专利摘要

本发明涉及一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株及胞外多糖和挥发性风味物质，该菌种命名为WGK2-1，菌株的分类名称：白地霉(Geotrichum candidum)，本发明利用平板梯度涂布分离法，从传统发酵乳制品中筛选出的WGK2-1菌株，以牛乳为培养基，在25-35℃培养，能产生大量的胞外多糖，可以作为酸乳发酵剂发酵牛乳，并能够产生多种挥发性风味物质。本发明筛选出的高产胞外多糖菌株WGK2-1是一株产香菌株，能产生多种挥发性香气成分，所产生的挥发性风味物质主要是酯类及酸类，它们能有效地提高牛乳中呈香型物质的种类和含量，减少醛、酮类物质的种类和含量，改善发酵乳的风味。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种新筛选的菌种，尤其是一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株及胞外多糖和挥发性风味物质。

背景技术

白地霉(Geotrichum candidum)是一种常见真菌，属于半知菌亚门、丛梗孢科、卵形孢霉族、地霉属。白地霉的形态特征介于酵母菌和霉菌之间，繁殖方式以裂殖为主，少数菌株间有芽生孢子。生长温度范围在5～38℃，生长pH范围在3～11，具有广泛的生态适应性。单株白地霉具有一定程度的表型可变性，同种内不同菌株呈现遗传多态性，菌落颜色从白色到奶油色，少数菌株为浅褐色或深褐色，质地从油脂到皮膜状。

20世纪50～70年代，国内对白地霉的研究主要集中在代谢途径、菌体营养价值、食用安全性等方面。目前，国内外已有应用白地霉作为商品的报道(如奶酪的后熟发酵剂、饲料蛋白、香味添加剂等)，但未见以白地霉作为酸乳发酵菌发酵牛乳以及发酵牛乳生产胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)方面的研究，本专利报道了一株高产胞外多糖的白地霉，能够单独发酵牛乳或者和乳酸菌协同发酵牛乳制备酸乳，并具有较好的产香能力。

微生物胞外多糖是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的则进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。微生物胞外多糖除具有抗癌作用外，还能够促进菌体在肠道粘膜上的吸附，对肠道的调节和对肠道有益菌的定植起到重要作用，对免疫系统也起到促进作用，能促进特异性和非特异性免疫反应，促进T淋巴细胞的增殖等。由于胞外多糖独特的物理学特性及其良好的流变学特性，并且安全无毒，已被广泛用于许多领域。许多研究指出，微生物胞外多糖可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填充剂和持水剂应用到食品、制药、石油化工以及生化产品等领域。

目前，世界上香精和香料的生产主要是人工合成或从天然动植物中提取。随着人类回归自然，崇尚天然食品，对食用安全的生物香精、香料的需求日益增加，尽管从动植物中提取的天然香精、香料可以满足这种安全性的需求，但天然动植物香料受原料来源等限制，使天然香料的开发和应用受到影响。因此，利用微生物开发和生产香料物质，可为天然香料的生产开辟了新方向，因此，部分白地霉菌株具有产香的特性受到各国学者的关注。

研究显示，白地霉产香化合物的形成机制有多种解释：分解氨基酸产生多种化合物，对香气化合物的形成有很大贡献。Gripon等发现，白地霉具有转化含硫氨基酸形成多种硫化物的能力，对奶酪典型香气的形成起重要作用；分解脂肪及合成脂肪酸酯而形成香气化合物。Jollivet等研究发现，白地霉脂肪酶分解脂肪产生多种挥发性化合物，如乙醇、低分子脂肪酸、甲基酮、丙脂以及油脂等，这些化合物被认为是合成香气化合物的前体物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株及胞外多糖和挥发性风味物质，该菌株产香性能优良且能够高产胞外多糖，能产生多种挥发性香气成分，所产生的挥发性风味物质主要是酯类及酸类，它们能有效地提高牛乳中呈香型物质的种类和含量，减少醛、酮类物质的种类和含量，改善发酵乳的风味。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株，菌株的名称WGK2-1，分类命名为：白地霉Geotrichum candidum，保存编号为：CGMCC No.5259，保藏日期：2011年09年20日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述白地霉高产胞外多糖，其胞外多糖产量为：341.6mg/L。

一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株作为酸乳发酵菌的用途。

一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株发酵牛乳的方法将活化后的白地霉按5％--10％接种量接于全脂牛乳中，25-35℃静置培养至牛乳凝固，4℃保持12h，得到酸乳。

一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株与乳酸菌混合发酵牛乳的方法，将活化后的白地霉及乳酸菌分别按5％--10％接种量接于全脂牛乳中，25-35℃静置培养至牛乳凝固，得到酸乳。

而且，所述乳酸菌为乳酸菌WG3-9，菌株的分类名称：乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus.Lactis subsp cremaris，保存编号为：CGMCC No.5260，保藏日期为：2011年09年20日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一种胞外多糖，由高产胞外多糖的产香白地霉菌株发酵获得。

而且，发酵方法如下：将活化后的白地霉WGK2-1按5％--10％接种于含全脂牛乳培养基中，25-35℃静置培养至牛乳凝固，得到胨化牛乳，将其进行多糖分离即获得胞外多糖。

一种挥发性风味物质，由高产胞外多糖的产香白地霉菌株发酵获得。

本发明的优点和积极效果如下：

1.本发明筛选出的高产胞外多糖菌株WGK2-1能够高产胞外多糖，其含量可达341.6mg/L。

2.本发明筛选出的高产胞外多糖菌株WGK2-1是一株产香菌株，能产生多种挥发性香气成分，所产生的挥发性风味物质主要是酯类及酸类，它们能有效地提高牛乳中呈香型物质的种类和含量，减少醛、酮类物质的种类和含量，改善发酵乳的风味。

3.本发明筛选出的高产胞外多糖菌株WGK2-1是一种新型的酸乳发酵剂，能够单独发酵牛乳或者和乳酸菌协同发酵牛乳制备酸乳，得到胞外多糖含量较高，且口感、质地和风味俱佳的酸乳。

附图说明

图1为本发明白地霉WGK2-1在麦芽汁琼脂培养基上的菌落照片；

图2为本发明白地霉WGK2-1的电子显微镜照片；

图3为本发明白地霉WGK2-1产生的挥发性香气成分GC-MS图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

麦芽汁培养基：麦芽烘干粉碎后加入4倍量自来水，放入60℃恒温箱中，糖化至糖度为12°Bx，过滤得麦芽汁培养基。

孟加拉红固体培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，琼脂15g，1/3000的孟加拉红溶液100mL，氯霉素0.1g，蒸馏水加至1000mL，自然pH。

YPD培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂15g。

全脂牛乳：全脂乳粉溶于蒸馏水中，浓度为100g/L。

一、菌株的分离与鉴定

1.样品稀释液制备及菌株分离

菌株分离样品为新疆伊犁地区哈萨克族牧民自制传统发酵乳制品，鲜奶疙瘩。

样品充分混匀后取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1∶10的悬浮液。

吸取1∶10样品悬浮液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品悬浮液。另吸取1mL1∶10样品悬浮液按上述操作顺序，做10倍稀释样品悬浮液。

根据待检样品活菌总数的估计，选择2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品悬浮液分别置于2个麦芽汁琼脂平板，孟加拉红琼脂平板，PDA培养基。30℃培养48h。

2.菌株初筛

接种针挑取平板上的单菌落，在新的相同的平板上进行划线接种，平板纯化2代后，斜面保藏并进行菌落形态观察及显微镜观察。

3.菌株复筛

3.1凝乳实验

用接种环挑取斜面上的单菌落，划线接种于相应的琼脂平板上，30℃培养48 h进行活化，再接种于含5mL全脂牛乳的试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，按5％--10％接种量接种于含100mL全脂牛乳的三角瓶中，30℃静置培养至牛乳凝固。观察并记录凝乳状态。

3.2粘度的测定

粘度的测定：采用流变仪(博力飞公司DV-III+型)。在4℃下测试粘度，转子型号为RV5，分别在16r/min的速度下测定三次，每15s取值一次，每个样品做两个平行试样，结果计算算术平均值。

3.3感官评定

如表1所示，通过感官评定，得到一株凝乳效果、粘度和风味均较好的菌株命名为WGK2-1。

表1  复筛菌株特性评价结果

4.菌株的鉴定

4.1形态观察

观察平板上菌落形态，并用光学显微镜及电子显微镜进行观察。结果显示：菌落在麦芽汁培养基表面形成圆形、绒毛状的巨大菌落，表面灰白色，菌落中心突起，(说明书附图，图1)；电子显微镜显示：白地霉孢子呈链状排列，大小为(5～8)μm×4μm，孢子之间呈平切状，菌丝及孢子在电镜下呈无色半透明(说明书附图，图2)。

4.2 18s rDNA鉴定

挑取麦芽汁琼脂平板上的WGK2-1菌落，加入麦芽汁培养基中，30℃摇菌培养过夜，取1mL菌液，5000×g离心5min，弃上清液，在沉淀中加入300μL细胞裂解液，加10μL蛋白酶K，56℃水浴1h。100℃煮10min后，12000×g离心10min，取上清液做PCR反应。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：GTAGTCATATGCTTGTCTC

下游引物：TCCGCAGGTTCACCTACGGA

PCR产物纯化后送交英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

测得WGK2-1菌株的18s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

测序结果用BLAST程序与美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的真菌18s rDNA进行比对，结果显示，WGK2-1菌株的18s rDNA序列与白地霉(Geotrichum candidum)的同源性大于99％。

由以上鉴定结果可知，WGK2-1菌株为白地霉(Geotrichum candidum)。该菌已于2011年09月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.5259。

二、白地霉WGK2-1单独发酵牛乳制备酸乳

1.酸乳的制备

将保藏于麦芽汁培养基斜面中的白地霉WGK2-1，用接种环接入灭菌脱脂牛乳培养基中，30℃培养48h进行活化。活化后的菌接种入5mL全脂牛乳试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，按5％-10％的接种量接种于100mL全脂牛乳三角瓶中，30℃静置培养至牛乳凝固，4℃保持12h，得到酸乳。

2.酸乳理化指标测定

2.1酸乳凝乳时间的测定

活化后的菌接种于含5mL全脂牛乳的试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，记录凝乳时间，做三组平行实验，取平均值。

实验测得菌株WGK2-1凝乳时间为12h。

2.2酸乳粘度的测定

采用流变仪(博力飞公司DV-III+型)。在4℃下测试粘度，转子型号为RV5，分别在16r/min的速度下测定三次，每15s取值一次，每个样品做两个平行试样，计算算术平均值。

实验测得菌株WGK2-1发酵所得的酸乳粘度为8100mPa·s。

2.3酸乳滴定酸度的测定

根据GB/T5009.46-1996，称量10g酸乳样品，置于100mL三角瓶中，加入20mL水，再加入0.5mL 0.5％的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在1min内不消失为止。消耗的0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度(°T)，取三次测定的算术平均值。

实验测得菌株WGK2-1发酵所得的酸乳酸度为87°T。

2.4持水力的测定

取酸乳样品20g，在10℃下，10000g离心30min，倾去上清物，使离心管保持倒置状态10min，结束后立即称重，每个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。

酸乳的持水力＝离心沉淀物重量/样品重量×100％

实验测得菌株WGK2-1发酵所得的酸乳持水力为30.5％。

2.5酸乳脱水收缩敏感性的测定

在6℃下，将50g凝固成熟后的酸乳小心倾入带有120目不锈钢丝网的大漏斗中，用100mL量筒收集沥出的乳清。收集时间为2h，最后对收集的乳清称重，每个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。

酸乳胶体脱水收缩作用敏感性＝乳清析出量/样品重量×100％。

实验测得菌株WGK2-1发酵所得的酸乳脱水收缩敏感性为21.8％。

三、白地霉与乳酸菌协同发酵牛乳制备酸乳

1.白地霉和乳酸菌协同发酵酸乳的制备

嗜温乳酸菌WG3-9→接种于脱脂牛乳30℃活化24h→接种于无菌脱脂乳30℃培养至凝乳；白地霉→孢子悬浮液→接种于5mL无菌脱脂乳→30℃，200r/min，48h；将白地霉与乳酸菌WG3-9按体积比5∶95，按总接种量5％-10％接种于无菌全脂牛乳中，30℃发酵至牛乳凝固，4℃后酵12h，即得到混合发酵酸乳。

2.白地霉和乳酸菌协同发酵酸乳理化指标测定

2.1凝乳时间的测定

活化后的菌接种于含5mL全脂牛乳的试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，记录凝乳时间，做三组平行实验，取平均值。

实验测得菌株WGK2-1与乳酸菌WG3-9混合发酵酸乳凝乳时间为8h。

2.2酸乳粘度的测定

采用流变仪(博力飞公司DV-III+型)。在4℃下测试粘度，转子型号为RV5，分别在16r/min的速度下测定三次，每15s取值一次，每个样品做两个平行试样，计算算术平均值。

实验测得菌株WGK2-1与乳酸菌WG3-9混合发酵所得的酸乳粘度为8300mPa·s。

2.3酸乳滴定酸度的测定

根据GB/T5009.46-1996，称量10g酸乳样品，置于100mL三角瓶中，加入20mL水，再加入0.5mL 0.5％的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在1min内不消失为止。消耗的0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度(°T)，取三次测定的算术平均值。

实验测得菌株WGK2-1与乳酸菌WG3-9混合发酵所得的酸乳酸度为85°T。

2.4持水力的测定

取酸乳样品20g，在10℃下，10000g离心30min，倾去上清物，使离心管保持倒置状态10min，结束后立即称重，每个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。

酸乳的持水力＝离心沉淀物重量/样品重量×100％

实验测得菌株WGK2-1发酵所得的酸乳持水力为34.5％。

2.5酸乳脱水收缩敏感性的测定

在6℃下，将50g凝固成熟后的酸乳小心倾入带有120目不锈钢丝网的大漏斗中，用100mL量筒收集沥出的乳清。收集时间为2h，最后对收集的乳清称重，每个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。

酸乳胶体脱水收缩作用敏感性＝乳清析出量/样品重量×100％。

实验测得菌株WGK2-1发酵所得的酸乳脱水收缩敏感性为20.6％。

四、白地霉WGK2-1胞外多糖的制备

1.胨化牛乳的制备

用接种环挑取斜面上的单菌落，划线接种于麦芽汁琼脂平板上，30℃培养48h进行活化。活化后的菌接种于含5mL全脂牛乳的试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，按5％--10％接种量接种于含100mL全脂牛乳的三角瓶中，30℃静置培养至牛乳凝固，得到胨化牛乳。

2.胞外多糖的提取

(1)等电点法除酪蛋白：用饱和NaOH调样液pH至8.0，4000r/min离心15min，上清液用HCL调节pH至4.6，3000×g离心15min。

(2)酶解：调pH至7.5，加入1/10体积的胰酶液(浓度为3g/L，现配现用)，40℃水浴酶解2.5h后，2000×g离心15min。

(3)Sevag脱蛋白：加入1/3体积的Sevag液振荡30min，3000×g离心15min，去除沉淀，重复三次。

(4)乙醇沉淀：加入3-5倍体积的95％的乙醇，充分振荡(多糖称絮状沉淀析出)，3000×g离心15min，收集沉淀。

(5)洗涤干燥：将沉淀用丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得粗多糖。

3.粗多糖纯度测定

采用苯酚-浓硫酸法测定胞外多糖含量，用葡萄糖作标准曲线。

准确吸取葡萄糖标准溶液(1.0mg/mL)，0.050，0.060，0.070，0.080，0.090，0.10，0.12mL(相当于葡萄糖0.00，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0，100.0，120.0μg)，及各样品备用液0.1mL置于10mL比色管中，用蒸馏水补足1.0mL，分别加入1.0mL 5.0％苯酚水溶液，摇匀后静止2min，迅速加入5mL浓硫酸，静止10min后置于30℃温度水浴中加热15min，取出置冷水中冷却，以空白管为对照，用紫外分光光度计在波长490nm处测定光密度。以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算胞外多糖含量。

测得该菌株胞外多糖产量为341.6mg/L。

五、白地霉WGK2-1生产香气成分的气--质分析

采用气相色谱-质谱联用仪对白地霉WGK2-1产生的挥发性风味物质进行测定(图3)。

气相色谱条件：色谱柱型号：VF-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；载气：He，99.999％；初始温度40℃，保持3min，以4℃/min，升至150℃，保持1min，再以8℃/min升至250℃，保持6min。

质谱条件：质量分离器：离子阱；离子源：EI；电离能量：70eV；离子阱温度：220℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间1min。

扫描方式：全扫描；扫描范围：50-500m/z；检索谱库：NISTO5。

测定结果如表2所示，GC-MS共检测到29种化合物(共31个峰，其中有两种化合物有两个峰)，相比牛乳自身具有的挥发性化合物，白地霉WGK2-1产生了12种化合物，其中酸类7种，酯类2种，醇类2种，醛类1种。从面积比上来看，含量最高的是己酸正丙酯(47.91％)，其次是辛酸(15.72％)，癸酸(13.656％)，月桂酸(8.172％)，丁酸(1.672％)，(R)-4-甲基己酸(1.226％)。由此可见，白地霉WGK2-1所产生的挥发性风味物质主要是酯类及酸类，它们能有效地提高牛乳中呈香型物质的种类和含量，减少醛、酮类物质的种类和含量，改善发酵乳的风味。

表2  白地霉WGK2-1 CGMCC No.5259产生的挥发性香气成分GC-MS分析结果

一种高产胞外多糖的产香白地霉菌株及胞外多糖和挥发性风味物质专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。