专利摘要

本发明公开了一种微生物基因克隆方法，该方法包括：用目标性状有差异的菌株做亲本，杂交构建分离群体；对分离群体设置选择压进行自动筛选，获得筛选后群体；对两个亲本、筛选前和筛选后群体进行基因组高通量测序；通过初步直接组装并比对，获得亲本特异位点，将亲本特异位点与筛选前、筛选后的群体基因组按完全匹配的方式进行比对，寻找在亲本与筛选前存在、在筛选后消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点，通过与亲本基因组比对获得基因的全长序列，并利用PCR扩增克隆目标基因，按遗传互补实验验证所克隆目标基因的功能。本发明直接克隆基因本身，避免了大量的微生物小种分离与鉴定工作。本发明的方法工作量小，速度快，而且风险低。

权利要求

1.一种微生物基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：用目标性状有差异的菌株做亲本，通过杂交构建分离群体；通过抗性植株、农药、温度、营养元素对分离群体设置选择压进行自动筛选，获得筛选后群体；对两个亲本、筛选前和筛选后群体进行基因组高通量测序；通过初步直接组装并比对，获得亲本间差异位点，并将亲本间差异位点与筛选前和筛选后的群体基因组按完全匹配的方式进行比对，寻找在亲本与筛选前存在、但在筛选后消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点；通过与亲本基因组比对获得基因的全长序列，并利用PCR扩增克隆目标基因，按遗传互补实验验证所克隆目标基因的功能。

2.根据权利要求1所述的微生物基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建分离群体：利用分别含有相对性状的亲本杂交后分离构建分离群体；

(2)群体自动筛选：按目标性状的特点，选择适合类型的选择压，对分离群体进行自动筛选，获得筛选后群体；

(3)DNA提取：提取2个亲本、筛选前和筛选后2个混合群体的基因组DNA；

(4)目标位点的确定：按高通量测序流程分别构建亲本、筛选前和筛选后基因组DNA文库，PCR并高通量测序；按直接组装，初步构建2个亲本全基因组，通过比对，获得亲本间差异位点；按完全匹配的方式，将差异位点与筛选前和筛选后的混合基因组进行比对，获得在亲本和筛选前群体中存在、但在筛选后群体中消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点，若候选基因位点为多个，采用PCR或杂交方式在筛选前和筛选后的群体DNA中富集候选位点，对候选位点重测序，最终确定目标基因；

(5)目标基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

说明书

技术领域

本发明属于遗传学领域，公开了一种微生物基因克隆方法。

背景技术

自然界微生物种类极其复杂，有细菌、真菌、病毒等各种种类，寄主也包括人、动物、植物等。对人类而言，微生物基因功能丰富多样，有好有坏，比如，根瘤菌与豆科植物共生形成根瘤，在固氮酶基因的帮助下固定空气中的氮气供植物营养，可减少化肥的施用、保护环境。然而，由Magnaporthe grisea中的毒性基因引起的稻瘟病是水稻上最严重的真菌病菌病害之一，可造成水稻减产30％左右，甚至绝收，严重威胁国家粮食安全。因此，克隆微生物的毒性基因、耐药性基因等，对了解并利用微生物的这些特性为人类服务至关重要。

克隆微生物基因的方法较多，但主要还是按照经典的连锁标记定位，然后克隆的方式进行。分子标记连锁定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F₁(基因型YyRr)，F₁自交可能产生YR、Yr、yR和yr 4种配子，根据F₂代的性状表现可以得知它们的比例，进而计算交换率。若交换率为1％，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距1CM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，仍以上述实例进行说明。以籽粒形状为标准，将F₂群体划分为两个部分(池)：显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知了1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F₂各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。

分子标记连锁定位并克隆基因经过几十年的发展，已成为基因克隆的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下：

(1)微生物个体小，观察与鉴定工作十分困难且主观性强。然而，连锁标记定位要求鉴定分离群体中每一菌株的表现型，工作量十分繁杂且难度大。

(2)目前针对微生物所开发的分子标记有限，使其应用受到很大限制；精细定位时，可用标记越来越少，甚至无标记可用，使工作无法进行，即使存在标记，由于交换率低，需分离与鉴定大量菌株才能准确获得的遗传距离，工作量呈几何级数增加；仅找到包含目标基因的区段，还需要进行基因预测，无法避免基因预测的假阳性或假阴性。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够准确、快速、轻松克隆微生物目标基因的新方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种微生物基因克隆方法，包括以下步骤：

用目标性状(如毒性、耐药性、温度敏感性等)有差异的菌株做亲本，通过杂交构建分离群体，通过抗性植株、农药、温度、营养元素等条件对分离群体设置选择压进行自动筛选，获得筛选后群体；对两个亲本、筛选前和筛选后群体进行基因组高通量测序；通过初步de novo(直接)组装并比对，获得亲本间差异位点，并将亲本间差异位点与筛选前和筛选后的群体基因组按完全匹配的方式进行比对，寻找在亲本与筛选前群体中存在、但在筛选后群体中消失的位点，该位点为控制目标性状的基因；通过与亲本基因组比对获得目标基因的全长序列，并利用PCR扩增克隆目标基因，按遗传互补实验验证所克隆目标基因的功能。

本发明更具体的技术方案是：

一种微生物基因克隆方法，包括以下步骤：

(1)构建分离群体：利用分别含有相对性状(如毒性、耐药性、温度敏感性等)的亲本杂交后分离构建分离群体；

(2)分离群体自动筛选：按目标性状的特点，选择适合类型的选择压(如抗性植株、药物、高温等)，对分离群体进行自动筛选，获得筛选后群体；

(3)DNA提取：提取2个亲本、筛选前和筛选后2个混合群体的基因组DNA；

(4)目标位点的确定：按高通量测序流程分别构建亲本、筛选前和筛选后基因组DNA文库，PCR并高通量测序。按de novo组装，初步构建2个亲本的全基因组序列，通过比对，获得亲本间差异位点。按完全匹配的方式，将差异位点与筛选前和筛选后的混合基因组进行比对，获得在亲本和筛选前群体中存在但在筛选后群体中消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点，可分为两种情况，若测序深度足够，则只出现一个候选位点，则可直接获得目标座位(因为微生物基因组一般较小，因此，这种情况容易出现)；若测序深度不够，那么和目标位点紧密连锁的位点可能无法与目标座位区分开，出现多个候选基因；这时，可采用PCR或杂交(如安捷伦的SureSelect平台)的方式富集候选位点后高通量测序，由于不再检测全基因组，此时测序深度已不再是问题，可将连锁位点与目标基因区分开，从而获得目标座位。

(5)目标基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得目标基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

本发明实施例的有益效果是：

(1)传统定位、克隆方法需要分离、鉴定大量的菌株，工作十分繁杂且对鉴定者经验要求很高，常耗时数年。本发明群体构建完成后，只需要一次条件筛选，提取4份DNA，一次高通量测序即可完成实验，避免了大量的菌株分离与鉴定工作，可在2-6个月内完成。

(2)本方案依赖于测序而非分子标记，可用于任何微生物物种，极大地拓宽了微生物基因克隆与利用范围。直接克隆目标基因本身，而非包含目标基因的区段，结果明确，也不存在无标记可用的问题。大部分步骤有概率保证，具有判断标准，风险大为降低。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的微生物基因克隆通用方法流程示意图；

图2是本发明实施例2提供的水稻稻瘟病菌毒性基因克隆方法流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

一种微生物基因克隆方法，包括以下步骤(参见图1)：

(1)构建分离群体：利用目标性状(如毒性、耐药性、温度敏感性等)具有差异的亲本1和亲本2杂交。若该微生物为单倍体，则F₁即为分离群体，若为二倍体，则至F₂代成为分离群体，该分离群体即为筛选前群体。

(2)分离群体自动筛选：按目标性状的特点，选择针对目标性状的选择压(如抗性植株、药物、高温等)，对分离群体进行自动筛选，获得筛选后群体；

(3)DNA提取：提取2个亲本、筛选前和筛选后2个混合群体基因组DNA；

(4)目标位点的确定：按高通量测序流程分别构建亲本、筛选前和筛选后基因组DNA文库，PCR并高通量测序。按de novo组装，初步构建2个亲本的全基因组序列，通过比对，获得亲本间差异位点。按完全匹配的方式，将这些差异位点与筛选前和筛选后的混合基因组进行比对，获得在亲本和筛选前群体中存在但在筛选后群体中消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点，可分为两种情况，若测序深度足够，则只出现一个候选位点，则可直接获得目标位点(因为微生物基因组一般较小，因此，这种情况容易出现)；若测序深度不够，那么和目标位点紧密连锁的位点可能无法与目标座位区分开，出现多个候选基因，即获得目标位点候选位点；这时，可采用PCR或杂交(如安捷伦的SureSelect平台)的方式在筛选前和筛选后群体中富集候选位点后高通量测序，由于不再检测全基因组，此时测序深度已不再是问题，可将连锁位点与目标基因区分开，从而获得目标位点。

(5)目标基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得目标基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

实施例2

一种稻瘟病无毒基因克隆方法(参见图2)：

(1)有毒性与无毒性的稻瘟病小种的鉴定。从湖北恩施的丽江新团黑谷水稻感染稻瘟病的病叶上分离培养稻瘟病生理小种，利用这些生理小种接种水稻材料IRBL 12，发现接小种S223后，出现典型的稻瘟病梭形病斑，表明S223小种对IRBL 12具有毒性。接种S12后，IRBL 12几乎没有病斑，表明S12小种对IRBL 12没有毒性。

(2)F₁杂交子囊孢子的获得与培养。将稻瘟病菌S223与S12亲本菌株于燕麦片培养基(燕麦片30g，蔗糖10g，琼脂18g，水1000ml)上25℃作对峙培养至菌丝相遇，20℃光照继续培养至菌丝交界处出现黑色子囊壳。挑10个以上的子囊壳至马铃薯葡萄糖琼脂培基(即PDA培养基，其对菌的选择性低。配制方法如下：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤，加30g葡萄糖和15g琼脂，继续加热至葡萄糖和琼脂融化，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，搅拌混匀，分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20分钟后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用)的表面，用接种针挤破子囊壳(或0.5mg/ml的Molyase酶酶解子囊壁)并轻轻拖拉使子囊中的子囊孢子分离后继续培养备用。通过以上方法，获得了杂交F₁子囊孢子混合群体，即为筛选前群体。

(3)毒性子囊孢子混合群体的获得。将IRBL 12稻谷用75％酒精消毒，于洁净的组织培养室中生长。待IRBL 12秧苗生长到5叶期时，用浓度为10⁴～10⁵个/ml的F₁子囊孢子混合群体喷雾接种。接种后的秧苗置于26℃、100％相对温度、黑暗条件下培养36小时，然后，光照培养5～7天至叶片发病。将病叶用75％的酒精消毒后，置于PDA培养基中培养，若存在明显杂菌(如细菌等)，则挑稻瘟病菌丝再次培养一次。通过以上方法，获得对IRBL 12具有毒性的子囊孢子混合群体，即为筛选后群体。

(4)DNA提取。按照真菌DNA提取试剂盒(Andybio，货号：M090090)操作手册提取和纯化亲本S223和S12、F₁子囊孢子混合群体(筛选前群体)和毒性子囊孢子混合群体(筛选后群体)DNA。通过分光光度计测定并计算A260/A280比值，以判断DNA质量与含量。

(5)毒性基因克隆。按Illumina HiSeq 1000操作流程构建S223和S12、F₁子囊孢子混合群体和毒性子囊孢子混合群体基因组文库、PCR和高通量测序。其中，建库方式按Fragment的方式进行，4个样本利用条形码标签进行区分。在这4个样本中，S223和S12的测序通量(Clean Data)为0.98G和1.37G，F₁子囊孢子混合群体和毒性子的囊孢子混合群体的测序通量(Clean Data)分别为152.43G和133.45G。稻瘟病菌基因组大约为47M，因此，4个样本的测序平均覆盖稻瘟病基因组基因组21.3、29.8、3321.1和2907.5倍。用基因组组装程序ABySS(http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)对两个亲本S23和S12基因组进行初步组装。比较两亲本基因组间的差异，共发现1316个差异位点。将这些差异位点按完全匹配的方式与F₁子囊孢子混合群体和毒性子囊孢子混合群体比较，发现所有等位位点序列都在F₁子囊孢子混合群体中存在，但在5％的显著性水平下，有14个等位位点的两种序列间比例偏离了1∶1，其余位点符合1∶1的分离比例。将所有1316个位点在F₁子囊孢子混合群体中的分离比与毒性子囊孢子混合群体中的分离比进行比较，发现在5％的显著性水平下，有1212个位点的分离比在两个群体间没有差异，另有104个位点的分离比存在显著差异。进一步将这104个位点在毒性子囊孢子混合群体中的分离比与0∶1进行比较，发现其中一个位点的分离比在5％的显著性水平下，与0∶1不存在显著差异。该位点中，绝大部分毒性亲本S223的序列(共2982条)在毒性子囊孢子混合群体中存在，而无毒亲本S12的序列在毒性子囊孢子混合群体中只出现了3次。考虑到在5％的显著性水平下，2982：3是符合1∶0的统计假设的，而且抗性压力筛选也不太可能完全彻底，因此，接受该位点为对IRBL 12具有毒(无毒)性基因位点的假设。其中，S223中的序列应为毒性座位，其序列为序列表中的SEQ ID NO.1：

ATTGGCACCTTTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAAGGCGGGCATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTGCCGCGCTAAAAAGGTAAATTGAAACTCTTTAAAACAAATTCGGAAAACAA，S12中的序列应为无毒座位，其序列为序列表中的SEQ ID NO.2：

ATTGGCACCTTTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAAGGCGGGCTTATATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTGCCGCGCTAAAAAGGTAAATTGAAACTCTTTAAAACAAATTCGGAAAACAA，与前者比较，后者从第78个碱基的位置插入了4个碱基TTAT。将以上S12中的序列与组装的S12基因组序列进行比对，选择位点前后各20k的碱基利用GeneScan软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行基因预测，预测参数采用真菌基因预测的默认参数。包含了SEQ ID NO.2序列的基因即为无毒基因，从而获得无毒基因的全长序列。分别根据无毒基因上游500bp和下游500bp碱基序列，利用Primer5(Version 5.00)软件，设计PCR引物，引物设计的参数选用软件的默认参数。上游序列为序列表中的SEQ ID NO.3：

TAGTCGTTAGATAAAAATATATTACCTTTTACCTAATTTTTAATCTCAGGGTTTATCCCTGAAGCCCGCAGTTCCGCAATTGAACCGCGTCGCCGTGGTTCAATTGCGGCTGTATATTATACCTGTGGGTCCAAATACAAATCGCTTCGGTTCAGGTTTGAAACCATTTTGTCGTTTTTCGCCGTTCGCGGGGATGTTAATATATATTAAATAATTAAACAGAAATTTCACTCCCTTATAATAAATTGAATAAAAATCGTAAAAATATACGGTTTGTATATTGGATATAATACTTAGTGTGACATTTGGACCATGAGATCACCAGACCCTAACCCTGACCCTGGACCAACGACCCACCAGGGTGATACCTTTATCGACGTCGCGTCAAGCTCAGAACTTTGTTTGTTTCCTTTCTTCTCCTCAGAGTAGAATCTTCATCGATAGGCGCCAATAGACTAGCTTCCGTGCTATGCTTACCCTGGCCGTGACACGATCCCTGG，下游序列为序列表中的SEQ ID NO.4：

ATAACGTTAGTGTTGGAATGGAGGGAATCGCGGTCAATTTAACAATAGAGGGATAAATTACGTGTAATGCCGCACAAGCCAGTTGCACGTGACTCACCCGTCCAATTGCGGGTATAAGAAGCAGAGACGTTTAGAAACTCACCTTTAAACGGTTTAATAAACGAAATGTAATAAATACCTTTATATCCGTATAATAACGTTTTGTTAATGGATCGACATTACAAAAGGCCTATAAACTTGAGCTAATGCTATTTAAACAATACAAAAAAGCAAAGCAAATAAATTAAACGTTAATATTATTACGGCCAGGCATAGATTGGAGAACCTCAATATATTAGCCGCTATCGACGAAAATTCTAAACTGAAAAAAAAGAGAAATTACAATTAACGGCGCATTGGAAAACGCGTTTAAATCCGGGGTCAGTGGACCCCTTTGTCCAATCTTTAATTTAATTTGGTTGGTAAAACCGAATCGTAATTTTAAAGGTGGGTTGTTACGA；其中正向引物为序列表中的SEQ ID NO.5：ATCACCAGACCCTAACCC；反向引物为序列表中的SEQ ID NO.6：TCCCTCCATTCCAACACT，于S12亲本中扩增全长基因序列。PCR扩增体系按试剂盒DreamTaq^TM Green PCR Master Mix(2X)(K1081，fermentas)推荐体系进行，即含PCR混合物50μl，S12模板15ng，引物2μl(浓度：0.5μM/μL)，加纯水至总体积为100μl。扩增程序如下：94℃预变性4分钟；94℃，1分钟，52℃，3分钟，72℃，3分钟，循环44次；72℃延伸8分钟。扩增产物用2％的琼脂糖凝胶检测。PCR产物按琼脂糖凝胶回收试剂盒(K0691，Fermentas)操作手册回收并纯化扩增片段并测序，获得控制S12亲本中对IRBL 12具有无毒性的基因的序列为：序列表中的SEQ ID NO.7：

ATGCTTTTTTATTCATTGTTATTTTTTTTTCACACCGTTGCGATTTCGGCCTTCACCAACATTGGCACCTTTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAAGGCGGGCTTATATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTGCCGCGCTAAAAAGGTAAATTGAAACTCTTTAAAACAAATTCGGAAAACAATGTTAAATATTTTGTTTAGTTGCGCCGAGCTCGCCTCGTGGGGCTATCACGCCGTTAAAAGTAACAATCGGTTATTTAAATTAATCTTTAAAACTGACAGCACAGATATTCAAAACTGGGTTCAAAATAATTTTAACGAAATTTACAAGGAATGTAACAGGGACGCGGACGAAATTTCTCTAACCTGCCACGATAAAAATGTTTATACGTGCGTCCGAGAAGGAGTTCATAATTTGGCGTATGCACTTATTAACGAAAAAGAAATTGTTATATGCCCTCCTTTCTTCAACAACCCCGTAAACAGCAGGGAAATTACTGCCGGTAACCAAGATACAATTATATTACATGAAATGGTGCATATAATTTTAAGTAAGTTTGCTTTTACAAATTGATAAAACATTTACAAAAGTTTATTTATAAAAATTTTCAAAAACTAAAAATTCAAATTTTTATTTAGAAGAGTGGAAAGATTATGGTTGCGAATGGGATGGGATTCACAAGTAAGTTGTCGAAAAACAAAATGCTGAATGTTGTTTTATATTGATAAATTCTAATTAATATTAAGATTGGATAGTACAGAAAGTATTAAAAACCCCGACAGTTATGCTATTTTTGCACAATGTGCACGTTATAAATATTGTTAA

(6)功能互补验证

将上述基因连接进入根癌农杆菌Ti质粒载体，与S223亲本共培养，筛选阳性菌株，接种IRBL 12，植株表现为不感病，表明所克隆的基因控制了S12亲本对IRBL 12的无毒性。

本发明以测序为基础，可用于任何微生物物种，直接克隆基因本身，避免了大量的微生物小种分离与鉴定工作。采用本发明的方法，工作量大为减少，速度大为加快，而且降低了风险。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

一种微生物基因克隆的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。