专利摘要

检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合，属于实验动物病原微生物检测技术领域。所述引物组合包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP，反应体系；反应体系包括FIP、BIP、F3、B3、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、羟基萘酚蓝HNB、模板DNA和去离子水。检测的靶基因是金黄色葡萄球种内高度保守的特异性gyrB序列片段。特异性强：所检测的阴性对照无阳性扩增结果。灵敏度高，基因组DNA最低检出率为1.4×10^‐4ng/μL。检测迅速、出结果方便：在约60min即可出现阳性结果。操作简便，对仪器要求低，并可以通过染料直接观测结果，可在基层检测实验动物中心金黄色葡萄球菌检测实践中应用。

说明书

技术领域

本发明属于实验动物病原微生物检测技术领域，尤其是涉及一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的快速检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合。

背景技术

随着生命科学的快速发展，实验动物已经成为生命科学研究的基础和重要支撑条件之一。一些哺乳类实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猫、非人灵长类等，己经建立了相对完善的实验动物标准化体系。而实验动物的微生物控制水平则是标准化程度和动物质量高低的重要标志。各级实验动物所监控的微生物不仅会给实验研究带来各种严重的干扰，比如导致实验数据不可靠、科研经费损失等，有的甚至危及实验人员的生命。因此采用敏感、特异的检测技术和方法开展对实验动物的定期健康检查，控制实验动物携带的微生物水平，对指导实验动物生产与动物实验具有重要的意义。中华人民共和国国家标准GB14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》列出了多种对不同等级实验动物必须检测必须排除的致病菌，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)则是无特定病原实验动物小鼠必检必排除的4种致病菌之一。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，无芽孢，鞭毛，大多数无荚膜，乳酸发酵，兼性厌氧的球状细菌，常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。作为机会致病菌，金黄色葡萄球菌为表皮正常菌群，常造成伺机性感染，为实验用啮齿动物的常见健康监控指标之一。目前常用的金黄色葡萄球菌检测方法包括使用监测拭子直接铺板法及显色培养基法和常规PCR法/荧光定量PCR法，均可以有效地检测。但细菌培养法较其他方法存在难以标准化、耗时长、步骤繁琐、成本高、要求有经验非常丰富的科研人员否则容易出现漏检等缺点；常规PCR法和荧光定量PCR法，需经过变性、退火、延伸，加上DNA提取整个过程大概需要2～4h才能出结果，并且需要精密昂贵的仪器和试剂，从而制约了其在基层实验动物检测实验室的普及，成为实验动物致病菌检测的瓶颈问题。

环介导等温扩增(Loop‐mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是日本学者NotomiT等(NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop‐mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsResearch,2000,28(12):E63)在2000年首次提出的一种恒温条件下实现靶基因快速扩增的新型核酸扩增技术。该技术原理基于DNA在65℃左右可以处于动态平衡状态，仅需一种具链置换活性的DNA聚合酶(如Bst、Gsp等)及针对靶基因6个区域设计的4条特异性引物，便可在利用链置换反应在等温条件下(60‐65℃)通过酶反应系统直接扩增靶核酸序列，并使靶核酸序列呈指数级扩增，实现1h内大于10⁹倍的扩增效果。根据LAMP方法扩增原理，其检测方法也十分便捷。由于其扩增产物是同一条DNA链上互补序列周而复始形成的、多种长短不一的茎环结构和花椰菜样结构的DNA混合物，阳性扩增结果可在琼脂糖电泳图中呈现出阶梯状条带。LAMP技术在相关反应过程中，伴随着大量核酸形成(阳性扩增)，而产生的焦磷酸根与反应溶液中的镁离子形成焦磷酸镁的白色沉淀副产物，通过离心可以肉眼观察到白色沉淀(Y.Mori,M.Kitao,N.Tomita,andT.Notomi,“Real-timeturbidimetryofLAMPreactionforquantifyingtemplateDNA,”JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods,2004,59(2):145-157)；由于反应中大量DNA产物的合成，添加相关荧光染料后可在紫外条件下发生颜色变化(GotoM,HondaE,OguraA,etal.Colorimetricdetectionofloop-mediatedisothermalamplificationreactionbyusinghydroxynaphtholblue[J].Biotechniques,2009,46(3):167-172)。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；不仅具有扩增效率高、特异性强、灵敏度高、操作简便、快捷等优点，而且具有良好的现场、野外检测及资源有限的基层实验室检测应用前景，近年来已被广泛应用于病原微生物、转基因相关检测、胚胎性别鉴定等多个核酸诊断领域。

目前LAMP技术大多是对食源性金黄色葡萄球菌的检测，而针对实验动物致病菌进行LAMP检测的研究却很少；并且大多数LAMP检测基于食源性金黄色葡萄球菌femA、nuc、arcC等特异性的抗性基因或毒力基因，由于特异性抗性/毒力基因不一定存在于同种菌所有不同菌株中，而会导致漏检；因此选择金黄色葡萄球菌种间特异种内保守的基因片段，以满足不漏检实验动物必检必排除致病菌的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合。

所述检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合包括：

外引物F3：F3引物序列5’‐3’GTAAATTAGCCGATTGCTCTA；

外引物B3：B3引物序列5’‐3’GATCATTTGACGAATTTCATTGT；

内引物FIP：FIP引物序列5’‐3’CAGATTTTGTAGACCCCCCGGGTAAAAGTCCTGAAGAATGTGAG；

内引物BIP：BIP引物序列5’‐3’GTCGTGACTCTAGAACGCAGGAAATTCTATCTAATCGTGCCTT；

反应体系；所述反应体系包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、羟基萘酚蓝HNB、模板DNA和去离子水。

所述反应体系可采用5～50μL反应体系。

所述反应体系优选25μL反应体系。

所述25μL反应体系包括：10μM的内引物FIP4.0μL，10μM的内引物BIP4.0μL，10μM的外引物F30.5μL、10μM的外引物B30.5μL、2×反应缓冲液12.5μL、BstDNA聚合酶1μL、羟基萘酚蓝HNB0.1μL(3mM,Sigma)，模板DNA1μL，加去离子水至25μL。

12.5μL2×反应缓冲液的组成可为：Tris‐HClpH8.840mM，KCl20mM，(NH₄)₂SO₄20mM，MgSO₄16mM，Tween200.2％，Betaine1.6M，dNTPs2.8mM。

将LAMP反应体系在62℃恒温条件下反应60min，然后在95℃加热2min，使酶灭活反应完成；待反应完成后通过以下方式进行结果判定：通过2％琼脂糖电泳，120V电压下电泳40min，紫外灯下观察电泳图谱；肉眼观察，反应完成后观察LAMP反应体系是否有颜色的变化，若LAMP反应体系颜色由紫罗兰色变为天蓝色则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到金黄色葡萄球菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到金黄色葡萄球菌。

在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阳性对照所对应的LAMP反应体系均呈天蓝色，则判定待检测对象的检测结果为阳性反应；若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阴性对照所对应的LAMP反应体系均呈紫罗兰色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应；还可通过琼脂糖电泳进一步确认。

本发明采用金黄色葡萄球菌gyrB基因作为检测目标，该基因是普遍存在于细菌中编码DNA负超螺旋的拓扑异构酶即DNA促旋酶的B亚单位中，不仅具有一定保守区域，可以实现不同细菌间的扩增，经NCBIBLAST搜索后，在金黄色葡萄球菌种属间序列保守，而且与其他种属细菌的同源性非常低，因此根据该gyrB基因保守区域设计了一套特异性引物组合，实现了对实验动物金黄色葡萄球菌简便、快捷、准确的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的技术效果：

1)检测的靶基因是金黄色葡萄球种内高度保守的特异性gyrB序列片段。

2)其特异性强：所检测的阴性对照(绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞、豚鼠气单胞菌等多种实验动物病原菌)无阳性扩增结果。

3)灵敏度高，基因组DNA最低检出率为1.4×10^‐4ng/μL。

4)检测迅速、出结果方便：常规PCR整个过程在5～8h才能出结果，荧光定量PCR也需要1.5～2h，本发明提供的检测方法在约60min即可出现阳性结果。并且操作简便，对仪器要求低，并可以通过染料直接观测结果，可在基层检测实验动物中心金黄色葡萄球菌检测实践中有广泛的应用前景。

附图说明

图1为不同温度下的扩增结果。在图1中，1～6分别为60，61，62，63，64，65℃，结果显示最佳温度为62～64℃。

图2为灵敏度测定结果。在图2中，1～9分别为5倍稀释的基因组DNA(111.3ng/μL为最后浓度)；10为阴性对照；11为阳性对照；结果显示最低检测浓度为：1.4×10^‐4ng/μL。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

所述检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合包括：

外引物F3和B3；

内引物FIP和BIP(表1)；

表1

25μL反应体系：10μM的FIP4.0μL，10μM的BIP4.0μL，10μM的F30.5μL以及10μM的B30.5μL；2×反应缓冲液12.5μL(Tris‐HClpH8.840mM，KCl20mM，(NH₄)₂SO₄20mM，MgSO₄16mM，Tween200.2％，Betaine1.6M，dNTPs2.8mM每种)，BstDNA聚合酶1μL，以及羟基萘酚蓝HNB0.1μL(3mM,Sigma)，模板DNA1μL，加去离子水至25μL。将LAMP反应体系在62℃恒温条件下反应60min，然后在95℃加热2min，使酶灭活反应完成；待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：通过2％琼脂糖电泳，120V电压下电泳40min，紫外灯下观察电泳图谱；肉眼观察，反应完成后观察LAMP反应体系是否有颜色的变化，若LAMP反应体系颜色由紫罗兰色变为天蓝色则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到金黄色葡萄球菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到金黄色葡萄球菌。

在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阳性对照所对应的LAMP反应体系均呈天蓝色，则判定待检测对象的检测结果为阳性反应，若待检测对象所对应的LAMP反应体系以及阴性对照所对应的LAMP反应体系均呈紫罗兰色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应；还可通过琼脂糖电泳进一步确认。

本发明采用金黄色葡萄球菌gyrB基因作为检测目标，该基因是普遍存在于细菌中编码DNA负超螺旋的拓扑异构酶即DNA促旋酶的B亚单位中，不仅具有一定保守区域，可以实现不同细菌间的扩增，经NCBIBLAST搜索后，在金黄色葡萄球菌种属间序列保守，而且与其他种属细菌的同源性非常低，因此根据该gyrB基因保守区域设计了一套特异性引物组合，实现了对实验动物金黄色葡萄球菌简便、快捷、准确的检测。

检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。