专利摘要

本发明涉及一种降解废弃蓖麻基润滑油及矿物油的M-4菌株，其特征在于：M-4菌株的分类名称：链格孢Alternaria sp.，保藏编号为：CGMCC No.4933，保藏日期：2011年06年10日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明利用平板梯度涂布分离法，从蓖麻榨油车间排污口附近采取土样和水样，筛选出能以蓖麻基润滑油为唯一碳源生长的微生物，该方法操作简便快捷，筛选出的降解蓖麻基润滑油的M-4菌株生长速度快，在最适培养温度和pH条件下，有利于扩大培养，制成菌种发酵剂，投放到污染环境中进行生态修复。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其是一种降解废弃蓖麻基润滑油及矿物油的M-4菌株。

背景技术

随着全球经济的快速发展，每年都要消耗大量的石油产品，除作为汽、柴油等成品油使用外，很大一部分用于不同领域的润滑油。在使用过程中，润滑油不可避免地通过泄漏、溢出或不恰当的排放等途径进入环境，由于其大部分不能被生物降解，并具有一定的生态毒性，严重污染土壤和水资源，破坏生态环境和生态平衡。据统计，全世界每年约有500～1000万吨石油基化学品进入生物圈，仅欧共体每年就有60万吨润滑油进入环境。在我国，废油的回收率不足10％，按此估算，每年至少有28～32万吨进入环境，造成极大的资源浪费和环境污染。据报道，矿物润滑油污染地下水的影响可达100年，微量的矿物油会阻碍植物的生长和毒害水生生物，约0.1μg/g的矿物油即可使水生壳类生物减寿20％。

目前，润滑油污染土壤的治理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括挖掘填埋法、气提吹脱法、电解法、洗涤法和隔离控制法等，主要采用热处理法，即通过焚烧或锻烧，净化土壤中大部分有机污染物，但同时亦破坏土壤结构和组分，且所用的燃料和设备价格昂贵，因此很难实施；化学法包括氧化剂氧化法、光化学氧化法、热分解法、萃取法和化学棚法等，采用化学浸出和水洗也可以获得较好的除油效果，但所用的化学试剂的二次污染问题限制了其应用。生物修复是指利用微生物及其它生物，将存在于土壤中的有毒、有害油品污染物在现场降解成二氧化碳和水或转化成为无害物质的工程技术，它是传统的生物处理法的延伸。生物修复由于能够大面积治理污染而成为一种新型可靠的环保技术，已得到世界环保部门的认可，并引起工业界的关注，其作用已越来越突出。生物修复的类型主要包括微生物对污染土壤的修复、植物对污染土壤的修复及微生物--植物的联合修复，其中微生物对润滑油污染土壤的生物修复是近年来科学家研究的重点。

为彻底解决废润滑油对环境造成的污染，很多国家都相继进行了环境兼容润滑油即可生物降解润滑油的研究。所谓可生物降解润滑油，又称绿色润滑油或环境友好润滑油，是指润滑油必须满足机器工况的要求，即使用性能；润滑油及其损耗产物对生态不造成危害，或在一定程度上为环境所容许，即良好生态效应，主要包括：可生物降解性、生物积聚性、毒性和生态毒性、损耗和可再生性，其中，生物降解性是反映其生态效应的最主要指标，创新废弃润滑油生物降解技术，建立有效评定方法对研究可降解性废润滑油具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能在广泛pH下生长、降解蓖麻基润滑油及矿物油的M-4菌株，是一种降解效率高，能以蓖麻基润滑油为唯一碳源生长的菌种。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种降解废弃蓖麻基润滑油及矿物油的M-4菌株，M-4菌株的分类名称：链格孢Alternaria sp.，保藏编号为：CGMCC No.4933，保藏日期：2011年06年10日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述M-4菌株对蓖麻基润滑油的降解率为80％-95％。

而且，所述M-4菌株使用的培养基配方为：KH₂PO₄ 3.4g/L，Na₂HPO₄ 1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.0g/L，MgSO₄ 0.7g/L，NaCl 1.6g/L，酵母粉0.01g/L，Tween-80 0.6mL，蓖麻基润滑油5.0g，自来水1L，pH 7.0～7.2。

而且，所述M-4菌株在pH39以蓖麻基润滑油为唯一碳源进行生长。

而且，所述M-4菌株降解矿物油包括废弃齿轮油、液压油。

本发明的优点和积极效果如下：

1.本发明利用平板梯度涂布分离法，从蓖麻榨油车间排污井口采取土样和水样中筛选出能以废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源进行生长的菌种，该方法操作简便快捷，能显著缩短菌株筛选时间。

2.本发明筛选出的降解废弃蓖麻基润滑油的M-4菌株，降解效率高，在最适培养温度和pH条件下，有利于扩大培养，制成菌种发酵剂，投放到污染地进行生态修复。

3.以本发明筛选的降解蓖麻基润滑油的M-4菌株为出发菌株，采用改良的CEC-M-43-A-93实验方法进行生物降解，在30℃，180r/min，避光条件下培养7d后，用四氯化碳进行萃取，采用IR在2930nm处检测CH₃-CH₂-中C-H-键的振动吸收峰，计算残余油量和降解率，本方法能缩短降解周期，从21d缩短到7d，与其他降解方法相比，实验效率大大提高。

附图说明：

图1为本发明M-4菌株在不同pH培养条件下的菌体干重曲线；

图2为本发明M-4菌株的菌落照片；

图3为本发明M-4菌株CEC法测试红外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明的技术路线为：将采集的土样和水样用无菌水制成悬浮液，采用平板梯度涂布法进行菌株分离，从中分离出降解效果较好的M-4菌株，采用改良的CEC-M-43-A-93方法进行降解实验，获得较好的降解效果。

一种降解废弃蓖麻基润滑油及矿物油的M-4菌株，其筛选步骤如下：

1.从蓖麻榨油车间排污井口采取土样和水样，采样所需工具均已灭菌；

2.菌株初筛：将采集的样品经24h曝气处理后，在无菌操作条件下取少量样品，加入50mL无菌水，搅拌，制成悬浮液，用移液枪取0.1mL悬浮液，放入以废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源的筛选培养基平板上(培养基：KH₂PO₄ 3.4g；Na₂HPO₄ 1.5g；(NH₄)₂SO₄ 4.0g；MgSO₄ 0.7g；NaCl 1.6g；酵母粉0.01g；Tween-800.6mL，蓖麻基润滑油5.0mL，自来水1000mL，pH 7.0～7.2)，用无菌涂布器连续涂布四个平板，置于30℃培养箱中培养2-3d，挑取生长较快和不同菌落形态的菌株，进一步分离纯化复筛，从中筛选出能以蓖麻基润滑油或废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源生长的菌种。

3.菌株复筛；将第一次挑选出的菌株分别接种在以蓖麻基润滑油为唯一碳源的平板筛选培养基上进行分离纯化，置于30℃培养箱中培养2-3d，观察结果，再挑选生长较快的不同单菌落，接种到斜面中，培养后获得M-4，于生物保藏中心保藏，将M-4菌株置于4℃冰箱保藏，待用。

4.M-4菌株的特性

(1)形态学观察及鉴定

根据菌落特征，显微镜观察，M-4菌株分生孢子梗呈褐色，气生菌丝呈棉毛状，发达，背面褐色，分手孢子单生或串生，椭圆形或倒棍棒形，大小不一，通常3-7个横隔，1-2个纵隔；经18s rDNA序列分析，初步鉴定为链格孢属。

(2)不同初始pH对M-4菌株生长的影响

在250mL三角瓶中装入50mL PDA培养基(称取去皮马铃薯200.0g，切成小块，加入1000.0mL自来水煮沸30min，用双层纱布滤成清液。补水至1000.0mL，加入20.0g葡萄糖完全溶解，pH自然)，将PDA培养基初始pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10，用无菌水冲洗孢子混匀后，按相同接种量接入培养瓶中，30℃，180r/min培养3d，取出后过滤，将菌丝体烘干至恒重，结果如图1所示。

将培养瓶培养3d后取出观察，M-4菌株在pH2和pH10的环境中不生长，在pH3的培养瓶长成小球状，在pH6的培养瓶长成大团海绵状的菌丝体，在其余培养瓶长成小绒毛状，颜色为深褐色，过滤后烘干至恒重。从图1可以看出，在初始pH5和pH7的培养瓶中菌丝体生长最旺盛。

5.生物降解性的测定

(1)矿物培养基：KH₂PO₄ 3.4g；Na₂HPO₄ 1.5g；(NH₄)₂SO₄ 4.0g；MgSO₄ 0.7g；NaCl 1.6g；酵母粉0.01g；Tween-800.6mL，自来水1000mL，pH 7.0～7.2。

(2)锥形瓶的准备

中性瓶：100mL矿物培养基+1mL种子菌液

测试瓶：100mL矿物培养基+1mL种子菌液+1mL废弃蓖麻基润滑油

毒化瓶：100mL矿物培养基+1mL废弃蓖麻基润滑油

(3)测试烧瓶数量的确定

M-4菌株活化后进行蓖麻基润滑油的生物降解试验，从种子培养基中吸取1mL种子液，接入到步骤(2)中需要添加菌液的锥形瓶中，30℃，180r/min振荡器中暗室培养7d。

测试烧瓶最小数量列于表1中。

表1生物降解性试验所需烧瓶数量及分配

注：“0d”烧瓶应该在试验开始后再准备，并立即对其进行萃取

(4)破乳和破细胞壁

培养期结束后，在各锥形瓶中加入约1mL HCl和20g NaCl，摇瓶振荡，待NaCl完全溶解后，采用超声波细胞破碎仪将培养基中的微生物细胞壁破碎，使内容物释放及进一步破乳。间歇式超声波破碎条件：200W，2min，工作2s，停止1s，破碎后待三角瓶内溶液温度冷却至室温后再进行分离萃取。

(5)萃取

将培养液在10000r/min离心10min，沉淀去细胞，取上清液，将各样品倒入250mL分液漏斗中，分三次加入四氯化碳进行萃取，每次加入量为30mL，剧烈摇动1～2min，经常开启活塞排气；静置至分层后，将分液漏斗中的溶液从上口倒出，将下层有机相溶液倒入装有无水硫酸钠的小烧杯中除水，转移至25mL容量瓶中，静置24h后，置入10mm光路长的IR室，测量CH₃-CH₂-的C-H伸缩振动吸收峰(在2930±10cm^-1)峰高的红外光谱。

(6)IR分析及生物降解率计算

用红外光谱分析仪测定萃取液，波长范围2500～3500cm^-1，对装样的石英比色皿进行扫描，对2930±10cm^-1处吸收峰的吸光度进行分析，测定各毒化瓶和测试瓶(E烧瓶)萃取液的IR吸收，以下式计算残余油含量：

生物降解率按下式计算：

式中P：毒化瓶中残余油含量，％(平均值)

T：测试瓶中残余油含量，％(平均值)

采用红外谱图的方法鉴定四氯化碳中的C-H含量，用四氯化碳做空白，确保萃取剂中没有干扰，M-4菌株红外光谱图和降解率计算如图3，表2所示。

表2M-4菌株降解率计算

T：测试瓶中残余油含量(％)

P：毒化瓶中残余油含量(％)

W：生物降解率W＝(P-T)/P×100％。

降解废弃蓖麻基润滑油及矿物油的M-4菌株专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。