-甲基苯并噻唑(0.50g，3.93mM)、溴化苄(0.68g，4mM)溶于15ml甲苯中，在N2惰性气体保护下，回流8h。待反应体系冷却到室温后，加入20ml的乙醚，反应体系有大量的固体沉淀析出。然后，减压抽滤，用5ml的乙醚洗涤三次后，放在真空干燥箱过夜干燥。得到0.81g的化合物6，产率65％。
将化合物6(0.32g，1mM)、4-二甲氨基肉桂醛(0.18，1mM)溶于10ml乙酸酐中，加热回流30min后，待反应体系冷却到室温，加入15ml蒸馏水淬灭反应。然后，用20ml的乙酸乙酯萃取三次，然后加入无水硫酸钠过夜干燥。减压抽滤，旋转蒸发仪蒸发后用硅胶柱分离提纯得到蓝绿色固体0.30g，产率65％。洗脱剂的极性：二氯甲烷/甲醇从100/1～50/1梯度淋洗。化合物的结构经过核磁和高分辨质谱表征。
HRMS-ESI:m/z理论值：C21H23N2S
实施例3
化合物NIR-HSA在PBS(10mM pH 7.4)结合HSA后激发光谱与发射光谱归一化实验：使用实例1合成的探针NIR-HSA先用二甲基亚砜溶剂在容量瓶中配成母液。然后用微量进样器取样，用PBS(10mMpH 7.4)将荧光探针NIR-HSA母液的浓度稀释到10μM，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。随后加入50μM的HSA混合均匀，改变不同的激发波长，从520～600nm每间隔10nm，扫描一次荧光光谱。然后选定最大的荧光发射波长，反扫描染料的激发波长，归一化处理的染料激发光谱与发射光谱见图1。左曲线为激发光谱，右曲线为发射光谱。
所用仪器为安捷伦荧光分光光度计(型号：G9800A，编号MY15210003)。
实施例4
探针NIR-HSA在不同溶剂的荧光发射与紫外可见吸收光谱实验：
用微量进样器从探针NIR-HSA母液中取样，分别加入到1,4-二氧六环、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺和PBS(10mMpH 7.4)，最终稀释成10μM NIR-HSA溶液,用580nm作为激发波长，测试结果如图2a所示。从测试的结果分析发现该探针分子对溶液的极性较为敏感，在二氯甲烷中荧光最强，相反在PBS(10mM pH 7.4)最弱。通过测试该化合物在不同溶剂的紫外可见吸收谱图，结果发现10μM NIR-HSA探针在二氯甲烷中出现红移，并且吸收强度最高；在PBS(10mM pH 7.4)出现蓝移，并且吸收强度最低。除此之外，在其他的溶剂中紫外可见吸收图谱相似。
所用仪器为安捷伦紫外可见分光光度计(型号：G6860A，编号MY1523004)和安捷伦荧光分光光度计(型号：G9800A，编号MY15210003)。
实施例5
探针NIR-HSA-2与HSA结合后紫外吸收光谱实验：
使用实例2合成的探针NIR-HSA-2先用二甲基亚砜溶剂在容量瓶中配成母液。然后用微量进样器取样，用PBS(10mM pH 7.4)将荧光探针NIR-HSA母液的浓度稀释到10μM，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。随后加入20μM的HSA混合均匀，用紫外可见分光光度计测试探针NIR-HSA-2与HSA空腔结合后紫外吸收光谱。经过测试发现最大吸收峰大约在575nm附近(图3)。
实施例6
探针NIR-HSA粘度实验：
用注射器分别量取甘油与PBS(10mM,pH 7.4)的体积，分别配制的甘油/PBS(10mMpH 7.4)(v/v)体积比0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1、10/0的混合溶液待用。然后用微量进样器从母液中取探针NIR-HSA加入上述配制好的混合液，最终配制的探针的浓度为10μM。超声10分钟，除掉其中的气泡后静置,在荧光分光光度计上测量其发射光谱。如图4是测试的荧光光谱结果，不难发现随着甘油的比重增加，探针NIR-HSA的荧光强度增大。可能是因为随着溶液体系的粘度增大，探针分子存在的扭转得以抑制。激发态的能量从以扭转热辐射形式耗散转变到以荧光形式释放。
实施例7
探针化合物NIR-HSA对HSA的浓度滴定荧光光谱实验：
用微量进样器从母液中取样，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入量小于总体积的千分之一。依次加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、70.0、90.0、95.0、100.0、105.0、110.0μM的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再检测其荧光变化情况。测试结果如图5所示，随着HSA的加入量越多，其荧光强度不断的增加，在强度增加的同时，发射波长稍有蓝移现象，蓝移了20nm左右。
实施例8
探针化合物NIR-HSA对HSA的浓度滴定紫外可见光谱实验：
用微量进样器从母液中取样，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入量小于总体积的千分之一。依次加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、70.0、90.0、95.0、100.0、105.0、110.0μM的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再检测紫外可见光谱变化情况。测试结果如图6所示，随着HSA的加入量越多，在512nm处的紫外可见光谱吸收强度下降，在下降的同时，稍有红移现象，红移13nm左右。
实施例9
探针化合物NIR-HSA-2对HSA的浓度滴定荧光光谱实验：
用微量进样器从探针NIR-HSA-2母液中取样，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入量小于总体积的千分之一。依次加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0μM的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再检测其荧光变化情况。测试结果如图7所示，随着HSA的加入量越多，其荧光强度不断的增加。
实施例10
探针化合物NIR-HSA对HSA的浓度滴定饱和性实验：
具体实验操作在实例6的基础上，提取在680nm处的荧光强度随着HSA加入量作图，如图8所示，随着HSA的加入量越大，F680nm荧光强度越大，大约待其加入量达到100μM时，荧光强度达到最大值。
实施例11
探针化合物NIR-HSA对HSA的检测限实验：
微量进样器从探针NIR-HSA母液中取样，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入量小于总体积的千分之一。依次加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μM的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再检测荧光光谱变化情况。然后取700nm处的荧光强度如图9所示，随着HSA加入量越大，荧光强度增加量呈线性关系。将荧光强度与HSA浓度可做一条直线，线性系数R
实施例12
探针化合物NIR-HSA-2对HSA的检测限实验：
微量进样器从探针NIR-HSA-2母液中取样，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入量小于总体积的千分之一。依次加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μM的HSA溶液。每加入一次HSA需等待10s以上再检测荧光光谱变化情况。然后取700nm处的荧光强度如图10所示，随着HSA加入量越大，荧光强度增加量呈线性关系。将荧光强度与HSA浓度可做一条直线，线性系数R
实施例13
探针化合物NIR-HSA溶液稳定性实验：
将探针分子NIR-HSA的母液稀释到10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。用荧光分光光度计每隔5min扫描一次荧光光谱，共扫描70min，提取其在700nm处的荧光强度，绘制随着时间变化的散点图，如图11下排点所示。然后加入100μM的HSA混合均匀，同样用荧光分光光度计每隔5min扫描一次荧光光谱，提取其在680nm处的荧光强度绘制随着时间变化的散点图，如图11上排点所示。
实施例14
探针化合物NIR-HSA与HSA配位比实验：
将探针分子NIR-HSA的母液和HSA母液在PBS(10mM pH 7.4)溶液按照[染料]/([染料]+[HSA])＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0的比值关系进行配制，其中[染料]+[HSA]＝10μM，然后用荧光分光光度计分别扫描上述不同混合体系的荧光光谱，提取680nm处的荧光强度与[染料]/([染料]+[HSA])比值作图，如图12所示[染料]/([染料]+[HSA])＝0.5时两条拟合直线交汇，可以测出NIR-HSA与HSA配位比为1：1。
实施例15
探针化合物NIR-HSA与HSA响应时间实验：
将探针分子NIR-HSA的母液稀释到5μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后用荧光分光光度计进行时间扫描荧光强度，每隔1s扫描一次，共扫描400s。在35s时加入50μM的HSA，继续用荧光分光光度计进行时间扫描，最终得到680nm处的荧光强度与时间做一条曲线，得图13。从图中可以看出，加入HSA后荧光立刻有增强的趋势，5s后荧光强度可达到最大。由此说明了探针NIR-HSA对体外的HSA的迅速响应。
实施例16
探针化合物NIR-HSA阳离子选择性实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入100μMHSA,1mM钠离子、镁离子、钙离子、锌离子、钾离子、铅离子、锰离子、铵根离子、镍离子。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。测试结果如图14，从结果可以看出，该探针对其他阳离子离子基本没有响应，而对HSA的响应较强。
实施例17
探针化合物NIR-HSA阴离子选择性实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入100μM HSA,1mM氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、高氯酸根离子、硫酸根、硫氰酸根离子、醋酸根、磷酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。测试结果如图15，从结果可以看出，该探针对其他阴离子离子基本没有响应，而对HSA的响应较强。
实施例18
探针化合物NIR-HSA氨基酸选择性实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入100μM HSA,50μM组氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、醋酸根、磷酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。测试结果如图16，从结果可以看出，该探针对其他阴离子离子基本没有响应，而对HSA的响应较强，说明了探针NIR-HSA对HSA离子具有很好的选择性。
实施例19
探针化合物NIR-HSA-2阳离子选择性实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA-2母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入20μM HSA,1mM钠离子、镁离子、钙离子、锌离子、钾离子、铅离子、锰离子、铵根离子、镍离子。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。测试结果如图17，从结果可以看出，该探针NIR-HSA-2对其他阳离子离子基本没有响应，而对HSA的响应较强。
实施例20
探针化合物NIR-HSA-2阴离子选择性实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入20μM HSA,1mM氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、高氯酸根离子、硫酸根、硫氰酸根离子、醋酸根、磷酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。测试结果如图18，从结果可以看出，该探针NIR-HSA-2对其他阴离子离子基本没有响应，而对HSA的响应较强。
实施例21
探针化合物NIR-HSA-2氨基酸选择性实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。然后分别加入20μM HSA,50μM组氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、醋酸根、磷酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。测试结果如图19，从结果可以看出，该探针对其他阴离子离子基本没有响应，而对HSA的响应较强，说明了探针NIR-HSA-2对HSA离子具有很好的选择性。
实施例22
探针化合物NIR-HSA在不同pH值影响实验:
用盐酸与氢氧化钠来调节pH值，配制成pH＝4、5、6、7、7.4、8、9缓冲溶液。然后用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，分别稀释成5μM的溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。如图20(左半边)，表明荧光强度基本不受pH值影响。随后加入15μM的HAS，混合均与，静置1分钟后扫描荧光光谱，提取其680nm处的荧光强度做柱状图。如图20(右半边)，在生理pH值时，得到较为理想的荧光强度。
实施例23
探针化合物NIR-HSA在变温过程实验:
用微量进样器取配制的探针NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。调节荧光分光光度计的恒温控制装置，分别设置5、10、15、20、25、30、35、40、50、60℃温度梯度。在相应温度下，静置5min以达到体系稳定。然后用荧光分光光度计扫描荧光光谱，如图21a，表明随着温度的升高，对应的荧光强度降低。反过来，来探究升温后的可逆性，从上述的60℃采取梯度降温的方式来探究温度对探针的影响。具体的温度设置为60、50、40、35、30、25、20、15、10、5℃，静置5min以达到体系稳定。然后用荧光分光光度计扫描荧光光谱，如图21b，表明随着温度的降低，对应的荧光强度增大。
实施例24
探针化合物NIR-HSA在高温环境下稳定性实验
用微量进样器取配制的探针NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的PBS(10mM pH 7.4)溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。调节荧光分光光度计的恒温控制装置，设置成60℃，放入样品槽，静置5min以达到体系温度稳定，然后用荧光分光光度计每隔5min扫描一次荧光光谱，共扫描120min,测试结果如图22a。提取700nm处的荧光强度与时间作图，如图22b，表明探针NIR-HSA在高温下具有良好的热稳定性。待2h后，调节恒温控制装置，设置温度为5℃，待温度达到之后继续静置5min以达到体系温度稳定，然后用荧光分光光度计扫描荧光光谱，取700nm处的荧光强度与实例17两个过程中探针NIR-HSA在5℃的700nm荧光强度值作图，如图23，表明探针NIR-HSA在高温下2h后结构没有被破坏，仍具有温度的可逆性。
实施例25
探针NIR-HSA的活细胞实验：
用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，用无血清培养基稀释成10μM NIR-HSA和100μMHSA混合溶液培养，在37℃，5％CO2下孵育正常肝细胞HL-7702一个小时，然后使用激光共聚焦进行细胞成像实验。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次。激发波长：559nm，接收波段为：600到700nm。成像结果如图24，a、d两图为HL-7702细胞成像的荧光图，b、e为明场图，c、f为两个通道的叠加图。其中a-c为无血清培养基培养的肝细胞HL-7702空白对照。荧光图显示了探针NIR-HSA结合HSA复合物很容易进入细胞，并且可用于活细胞荧光成像。
实施例26
探针NIR-HSA在人尿样中的实验：
收集男性志愿者的新鲜尿液，用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的尿液溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。其中尿液中的尿微量白蛋白的含量在大连医科大学附属二院进行测试，测试结果是0.41μM(27mg/L)。分别再往稀释成10μM的尿液溶液加入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、21、26、31、36、41、51、61、71、81、91、101μMHSA，混合均匀，静置2min以达到体系温度稳定，然后用荧光分光光度计扫描其荧光光谱。如图25测试结果所示，随着人血清白蛋白的增加，荧光强度随着增强。取700nm处的荧光强度与浓度拟合一条直线，线性良好的关系R
为了考察探针NIR-HSA在尿液检测人血清白蛋白的准确性，还进行了以下实验测试。用微量进样器取配制的NIR-HSA母液少许，稀释成10μM的上述尿液溶液，并确保二甲基亚砜的加入体积小于总体积的千分之一。分别加入20μM、30μM人血清白蛋白，混合均匀，静置2min以达到体系温度稳定，然后用荧光分光光度计扫描其荧光光谱，每个浓度的样品测试三次。取700nm处的荧光荧光强度，用拟合的直线关系方程式y＝2.13x+36.89，计算出其中的浓度分别为22.00±0.22μM、32.61±0.03μM，加标回收率分别为108.79％、107.23％，相对应的相对标准偏差分别为1.00％、0.09％。探针NIR-HSA可以准确检测人尿中的血清白蛋白的含量，有实际的应用价值。
半菁类荧光染料专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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