专利摘要

本发明公开了一种纤维素酶固定化载体的制备方法，包括如下步骤：（1）纤维素的炭化；（2）载体的修饰；（3）载体干燥成型。本发明的优点为：1.本发明方法采用纤维素为原料制备专门固定纤维素酶的载体，该载体表面积大、吸附位点多，可与酶稳定结合，减少了酶的脱落，提高了酶的吸附率。2.该载体的制备方法简单易行、制备过程绿色环保、无污染。3.该载体可重复使用多次，仍保持较好的酶活，因此，酶及其载体的使用率提高，成本降低。

权利要求

1.一种纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）纤维素的炭化：将纤维素在400℃-500℃的惰性气体保护条件下炭化；

（2）载体的修饰：在炭化后的纤维素中，加入离子液体和处理剂，搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液；

（3）载体干燥成型：在纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

2.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述纤维素为微晶纤维素。

3.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述惰性气体为氮气或者氩气。

4.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的离子液体为酸性离子液体。

5.根据权利要求4所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：所述酸性离子液体为[DMIM][DMP]、[AMIM]CI或[AMIM][OAc]。

6.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述处理剂为聚乙烯醇、聚乙二醇或者溴代丁乙酰亚胺。

7.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述纤维素与加入的离子液体重量比为1：1～5；加入的处理剂的浓度为0.1-0.2M。

8.根据权利要求1所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的溶剂为水或短链醇。

9.根据权利要求8所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，加入的水或短链醇为纤维素载体溶液体积的1-5倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化酶载体的制备方法，尤其涉及一种专门固定纤维素酶的纤维素载体的制备方法，属于生物化工领域。

背景技术

纤维素酶是一种复合酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌、细菌和动物体都能分泌纤维素酶。通常将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。其中，C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构；Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶；β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。纤维素酶可用于将纤维素转化为可发酵糖，进而生产燃料乙醇。由于天然纤维素酶是游离酶，多为一次性直接使用，使用成本高，阻碍了该转化过程的工业化。

固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。因此，将纤维素酶固定化，有利于酶的回收和再利用，有望解决该酶生产应用的实际问题，成为近年来各大院所的研究热点。

现有载体上吸附的酶容易脱落，由此导致固定化酶稳定性和活性不高，同时酶固定化载体很少能够重复利用，因此存在载体材料的后处理及废载体的闲置问题。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种能大量吸附并稳定固定纤维素酶、同时可以回收再利用的的酶固定化载体的制备方法。

技术方案：本发明所述的纤维素酶固定化载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）纤维素的炭化：将纤维素在400℃-500℃的惰性气体保护条件下炭化；

（2）载体的修饰：在炭化后的纤维素中，加入离子液体和处理剂，搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液；

（3）载体干燥成型：在纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

其中，步骤（1）中，所述纤维素为微晶纤维素。所述惰性气体为氮气或者氩气。

步骤（2）中，所述的离子液体为酸性离子液体。所述酸性离子液体为[DMIM][DMP]、[AMIM]CI或[AMIM][OAc]。所述处理剂为聚乙烯醇、聚乙二醇或者溴代丁乙酰亚胺。所述纤维素与加入的离子液体的重量比为1：1～5。加入的处理剂的浓度为0.1-0.2M（mol/L），其中，加入的处理剂与离子液体和纤维素之间不存在比例关系，浓度高也行，浓度低也可以，只要能固定化酶、并为其提供更多接触面积即可。

步骤（3）中，所述的溶剂为水或短链醇。加入的水为纤维素载体溶液体积的1～5倍；加入的短链醇为纤维素载体溶液体积的1～3倍。

反应机理：高温处理使纤维素材料炭化，从而把纤维素转化成刚性强、稳定性好的碳材料，加入的离子液体可以溶解纤维素为后续反应提供条件，加入的处理剂与炭化纤维结合，并连接在纤维载体的表面和内部，这些处理剂使载体的表面积增大，酶的接触位点增加，同时还可以与酶分子上氨基等基团结合，进而实现酶的固定化。

有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：1、本发明方法采用纤维素为原料制备专门固定纤维素酶的载体，该载体表面积大、吸附位点多，可与酶稳定结合，减少了酶的脱落，提高了酶的吸附率。2、该载体的制备方法简单易行、制备过程绿色环保、无污染、成本低廉；3、该载体可重复使用多次，仍保持较好的酶活，因此，酶及其载体的使用率提高，成本降低。

附图说明

图1为本发明纤维素酶固定化载体的XRD（X射线衍射）图。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1、按如下步骤进行：

（1）将微晶纤维素加入管式炉，氮气保护条件下400℃炭化1h。

（2）取6g炭化的微晶纤维素加入250ml的三口烧瓶，先后加入6g1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯[DMIM][DMP]和0.2M的聚乙二醇60ml，搅拌均匀，100℃保温处理20min，使载体的表面和内部发生变化，表面积增大，酶的接触位点增加。

（3）在纤维素载体溶液中加入2倍体积的水，搅拌均匀20min，洗涤除去杂质，然后将载体60℃真空干燥，真空脱气制备成载体。

如图1是该载体的XRD图谱，纤维素载体已经炭化，30-50度的位置出现小峰说明载体有苯环（即氨基苯甲酸）的存在，氨基苯甲酸的羧基可以与酶蛋白氨基酸的氨基结合。

实施例2：

（1）取微晶纤维素，氩气保护条件下500℃炭化1h。

（2）取1g炭化的微晶纤维素，先后加入5g氯化烯丙基-3-甲基咪唑[AMIM]CI和100ml 0.2M的聚乙烯醇，搅拌均匀，100℃保温处理20min，使载体的表面和内部发生变化，表面积增大，酶的接触位点增加。

（3）在纤维素载体溶液中加入1倍体积的乙醇，搅拌均匀20min，洗涤除去杂质，然后将载体65℃真空干燥，真空脱气制备成载体。

实施例3：

（1）取微晶纤维素，氩气保护条件下450℃炭化1h。

（2）取5g炭化的微晶纤维素，先后加入15g[AMIM][OAc]和75ml 0.2M的溴代丁乙酰亚胺，搅拌均匀，80℃保温处理30min，使载体的表面和内部发生变化，表面积增大，酶的接触位点增加。

（3）在纤维素载体溶液中加入1倍体积的甲醇，搅拌均匀30min，洗涤除去杂质，然后将载体60℃真空干燥，真空脱气制备成载体。

实施例4：

取20ml的50mM，pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入50IU的纤维素酶，加入1g实施例1制备的载体，在30℃水浴摇床中反应24h。过滤获得固定化酶，用醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤直至检测不到蛋白为止。采用考马斯亮蓝法检测纤维素酶的吸附率，测得其吸附率1500mg/g（是原吸附率的96%）；同时采用DNS法、以葡萄糖作为标准品检测纤维素酶的活性，测得该固定化酶的表观活性为40IU，重复使用15次后，载体固定化酶活性达到90%左右。

实施例5：用实施例2制备的载体重复实施例4，测得纤维素酶的吸附率为1600mg/g（是原吸附率的98%）；该固定化酶的表观活性为43IU，重复使用15次后，该载体固定化酶活性达到85%左右。

实施例6：用实施例3制备的载体重复实施例4，测得纤维素酶的吸附率为1800mg/g（是原吸附率的99%）；该固定化酶的表观活性为45IU，重复使用15次后，该载体固定化酶活性达到80%左右。

一种纤维素酶固定化载体的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。