专利摘要
利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法，先将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，利用均质机均质后，与内切酶一起加入到酶膜反应器中进行连续制备抗氧化肽，酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和内切酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集，经浓缩后喷雾干燥，即得到粉末状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。本发明所得到的蚕蛹蛋白抗氧化肽具有良好的活性，其清除DPPH自由基的IC50为0.9-1.6mg/mL，清除羟自由基能力的IC50为0.2-0.6mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50为1.4-2.7mg/mL。
权利要求
1.利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征为：先将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，利用均质机均质后，与内切酶一起加入到酶膜反应器中进行连续制备抗氧化肽，酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和内切酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集，经浓缩后喷雾干燥，即得到粉末状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。
2.根据权力要求1所述的利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于：将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成1.0％～4.0％（w/v）溶液，均质后调节其pH至6.0－7.5，加热至40℃－60℃后和内切酶一起加入到反应罐中，搅拌均匀后进行酶膜反应，加酶量为2000-6000U/g，pH为6.0－7.5，温度为40℃－60℃，超滤膜的截留分子量为3-10kDa，超滤压力为0.6-0.9kg/cm2，出肽速率为4-6mL/min；酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和内切酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集得蚕蛹蛋白抗氧化肽；同时，在酶膜反应过程中依据酶解产物透过液中肽的浓度，在反应罐中补充相同浓度的蚕蛹蛋白溶液。
3.根据权力要求1所述的利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于：将酶膜反应的透过液用真空浓缩至肽含量8％（w/v），在进风温度190℃-220℃和出风温度90℃-110℃下进行喷雾干燥，即得到粉状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。
4.根据权力要求1或2所述的利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于：选用的内切酶为中性蛋白酶。
说明书
技术领域
本发明涉及食品生物化学领域，可作为功能性添加剂用于食品、化妆品和药物，具体涉及一种利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法。
背景技术
自由基与人类许多慢性疾病如癌症、冠状动脉心脏病和老年痴呆症等有关，因此，清除体内自由基能够提高机体对疾病的抵抗和预防能力，目前已引起社会各界的广泛关注。人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚（BHA）和2,6-二叔丁基对甲基酚等（BHT）常被作为食品添加剂用于保鲜，但人工合成的抗氧化剂对人类健康具有一定的危害，因而，开发高效、安全的抗氧化剂成为人们研究的热点。抗氧化肽作为生物活性肽的一种，具有成本低、效果好和食用安全等特性，适宜作为人类保健的抗氧化剂使用。现已从麦胚蛋白、燕麦蛋白、花生蛋白和胶原蛋白等食源蛋白中获得了大量高活性的抗氧化肽。
蚕蛹中蛋白含量约为60%左右，氨基酸种类齐全，组成合理，但因其在缫丝过程中受到热和碱液处理，蛋白不仅具有异味，而且蛋白严重变性，因而限制了蚕蛹蛋白在工业中的应用。现主要被作为饲料使用，经济价值极低。开发蚕蛹蛋白抗氧化肽对有效利用蚕蛹资源具有重要意义。中国专利CN102690322A（申请公布号）中公开了一种蚕蛹蛋白酶解抗氧化肽的脱色方法，脱色后的蚕蛹蛋白抗氧化肽可用于保健食品行业。王伟等报道了利用双酶分步法制备蚕蛹蛋白抗氧化肽，所得的酶解产物具有良好的清除DPPH自由基和羟自由基的能力（王伟，王楠，周兵，等．双酶分步酶解蚕蛹蛋白及其产物抗氧化活性的研究[J]．浙江农业学报，2012，24(2):300-304）。李高扬等利用Sephadex G-25凝胶层析法从蚕蛹蛋白的胃蛋白酶水解产物中分离得到一种具有抗氧化活性的多肽，其分子量为892Da，含有酪氨酸残基（李高扬.蚕蛹抗氧化多肽的制备及分离纯化研究[D].2011，广州：华南理工大学）。由此可以看出，蚕蛹蛋白适宜制备抗氧化肽。
现有研究均是采用间歇酶解法制备蚕蛹蛋白抗氧化肽，该方法存在蛋白酶利用率低、生产周期长、产物质量不稳和劳动强度大等缺点，不宜工业化生产。酶膜反应器能够很好地解决这些不足，现关于使用酶膜反应器制备抗氧化肽的报道不多，仅有专利“不补料酶解-膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法（申请号：201010188410.5）”和“一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法（申请号：201110112515.7）公开报道，尚未有利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的报道。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是提供一种利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法。
技术方案：利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法，先将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成悬浮液，利用均质机均质后，与内切酶一起加入到酶膜反应器中进行连续制备抗氧化肽，酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和内切酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集，经浓缩后喷雾干燥，即得到粉末状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。
具体步骤为：将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成1.0％～4.0％（w/v，g/mL）溶液，均质后调节其pH至6.0－7.5，加热至40℃－60℃后和内切酶一起加入到反应罐中，搅拌均匀后进行酶膜反应，加酶量为2000-6000U/g，pH为6.0－7.5，温度为40℃－60℃，超滤膜的截留分子量为3-10kDa，超滤压力为0.6-0.9kg/cm2，出肽速率为4-6mL/min；酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和内切酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集得蚕蛹蛋白抗氧化肽；同时，在酶膜反应过程中依据酶解产物透过液中肽的浓度，在反应罐中补充相同浓度的蚕蛹蛋白溶液。
将酶膜反应的透过液用真空浓缩至肽含量8％（w/v，g/mL），在进风温度190℃-220℃和出风温度90℃-110℃下进行喷雾干燥，即得到粉状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。
上述内切酶选用中性蛋白酶。
采用清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力和螯合亚铁离子能力评价蚕蛹蛋白抗氧化肽的抗氧化活性，具体方法如下：
1）清除DPPH自由基能力的测定（Amarowicz R,Naczk M,Shahidi F.Antioxidant activity of various fractions of non-tanin phenolics of canola hulls[J].J Agric Food Chem,2000,48:2755-2759）
在2mL样品中加入2mL浓度为0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液，混匀后室温反应20min，3500r/min离心10min，取上清液，在517nm测其吸光值；另取2mL样品，加入2mL无水乙醇，混匀后室温反应20min，3500r/min离心10min，取上清液，在517nm测其吸光值；以2mL0.04g/L DPPH无水乙醇溶液和2mL无水乙醇混合液做为参比，在517nm测其吸光值，计算公式如下：
K=[1－(Ai－Aj)/A0]×100
式中K—DPPH自由基清除率，%；A0—2mL0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液加2mL无水乙醇的吸光值；Ai—2mL0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液加2mL样品的吸光值；Aj—2mL无水乙醇加2mL样品的吸光值。
2）清除羟自由基能力的测定（徐怀德，闫宁环，陈伟，等．黑莓原花青素超声波辅助提取优化及抗氧化性研究[J]．农业工程学报，2008,24(2):264-269．）
取2mL样品溶液，分别加入2mL6mmol/L FeSO4和2mL6mmol/L H2O2，混匀后静置10min，再加入2mL6mmol/L水杨酸，混匀后静置30min，在510nm处测其吸光值。按照下式计算羟自由基（·OH）的清除率：
式中Y—羟自由基的清除率，%； —样品参与反应的吸光值； —无样品参与反应的吸光值； —无水杨酸参与的样品反应的吸光值。
3）螯合Fe2+能力测定（Lee Y L,Yen M T,Mau J L.Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus[J].Food Chemistry,2007,104:1-9）
取1mL样品溶液，加入3.7mL双蒸水，然后加入0.1mL2mmol/L的FeCl2溶液，混匀后加入0.2mL5mmol/L的Ferrozine溶液，混匀后静置10min。在562nm下测定吸光值。按照下式计算Fe2+的螯合率：
螯合率=（1－A″/A″0）×100％
式中A″—样品参与反应的吸光值；A″0—空白吸光值。
有益效果：
1）首次利用连续酶膜反应技术制备蚕蛹蛋白抗氧化肽，实现了酶解产物在线及时分离，避免酶解产物因过度酶解而活性降低。
2）实现了蛋白酶循环利用，提高了蛋白酶的利用效率。
3）避免了传统酶解工艺中灭酶工序，实现了连续性制备蚕蛹蛋白抗氧化肽，降低了劳动强度。
4）蚕蛹蛋白为农副产品，价格低，且来源广泛。
5）本发明所得到的蚕蛹蛋白抗氧化肽具有良好的活性，其清除DPPH自由基的IC50为0.9-1.6mg/mL，清除羟自由基能力的IC50为0.2-0.6mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50为1.4-2.7mg/mL。
附图说明
图1酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的工艺流程图；
图2本发明所用的酶膜反应器结构示意图：1－原料储存罐；2－蛋白酶储存罐；3－碱液储存罐；4－pH检测器；5-储存罐恒温水浴；6－反应罐；7-反应罐恒温水浴；8－搅拌器；9－泵；10-压力表；11－超滤膜组件；12－透过液储存罐；13－控制阀。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例所用的酶膜反应器，如图2所示通过管道连接各单元，包括原料储存罐1、蛋白酶储存罐2和碱液储存罐3，其中原料储存罐设于储存罐恒温水浴5中，三个储存罐分别与反应罐6连接，所述反应罐内设有搅拌器8和pH检测器4探头，罐体设于反应罐恒温水浴7中，反应罐出料口与超滤膜组件11进口连接，连接管道上设有泵9和压力表10，超滤膜组件设有两个出口，其中回流出口与反应罐连接，连接管道上设有控制阀13，另一个出口与透过液储存罐12连接。
实施例1
将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成1.0％（w/v,g/mL）溶液，均质后调节其pH至6.0，加热至40℃后和中性蛋白酶一起加入到反应罐中，搅拌均匀后进行酶膜反应，加酶量为2000U/g，pH为6.0，温度为40℃，超滤膜的截留分子量为3kDa，超滤压力为0.6kg/cm2，出肽速率为6mL/min；酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和中性蛋白酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集；同时，在酶膜反应过程中依据酶解产物透过液中肽的浓度，在反应罐中补充相同浓度的蚕蛹蛋白溶液。收集的酶解产物透过液用真空浓缩装置浓缩至肽含量8％（w/v,g/mL）左右，在进风温度190℃和出风温度90℃下进行喷雾干燥，即得到粉状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。该抗氧化肽产品的抗氧化活性为：清除DPPH自由基的IC50是1.2mg/mL，清除羟自由基能力的IC50为0.4mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50为1.9mg/mL。
实施例2
将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成2.0％（w/v,g/mL）溶液，均质后调节其pH至6.5，加热至50℃后和中性蛋白酶一起加入到反应罐中，搅拌均匀后进行酶膜反应，加酶量为4000U/g，pH为6.5，温度为50℃，超滤膜的截留分子量为5kDa，超滤压力为0.8kg/cm2，出肽速率为5mL/min；酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和中性蛋白酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集；同时，在酶膜反应过程中依据酶解产物透过液中肽的浓度，在反应罐中补充相同浓度的蚕蛹蛋白溶液。收集的酶解产物透过液用真空浓缩装置浓缩至肽含量8％（w/v,g/mL）左右，在进风温度200℃和出风温度100℃下进行喷雾干燥，即得到粉状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。该抗氧化肽产品的抗氧化活性为：清除DPPH自由基的IC50是0.9mg/mL，清除羟自由基能力的IC50为0.2mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50为1.4mg/mL。
实施例3
将蚕蛹蛋白用蒸馏水配制成4.0％（w/v,g/mL）溶液，均质后调节其pH至7.5，加热至60℃后和中性蛋白酶一起加入到反应罐中，搅拌均匀后进行酶膜反应，加酶量为6000U/g，pH为7.5，温度为60℃，超滤膜的截留分子量为10kDa，超滤压力为0.9kg/cm2，出肽速率为4mL/min；酶解产物溶液透过超滤膜，未完全反应的蚕蛹蛋白和中性蛋白酶被截留后重新流至反应罐中继续反应，透过超滤膜的酶解产物透过液被收集；同时，在酶膜反应过程中依据酶解产物透过液中肽的浓度，在反应罐中补充相同浓度的蚕蛹蛋白溶液。收集的酶解产物透过液用真空浓缩装置浓缩至肽含量8％（w/v,g/mL）左右，在进风温度220℃和出风温度110℃下进行喷雾干燥，即得到粉状蚕蛹蛋白抗氧化肽产品。该抗氧化肽产品的抗氧化活性为：清除DPPH自由基的IC50是1.6mg/mL，清除羟自由基能力的IC50为0.6mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50为2.7mg/mL。
利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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