专利摘要

本发明涉及一种细菌纤维素薄膜的液体培养基的制备方法。首先进行大米糖化醪液和丢糟降解液的预制备，混合后成细菌纤维素薄膜的液体培养基，其特征是将大米清洗后清水浸泡、沥干、蒸饭，加入根霉米粉倒入酒缸内进行搭窝糖化，冲入热水养醅后得大米糖化醪液备用；在丢糟中加入热水和复合酶进行酶解，得到丢糟降解液备用；将丢糟降解液和大米糖化醪液按1：1.5～3的重量份比例混合，离心并回收清液，进行pH值、糖度调整制成本发明所述的细菌纤维素薄膜液体培养基。本发明制备的液体培养基，与现有常用HS培养基相比，培养基原料成本低，营养成分丰富，膜片厚度为＞10mm，得率提高到7.2～7.8g/L，发酵周期时间缩短1.5～3d。

权利要求

1.一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法，首先利用大米进行大米糖化醪液的预制备，再进行丢糟降解液的预制备，混合后制备成细菌纤维素薄膜的液体培养基，其特征在于：

所述的大米糖化醪液的预制备，其过程是：

（1）蒸饭：将大米清洗后清水浸泡、沥干，倒入立式蒸饭机连续蒸饭，饭粒熟透；

（2）淋饭搭窝：常温下将熟透饭粒与根霉米粉拌匀成混合料，倒入酒缸内，压平实，中间挖个井状窝进行搭窝糖化；

（3）经过搭窝糖化60～72 h后，井状窝中出现少量糖化液，此时冲入90～100℃热水以减缓糖化速率，搅拌均匀进行养醅，养醅2～3 d后得大米糖化醪液备用；

所述的丢糟降解液的预制备，其过程是：

在丢糟中加入 50℃热水和复合酶，搅拌混合进行6 h酶解，得到丢糟降解液备用；

所述的细菌纤维素薄膜液体培养基的制备，其过程是：

（1）将丢糟降解液和大米糖化醪液按1：1.5～3的重量份比例混合，混合后以4000r/min进行离心，回收清液；

（2）测定清液糖度并进行调整糖度至12°Brix；

（3）同时采用1mol/L柠檬酸溶液调节清液的pH值至3.0～4.5，即制成本发明所述的细菌纤维素薄膜液体培养基。

2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法，其特征在于所述的丢糟降解液酶解，酶解条件为：品温45～52℃，pH6.0。

3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法，其特征在于所述的丢糟中加入热水和复合酶，是按一下比例加入的：100重量份丢糟加30～40重量份热水，100重量份丢糟加0.75重量份的复合酶。

4.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法，其特征在于所述的复合酶，其组份为：葡聚糖酶40％，由枯草杆菌制备的蛋白酶40％、纤维素酶20％。

5.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法，其特征在于所述的淋饭搭窝中，熟透饭粒与根霉米粉混合料是按100重量份的大米拌入8～12重量份根霉米粉；倒入酒缸内的混合料占酒缸容量的55～65%。

6.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法，其特征在于所述的淋饭搭窝糖化后冲入热水的量是大米重量的1.5～1.8倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵技术领域，具体涉及一种细菌纤维素薄膜的液体培养基的制备方法。

背景技术

由微生物合成的细菌纤维素，它具有良好的生物适应性，韧性强度和水合度，是许多植物纤维素无法比拟的优良性能。目前，生产细菌纤维素的制造成本过高和应用领域较窄，限制了细菌纤维素的有效应用和产业发展。除了产细菌纤维素优良菌株外，生产细菌纤维素需要适合发酵条件的培养基，而培养基的组成对细菌纤维素产量和经济性有很大关系的影响。细菌纤维素培养基所需要的碳源如葡萄糖、氮源如酵母膏等的成本比较高，制约了细菌纤维素的规模化生产与应用。因此，要想获得大量细菌纤维素和广泛普及使用优良的纳米纤维材料—细菌纤维素，首先降低制造成本，增加产率。

丢糟又称丢料糟，也就是固态酿造大曲白酒完成之后必须丢掉或者进行其他处理，不能重新酿酒利用的料糟。由于丢糟酸度大，水分含量65%%以上，难于加工处理，酒厂一般都没有有效利用而直接放弃既没有经济效益又带来环境污染。干燥的丢糟中除淀粉含量低于玉米外，其它成分，如粗蛋白、粗脂肪、粗纤维均高于玉米，从能量来讲，丢糟几乎与玉米相等，且含有少量的乙醇、丰富的氨基酸、维生素等发酵产物，因而具有一定的开发价值。

发明内容

本发明利用大米和白酒企业大量丢弃的丢糟，分别经过糖化和降解，混合后制备成细菌纤维素薄膜的液体培养基，利用该培养基制备细菌纤维素薄膜。

为实现本发明的目的而采用技术方案如下：

1、大米糖化醪液的预制备

（1）蒸饭：将大米清洗后清水浸泡6~10h，将水沥干，倒入立式蒸饭机连续蒸饭，饭粒熟透。

（2）淋饭搭窝：常温下将熟透饭粒与根霉米粉拌匀成混合料，倒入酒缸内，压平实，中间挖个井状窝进行搭窝糖化。100重量份的大米拌入8~12重量份根霉米粉。倒入酒缸内的混合料占酒缸容量的55~65%。室温低于20℃，需要盖麻袋保温。

（3）经过搭窝糖化60～72 h后，井状窝中出现少量糖化液，此时冲入90～100℃热水以减缓糖化速率，搅拌均匀进行养醅，养醅2～3 d后得大米糖化醪液备用。冲入热水的量是大米重量的1.5～1.8倍。

2、丢糟降解液的预制备

在丢糟中加入 50℃热水和复合酶，搅拌混合进行6 h酶解，得到丢糟降解液备用。酶解条件为：品温45～52℃，pH6.0。100重量份丢糟中加入30～40重量份热水、0.75重量份的复合酶。  

所述的复合酶，其组份为：葡聚糖酶40％，由枯草杆菌制备的蛋白酶40％、纤维素酶20％。

3、细菌纤维素薄膜液体培养基的制备：

以丢糟降解液和大米糖化醪液按1：1.5～3的重量份比例混合，混合后以4000r/min进行离心，回收清液；测定清液糖度并进行调整糖度至12°Brix。同时采用1mol/L柠檬酸溶液调节清液的pH值至3.0～4.5，即制成本发明所述的细菌纤维素薄膜液体培养基。

本发明所述的根霉米粉，其制作过程如下：将台湾根霉3066（Rhizopus formosaensis）菌株接到试管PDA培养基中活化培养72h待用。将过60目大米粉80g装入500mL的三角瓶中，塞上棉花塞包牛皮纸，高压锅杀菌成根霉米粉培养基备用。挑取试管PDA培养基中经活化培养的根霉菌丝接入根霉米粉培养基中，放入33℃培养箱中，进行48h扩大培养。在超净工作台上将根霉米粉培养基中经扩大培养根霉用接种铲挖取约40g，接入经杀菌的装有1 kg米粉的面盆中，拌匀混匀，盖上盆盖，放到33℃培养室中进行培养，培养过程品温不超过36℃，培养48 h后即制成根霉米粉备用。当品温超过36℃时，翻盖迅速用无菌玻棒松动米粉降温。

台湾根霉（Rhizopus formosaensis）菌株（编号3066）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌株（编号1.01812）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

复合酶的组份为葡聚糖酶、由枯草杆菌制备的蛋白酶、纤维素酶均由诺维信公司购得。

应用本发明制备的细菌纤维素薄膜液体培养基制备细菌纤维素薄膜时，在液体培养基中接入10%木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌种液，每8小时通入无菌空气15分钟充氧，增殖培养2 d制成菌体扩大培养液；将菌体扩大培养液倒入浅盘常温下静置培养4～6 d，生长出一定厚度的细菌纤维素菌膜，压平烘干得到细菌纤维素薄膜。

木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌种液制备：将100mL HS培养基装入300mL三角瓶中，灭菌，冷却后接入活化的木糖葡糖酸醋杆菌斜面种子，于30℃、60r/min振荡培养3d。

HS培养基:葡萄糖20g,酵母粉5g,蛋白胨5g,Na₂HPO₄ 2.7g,柠檬酸1.2g，以蒸馏水补足1L,pH调整为6.0。

采用本发明制备的细菌纤维素薄膜液体培养基，与现有常用HS培养基相比，培养基原料成本低，营养成分丰富，制备的细菌纤维素的膜片厚度为＞10mm，烘干的细菌纤维素薄膜的得率提高到7.2～7.8g/L，制备时间缩短1.5～3d，缩短生成细菌纤维素的发酵周期，提高细菌纤维素薄膜的拉伸强度和断裂伸长率。

附图说明

图1是本发明所述的细菌纤维素薄膜液体培养基的流程图。

具体实施方式

实施例 1

1、大米糖化液的预制备

按照技术方案中详细描述步骤，将200kg大米蒸饭、淋饭搭窝，经过搭窝糖化得到糖化醪液备用。

2、丢糟降解液的预制备

按照技术方案中详细描述步骤，将300kg丢糟加热水、复合酶搅拌混合，进行酶解，得到丢糟降解液。

3、液体培养基制备：

以丢糟降解液和大米糖化醪液按1：1.5的重量份比例，各取200 kg丢糟降解液和300 kg大米糖化醪液混合，混合液通过离心机，以4000r/min离心，弃取固形物，清液回收，用Brix糖度计测定清液的糖度，显示清液的糖度为16.5°Brix，此时逐步加水调整清液的糖度至12°Brix，同时采用1mol/L柠檬酸溶液调整清液的pH值至3.5,即制成具有营养成分丰富的细菌纤维素膜液体培养基。

4、细菌纤维素膜制备：

1）加热灭菌：将制备的液体培养基加热95℃，加热时间15分钟，自然冷却至30℃。

2）充氧增殖培养：将3L冷却30℃液体培养基装入5L发酵罐中，接入10%木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌种液，每8小时通入无菌空气15分钟充氧，控温30℃左右进行菌体扩大增殖培养，时间2 d，制成菌体扩大培养液。

3）细菌纤维素薄膜培养：

将1L菌体扩大培养液倒入A浅盘，常温28℃下静置培养4 d，生长出细菌纤维素菌膜；生长出菌膜后，从A浅盘中将新生长细菌纤维素菌膜并倒出1/3L的菌体扩大培养液，一并加到B浅盘,再补足2/3L制备的液体培养基进行增殖培养；A浅盘中原有剩余2/3L的菌体扩大培养液中，加入补足1/3L制备的液体培养基进行增殖培养。继续培养时间4 d，A浅盘和B浅盘都生长细菌纤维素菌膜。即得到厚度为11.8mm的细菌纤维素薄膜。烘干的细菌纤维素薄膜的产量为7.3g/L，细菌纤维素的膜制备时间缩短1.5d，缩短生成细菌纤维素的发酵周期。

本实施例中使用的台湾根霉Rhizopus formosaensis菌株（编号3066）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。根霉米粉制作方案如技术方案所述。木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌株（编号1.01812）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

实施例 2

1、大米糖化液的预制备

与实施例1相同。

2、丢糟降解液的预制备

与实施例1相同。

3、液体培养基制备：

以丢糟降解液和大米糖化醪液按1：3的重量份比例，各取100 kg丢糟降解液和300 kg大米糖化醪液混合，混合液通过离心机，以4000r/min离心，弃取固形物，清液回收，用Brix糖度计测定清液的糖度，显示清液的糖度为14.5°Brix，此时逐步加水调整清液的糖度至12°Brix，同时采用1mol/L柠檬酸溶液调整清液的pH值至4.5,即制成具有营养成分丰富的细菌纤维素膜液体培养基。

4、细菌纤维素膜制备：

1）加热灭菌：将制备的液体培养基加热100℃，加热时间12分钟，自然冷却至30℃。

2）充氧增殖培养：将3L冷却30℃液体培养基装入5L发酵罐中，接入10%木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌种液，每8小时通入无菌空气15分钟充氧，控温30℃左右进行菌体扩大增殖培养，时间2 d，制成菌体扩大培养液。

3）细菌纤维素薄膜培养：

将1L菌体扩大培养液倒入A搪瓷浅盘，常温30℃下静置培养4 d，生长出细菌纤维素菌膜；生长出菌膜后，从A浅盘中将新生长细菌纤维素菌膜并倒出1/3L的菌体扩大培养液，一并加到B浅盘再补足2/3L制备的液体培养基进行增殖培养；A浅盘中原有剩余2/3L的菌体扩大培养液中，加入补足1/3L制备的液体培养基进行增殖培养，继续培养时间4d，从A浅盘和B浅盘都生长出细菌纤维素菌膜。即得到厚度为11.6mm的细菌纤维素薄膜。烘干的细菌纤维素薄膜产量为7.2g/L，细菌纤维素膜制备时间缩短1d，缩短生成细菌纤维素的发酵周期。

本实施例中使用的台湾根霉Rhizopus formosaensis菌株（编号3066）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。根霉米粉制作方案如技术方案所述。木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌株（编号1.01812）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

实施例 3

1、大米糖化液的预制备

与实施例1相同。

2、丢糟降解液的预制备

与实施例1相同。

3、液体培养基制备：

以丢糟降解液和大米糖化醪液按1：2.5的重量份比例，各取100 kg丢糟降解液和250 kg大米糖化醪液混合，混合液通过离心机，以4000r/min离心，弃取固形物，清液回收，用Brix糖度计测定清液的糖度，显示清液的糖度为15.5°Brix，此时逐步加水调整清液的糖度至12°Brix，同时采用1mol/L柠檬酸溶液调整清液的pH值至4.0,即制成具有营养成分丰富的细菌纤维素膜液体培养基。

4、细菌纤维素膜制备：

1）加热灭菌：将制备的液体培养基加热100℃，加热时间15分钟，自然冷却至30℃。

2）充氧增殖培养：将3L冷却30℃液体培养基装入5L发酵罐中，接入10%木糖葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）菌种液，每8小时通入无菌空气15分钟充氧，控温30℃左右进行菌体扩大增殖培养，时间2 d，制成菌体扩大培养液。

3）细菌纤维素薄膜培养：

将1L菌体扩大培养液倒入A搪瓷浅盘，常温32℃下静置培养4 d，生长出细菌纤维素菌膜；生长出菌膜后，从A浅盘中将细菌纤维素菌膜并倒出1/3L的菌体扩大培养液，一并加到B浅盘再补足2/3L制备的液体培养基进行增殖培养；A浅盘中原有剩余2/3L的菌体扩大培养液中，加入补足1/3L制备的液体培养基进行增殖培养，培养时间4d，从A浅盘和B浅盘都生长出细菌纤维素菌膜。即得到厚度为12.2mm的细菌纤维素薄膜。烘干的细菌纤维素薄膜的产量为7.8g/L，细菌纤维素膜制备时间缩短1d，缩短生成细菌纤维素的发酵周期。

本技术方案中细菌纤维素薄膜液体培养基与HS培养基同时进行发酵生产细菌纤维素，对细菌纤维素薄膜拉伸强度和伸长率进行测试，试验结果相比较，有如下特点：

一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。