专利摘要

利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法，步骤为：将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将超声波探头浸入水相中进行超声波-离子液体耦合处理，处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白和回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白先用蒸馏水洗涤再离心，以除去残留离子液体，预处理好的蚕蛹蛋白采用酶法制备得到ACE抑制肽。利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽，与未处理相比，显著提高了ACE抑制肽的活性，活性提高了34％-54％。

权利要求

1.利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法，其特征在于步骤为：将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将超声波探头浸入水相中进行超声波-离子液体耦合处理，处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白和回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白先用蒸馏水洗涤再离心，以除去残留离子液体，预处理好的蚕蛹蛋白采用酶法制备得到ACE抑制肽。

2.根据权利要求1所述的利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法，其特征在于所述超声波-离子液体耦合预处理蚕蛹蛋白的步骤为：按照液料比20－40mL/g将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将24kHz超声波的探头浸入水相中，开启超声波，预处理温度控制在25℃－35℃，超声波间歇比为1:1，超声波功率为300－500W，预处理时间为20－40min，预处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白并回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白用蒸馏水洗涤，离心，直至除去残留离子液体为止，得到预处理好后的蚕蛹蛋白；将预处理好的蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成底物浓度1.0％－5.0％（w/v，g/mL）溶液，在酶解温度45－55℃、酶解pH8.0－9.0、加酶量2000-4000U/g的条件下用蛋白酶水解20－40min，酶解结束后沸水浴灭酶，离心，上清液经浓缩后冷冻干燥，即为蚕蛹蛋白ACE抑制肽产品。

3.根据权利要求1或2所述的利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法，其特征在于：选用的离子液体为疏水性离子液体[Bmim]PF₆。

4.根据权利要求1或2所述的利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法，其特征在于：选用的蛋白酶为碱性蛋白酶。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及功能食品和生物制药的生产方法，特指利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法。

背景技术

高血压被国际上称为“无声杀手”。目前还没有特效药能够根治高血压，高血压患者需要终身服药治疗。研究发现，血管紧张素转换酶（Angiotensin-I converting enzyme，简称ACE）被认为是导致人体高血压的关键性酶，在体内通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统和血管舒缓激肽-激肽-前列腺素系统中对血压的调节起着重要的作用。因此，通过抑制ACE活性可有效控制高血压患者的血压至正常水平，现已开发出了卡托普利、依那普利和赖诺普利等20多种ACE抑制类降压药，然而这些药物有许多不良反应，如咳嗽、高血钾、皮疹、味觉丧失等症状（Segura-Campos Maira Rubi,Chel-Guerrero Luis Antonio,Betancur-Ancona David Abram.Purification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from a cowpea(Vigna unguiculata)enzymatic hydrolysate[J].Process Biochemistry,2011,46(4):864–872）。与人工合成药物相比，食源ACE抑制肽具有无副作用的优点，己成为非药物控制高血压进程的理想选择。

我国是世界上最大的蚕茧生产国，年产蚕茧70多万吨以上。一般生产1吨生丝，约有0.8吨干蚕蛹，因此蚕蛹产量十分巨大。蚕蛹蛋白的深加工成为推动我国桑蚕产业健康发展的重要途径。缫丝后的蚕蛹蛋白因蛋白功能特性差以及难闻的气味限制了它的应用，主要被用于饲料和肥料；在食品加工领域中的应用也局限于初级加工，以蚕蛹水解蛋白和氨基酸水解液的开发为主，蚕蛹蛋白的利用价值不高；研究发现，蚕蛹蛋白中含有丰富的ACE抑制肽，现已有专利报道，如中国发明专利“利用蚕蛹制取降血压肽的方法（公开号：CN1896267A）”和中国发明专利“利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法（公开号：CN101701240A）”。因此，蚕蛹蛋白具有潜在的开发ACE抑制肽前景。

国内外ACE抑制肽的制备以酶解技术为主，酶解反应过程的设计及其工作参数的优化是酶解法制备ACE抑制肽的关键技术。为了提高酶解效率和蛋白资源利用效率，不少学者开展了大量探索性研究。如：多酶水解法（吴建平，丁霄林.大豆肽的研制(I)—生产高活性ACEI肽酶系的筛选[J].中国油脂,1998,23(2):49-51）和酶-膜耦合法（Huang Wen-Hao,Sun Jie,He Hui,Dong Hua-Wei,Li Jiang-Tao.Antihypertensive effect of corn peptides,produced by a continuous production in enzymatic membrane reactor,in spontaneously hypertensive rats[J].Food Chemistry,2011,128(4):968-973）。但是，这些方法仅提高了水解产物的产率，其ACE抑制活性尚未明显改善。

随着人们对ACE抑制肽制备工艺研究的深入，发现超声波预处理可以促进食源ACE抑制肽的酶解释放。如中国发明专利“一种燕麦多肽及其制备方法与应用（公开号：CN101709321A）”报道了利用超声波预处理燕麦蛋白制备ACE抑制肽，发现超声波预处理后，燕麦蛋白ACE抑制肽的活性远远高于对照组（未超声波处理）的活性。

离子液体被公认为继“超临界流体”和“双水相”之后的第三种绿色溶剂，具有良溶性、强极性、不挥发、热稳定、化学惰性、熔点低、难氧化、可设计性等特点，常被学者用于原料预处理。目前在蛋白原料预处理上已有应用，如：利用离子液体改性丝素蛋白（Phillips David M,Drummy Lawrence F,Conrady Deborah G,Fox Douglas M,Naik Rajesh R,Stone Morley O,Trulove Paul C,De Long Hugh C,Mantz Robert A.Dissolution and regeneration of bombyx mori silk fibroin using ionic liquids[J].Journal of the American Chemical Society,2004,126(44):14350-14351）和胶原纤维（Meng Zhuojun,Zheng Xuejing,Tang Keyong,Liu Jie,Ma Zhi,Zhao Qiaoling.Dissolution and regeneration of collagen fibers using ionic liquid[J].International Journal of Biological Macromolecules,2012,51(4):440-448）。超声波-离子液体耦合技术已被用于生物催化反应，如中国专利“一种超声波辅助离子液体催化微藻油脂生产生物柴油的方法（公布号：CN102732385A）”；目前，尚未有利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法。

技术方案：利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法，步骤为：将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将超声波探头浸入水相中进行超声波-离子液体耦合处理，处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白和回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白先用蒸馏水洗涤再离心，以除去残留离子液体，预处理好的蚕蛹蛋白采用酶法制备得到ACE抑制肽。

所述超声波-离子液体耦合预处理蚕蛹蛋白的步骤为：按照液料比20－40mL/g将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将24kHz超声波的探头浸入水相中，开启超声波，预处理温度控制在25℃－35℃，超声波间歇比为1:1，超声波功率为300－500W，预处理时间为20－40min，预处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白并回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白用蒸馏水洗涤，离心，直至除去残留离子液体为止，得到预处理好后的蚕蛹蛋白；将预处理好的蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成底物浓度1.0％－5.0％（w/v，g/mL）溶液，在酶解温度45－55℃、酶解pH8.0－9.0、加酶量2000-4000U/g的条件下用蛋白酶水解20－40min，酶解结束后沸水浴灭酶，离心，上清液经浓缩后冷冻干燥，即为蚕蛹蛋白ACE抑制肽产品。

上述选用的离子液体为疏水性离子液体[Bmim]PF₆。

上述选用的蛋白酶为碱性蛋白酶。

有益效果：

1）首次利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽，其IC₅₀为0.079-0.205mg/mL，比传统酶解法（未预处理）所制的蚕蛹源ACE抑制肽的活性提高了34％－54％。

2）蚕蛹为缫丝工业副产物，原料价格低，且来源广泛，深入开发ACE抑制肽为蚕蛹资源的有效利用提供新途径。

3）生产简单，与传统工艺相比，超声波-离子液体耦合预处理后，蚕蛹蛋白酶解时间缩短。

附图说明

图1超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

采用乙酸乙酯萃取—比色法测定ACE抑制活性（Muguerza B,Ramos M,Sánchez E,et al.Antihypertensive activity of milk fermented by Enterococcus faecalis strains isolated from raw milk [J].International Dairy Journal,2006,16(1):61-69.），具体方法如下：

将10μL样品溶液与10μL ACE溶液在37℃下预热5min，加入45μL5mmol/L HHL溶液，在37℃反应30min，反应结束后立即加入85μL1mol/L HCl溶液终止反应；在反应液中加入1mL乙酸乙酯，振荡2min后，4000r/min离心10min，取出800μL有机相溶液转入玻璃管中，在100℃下蒸发30min，蒸发后的残渣中加入800μL双蒸水，混匀后在228nm下测定吸光度，每个样品重复3次。另以双蒸水代替样品作为空白。按下式计算ACE抑制活性：

I＝（A－C）/（A－B）×100%

式中，I—ACE抑制率；A—空白组的吸光度；B—反应体系中没有加入ACE时的吸光度；C—反应体系中有ACE和样品时的吸光度。

实施例1

按照液料比20mL/g将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将24kHz超声波的探头浸入水相中，开启超声波，预处理温度控制在25℃，超声波间歇比为1:1，超声波功率为300W，预处理时间为20min，预处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白并回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白用蒸馏水洗涤，离心，直至除去残留离子液体为止，预处理好后的蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成底物浓度1.0％（w/v，g/mL）溶液，在酶解温度45℃、酶解pH8.0、加酶量2000U/g的条件下用碱性蛋白酶（诺维信食品级alcalase2.4L）水解20min，酶解结束后沸水浴灭酶，离心，上清液经浓缩后冷冻干燥即为蚕蛹蛋白ACE抑制肽；利用乙酸乙酯萃取—比色法测定不同浓度蚕蛹蛋白ACE抑制肽的活性，经线性回归确定蚕蛹蛋白ACE抑制肽的IC₅₀值为0.135mg/mL，比相同酶解条件下未处理的ACE抑制活性（IC₅₀为0.296mg/mL）提高了54％。

实施例2

按照液料比27mL/g将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将24kHz超声波的探头浸入水相中，开启超声波，预处理温度控制在30℃，超声波间歇比为1:1，超声波功率为406W，预处理时间为32min，预处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白并回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白用蒸馏水洗涤，离心，直至除去残留离子液体为止，预处理好后的蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成底物浓度2.5％（w/v，g/mL）溶液，在酶解温度50℃、酶解pH8.5、加酶量3000U/g的条件下用碱性蛋白酶（诺维信食品级alcalase2.4L）水解30min，酶解结束后沸水浴灭酶，离心，上清液经浓缩后冷冻干燥即为蚕蛹蛋白ACE抑制肽；利用乙酸乙酯萃取—比色法测定不同浓度蚕蛹蛋白ACE抑制肽的活性，经线性回归确定蚕蛹蛋白ACE抑制肽的IC₅₀值为0.079mg/mL，比相同酶解条件下未处理的ACE抑制活性（IC₅₀为0.163mg/mL）提高了52％。

实施例3

按照液料比40mL/g将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，然后与等体积离子液体混合加入到烧杯中，将24kHz超声波的探头浸入水相中，开启超声波，预处理温度控制在35℃，超声波间歇比为1:1，超声波功率为500W，预处理时间为40min，预处理结束后，离心，收集蚕蛹蛋白并回收离子液体，收集的蚕蛹蛋白用蒸馏水洗涤，离心，直至除去残留离子液体为止，预处理好后的蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成底物浓度5.0％（w/v，g/mL）溶液，在酶解温度55℃、酶解pH9.0、加酶量4000U/g的条件下用碱性蛋白酶（诺维信食品级alcalase2.4L）水解40min，酶解结束后沸水浴灭酶，离心，上清液经浓缩后冷冻干燥即为蚕蛹蛋白ACE抑制肽；利用乙酸乙酯萃取—比色法测定不同浓度蚕蛹蛋白ACE抑制肽的活性，经线性回归确定蚕蛹蛋白ACE抑制肽的IC₅₀值为0.205mg/mL，比相同酶解条件下未处理的ACE抑制活性（IC₅₀为0.311mg/mL）提高了34％。

利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。