专利摘要

本发明提供了一种超高灵敏检测凝血酶的比色法。采用滚环复制放大技术，形成大量DNA酶，放大检测信号，提高了凝血酶的检测灵敏度。采用96孔板连接引物，可消除未反应的hemin对反应的影响，提高信噪比，进一步提高检测的灵敏度。采用灵敏的比色体系，利用过氧化氢将金离子还原成分散或团聚状态产生的红色或蓝色，直接判断有无靶分子的存在，无需预先制备纳米金溶液，简单易行，无需复杂仪器设备。通过本方法，可实现凝血酶的超高灵敏检测，检出限可达10-17M(约6个凝血酶分子)。

权利要求

1.一种超高灵敏检测凝血酶的比色法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在细胞培养板表面包被戊二醛，通过共价方法固定捕获探针primer链；

2)设计环形模板circle template，其可与凝血酶特异性结合，结合后阻挡滚环复制的继续；

3)加入DNA连接酶，使上述的环形模板circle template在细胞培养板表面的primer链上成环；

4)加入摩尔数为上述primer的0-10^-11倍的待测液，通过DNA聚合酶作用进行滚环复制扩增反应；

5)加入摩尔数为上述primer的2-10倍的hemin，形成G-四链体DNA酶；

6)依次加入过氧化氢和氯金酸溶液，反应后观察溶液颜色变化并测吸光度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

一.96孔板的修饰：

(1)在96孔板的6个微孔中加入200μL 5mM戊二醛，湿盒37℃水浴震荡4h，在微孔底部包被戊二醛；

(2)弃去反应液，将6个微孔用pH 5的PBS和水各洗5次，加入200μL 1×10^-6M的primer 5′-GAC GGC GAA GGA TTG ATA CT-3′，37℃水浴4h，将primer修饰到微孔板上；

(3)弃去反应液，将6个微孔用200μL水清洗1次，各加入25μL 1×10^-6M circle template 5′-CTT CGC CGT CCC CAA CCC GCC CTA CCC GGT TGG TGT GGT TGG CCC AAC CCG CCC TAC CCA GTA TCA ATC-3′，3μL 10×T4连接酶缓冲液，90℃10min后，室温退火1h，将circle template连接到微孔板表面的primer上；

(4)在6个微孔中加入2μL T4连接酶，25℃反应2h，使circle template在微孔板表面的primer上成环；

(5)弃去反应液，在6个微孔中各加入40μL水，5μL 10×phi29缓冲液，分别加入1μL浓度为0，10^-17，5×10^-17，10^-16，5×10^-16，10^-15M的凝血酶，室温15min；

二.酶扩增：

(6)在6个微孔中各加入3μL 10mM dNTPs，1μL phi29 DNA聚合酶，37℃反应3h，进行滚环复制扩增反应；

(7)弃去上清液，在6个微孔中各加入100μL 5×10^-6M hemin，25℃反应1h，形成大量DNA酶；

三.金纳米粒子的生长：

(8)弃去上清液，将6个微孔用200μL水清洗2次，加入100μL 20mM的H₂O₂溶液——由1mM MES缓冲液配制而成，反应30min；

(9)在6个微孔中各加入100μL 0.2mM的HAuCl₄溶液——由1mM MES缓冲液配制，反应10min后拍照，测吸光度。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的捕获探针primer链，其核苷酸序列为5′-GAC GGC GAA GGA TTG ATA CT-3′，5′端氨基修饰。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述环形模板circle template，其核苷酸序列中包括GG TT GG TGT GG TT GG段。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述环形模板circle template，其核苷酸序列为5′-CTT CGC CGT CCC CAA CCC GCC CTA CCC GGT TGG TGT GGT TGG CCC AAC CCG CCC TAC CCA GTA TCA ATC-3′。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述DNA连接酶为T4连接酶。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，形成G-四链体DNA酶的条件为25℃反应1-1.5h。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，所述过氧化氢的摩尔数为上述primer的10⁴倍。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，所述氯金酸的摩尔数为上述primer的100倍。

说明书

技术领域：

本发明属于生化分析技术领域，特别涉及一种超高灵敏检测凝血酶的比色法。

背景技术：

凝血酶是一种蛋白水解酶，由两条肽链组成，肽链之间以二硫键互相连接。凝血酶通过将血液中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，加速血小板的凝聚，达到迅速止血的目的。癌症患者肿瘤组织及肿瘤细胞的转移与扩散，都会使患者的凝血机制发生变化，可以通过检测凝血酶的浓度对癌症等疾病进行评估。目前检测凝血酶的方法主要有荧光法、发色底物法及电化学法，但这三种方法的灵敏度均不佳，检出限较高，无法达到现代医学要求的痕量检测；拉曼散射检测生物分子具有较高的灵敏度，但操作复杂，需要昂贵的仪器，成本较高。目前常用比色法进行检测。比色法是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。信号是溶液颜色的变化，可以肉眼检测，简便快捷。

专利200810036219.1提供了一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，有凝血酶存在时会与双链探针中的核酸适体结合，释放出的cDNA单链吸附到预先制备的纳米金表面，从而提高纳米金的耐盐性，使溶液保持红色，实现对凝血酶的检测。但信号仅由加入的凝血酶产生，使体系检出限较高。专利201210057638.X提供了一种基于滚环扩增比色法检测靶核酸或蛋白的方法，利用抗原抗体结合将待测靶核酸或蛋白通过捕获抗体间接固定于磁珠上，通过杂交上的滚环引物进行滚环扩增，产生的大量重复序列的长链DNA团聚，表面负离子高度堆积，对纳米金颗粒表面的负电荷有屏蔽作用，使纳米金颗粒间排斥减弱，易发生聚集，使纳米金溶液由酒红色变紫黑色。该发明滚环复制的发生需要捕获抗体、凝血酶、检测抗体、引物探针和环形模板逐一连接，较为繁琐且浪费资源，且需要预先制备粒径均一的纳米金溶液，较为繁琐。

本发明无需预先制备纳米金溶液，且只需要两段核酸序列：环形模板circle template利用捕获探针primer成环，捕获探针primer同时作为引物，即可在成环的circle template上进行滚环复制。本发明将核酸适体特异性识别凝血酶及滚环复制相结合，只需两段核酸序列互相连接，在进行滚环复制放大信号的基础上，将核酸适体特异性结合凝血酶的原理与金-过氧化氢变色体系相结合。当过氧化氢存在时，会将金离子还原成纳米金，高浓度的过氧化氢有助于形成分散的、球形的纳米金，使溶液显红色；当滚环复制反应生成DNA酶后，DNA酶可催化过氧化氢分解，使过氧化氢浓度降低，则形成团聚的纳米金，使溶液显蓝色。该方法无需预先制备纳米金溶液，省时省力，且极大地提高了检测灵敏度，该发明的检出限可达10^-17M(约6个凝血酶分子)，实现了凝血酶的超高灵敏分析检测。

DNA酶是一种具有催化活性的DNA分子，具有蛋白酶的催化性能。蛋白酶在高温、强酸或强碱条件下会因为发生不可逆变性而失活，因此使用条件较为苛刻；而DNA酶在具有蛋白酶的催化性能的同时，不会因为温度、pH等条件的改变而发生不可逆变性，因此得到了越来越广泛的关注。

滚环复制是噬菌体感染细菌后进行自我复制所采取的一种形式，是以封闭的单链环状DNA作为模板，当有相应的与之碱基互补杂交的引物存在时，在等温的环境下进行复制扩增。通过这种复制方式，环状单链DNA能够实现相对无限的单链扩增。该方法不需要对模板DNA样品进行特殊处理，实现信号的高效放大。

发明内容：

为了解决上述问题，我们采用滚环复制放大技术，形成大量DNA酶，放大检测信号，提高了凝血酶的检测灵敏度。采用96孔板连接引物，可消除未反应的氯化血红素(hemin)对反应的影响，提高信噪比，进一步提高检测的灵敏度。采用灵敏的比色体系，利用过氧化氢将金离子还原成分散或团聚状态产生的红色或蓝色，直接判断有无靶分子的存在，无需预先制备纳米金溶液，简单易行，无需复杂仪器设备。通过本方法，可实现凝血酶的超高灵敏检测，检出限可达10^-17M(约6个凝血酶分子)。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种超高灵敏检测凝血酶的比色法，包括如下步骤：

1)在细胞培养板表面包被戊二醛，通过共价方法固定捕获探针primer链；

2)设计环形模板circle template，其可与凝血酶特异性结合，结合后阻挡滚环复制的继续；

3)加入DNA连接酶，使上述的环形模板circle template在细胞培养板表面的primer链上成环；

4)加入摩尔数为上述primer的0-10^-11倍的待测液，通过DNA聚合酶作用进行滚环复制扩增反应；

5)加入摩尔数为上述primer的2-10倍的hemin，形成G-四链体DNA酶；

6)依次加入过氧化氢和氯金酸溶液，反应后观察溶液颜色变化并测吸光度。

优选的是，步骤1)中，所述的细胞培养板为96孔板。

优选的是，步骤1)中，所述的捕获探针primer链，其核苷酸序列为5′-GAC GGC GAA GGA TTG ATA CT-3′，5′端氨基修饰。

优选的是，步骤2)中，所述环形模板circle template，其核苷酸序列中包括GG TT GG TGT GG TT GG段。

优选的是，步骤2)中，所述环形模板circle template，其核苷酸序列为5′-CTT CGC CGT CCC CAA CCC GCC CTA CCC GGT TGG TGT GGT TGG CCC AAC CCG CCC TAC CCA GTA TCA ATC-3′。

优选的是，步骤3)中，所述DNA连接酶为T4连接酶。

优选的是，步骤4)中，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。

优选的是，步骤5)中，形成G-四链体DNA酶的条件为25℃反应1-1.5h。

优选的是，步骤6)中，所述过氧化氢的摩尔数为上述primer的10⁴倍。

优选的是，步骤6)中，所述氯金酸的摩尔数为上述primer的100倍。

凝血酶的检测原理：当有凝血酶存在时，凝血酶会与circle template形成的DNA环特异性结合，阻止滚环复制的发生，无法形成滚环复制产物与hemin结合生成DNA酶，进而无法催化过氧化氢的分解。因此过氧化氢足量，能使金还原成分散良好的状态，显红色；而当没有凝血酶存在时，无法阻止滚环复制的发生，滚环复制产物与hemin结合后生成的大量DNA酶将过氧化氢分解，将金还原成团聚的状态，显蓝色。

本发明的有益技术效果：1.本发明提供了一种超高灵敏检测凝血酶的比色法。采用滚环复制放大技术，形成大量DNA酶，放大检测信号，提高了凝血酶的检测灵敏度。采用96孔板连接引物，可消除未反应的hemin对反应的影响，提高信噪比，进一步提高检测的灵敏度。采用灵敏的比色体系，利用过氧化氢将金离子还原成分散或团聚状态产生的红色或蓝色，直接判断有无靶分子的存在，无需预先制备纳米金溶液，简单易行，无需复杂仪器设备。通过本方法，可实现凝血酶的超高灵敏检测，检出限可达10^-17M(约6个凝血酶分子)。2.其circle template链为富C碱基的序列，成环后，引物以环为模板进行滚环复制，产物为一条富G碱基的序列，该富G序列与hemin通过电子堆积作用结合，形成G-四链体DNA酶，可以催化过氧化氢的分解。滚环复制可使该富G序列无限延长，极大地增大DNA酶的量，进而放大检测信号。

附图说明

图1凝血酶与DNA环特异性结合电泳表征图

图2不同浓度凝血酶的检测灵敏度

图3不同浓度凝血酶反应后，溶液在540nm处光吸收的变化规律

图4凝血酶、牛血清白蛋白、牛血红蛋白、溶菌酶、核仁素以及空白反应后，溶液颜色的变化规律

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明。

实施例1实验部分

一.96孔板的修饰：

(1)在96孔板的6个微孔中加入200μL 5mM戊二醛，湿盒37℃水浴震荡4h，在微孔底部包被戊二醛。

(2)弃去反应液，将6个微孔用pH 5的PBS和水各洗5次，加入200μL 1×10^-6M的primer(5′-GAC GGC GAA GGA TTG ATA CT-3′)，37℃水浴4h，将primer修饰到微孔板上。

(3)弃去反应液，将6个微孔用200μL水清洗1次，各加入25μL 1×10^-6M circle template(5′-CTT CGC CGT CCC CAA CCC GCC CTA CCC GGT TGG TGT GGT TGG CCC AAC CCG CCC TAC CCA GTA TCA ATC-3′)，3μL 10×T4连接酶缓冲液，90℃10min后，室温退火1h，将circle template连接到微孔板表面的primer上。

(4)在6个微孔中加入2μL T4连接酶，25℃反应2h，使circle template在微孔板表面的primer上成环。

(5)弃去反应液，在6个微孔中各加入40μL水，5μL 10×phi29缓冲液，分别加入1μL浓度为0，10^-17，5×10^-17，10^-16，5×10^-16，10^-15M的凝血酶，室温15min。

二.酶扩增：

(6)在6个微孔中各加入3μL 10mM dNTPs，1μL phi29DNA聚合酶，37℃反应3h，进行滚环复制扩增反应。

(7)弃去上清液，在6个微孔中各加入100μL 5×10^-6M hemin，25℃反应1h，形成大量DNA酶。

三.金纳米粒子的生长：

(8)弃去上清液，将6个微孔用200μL水清洗2次，加入100μL 20mM的H₂O₂溶液(由1mM MES缓冲液配制)，反应30min。

(9)在6个微孔中各加入100μL 0.2mM的HAuCl₄溶液(由1mM MES缓冲液配制)，反应10min后拍照，测吸光度。

四.实验结果

图1中1，2，3跑道分别是marker，结合了凝血酶的DNA环和滚环复制的DNA环。结合了凝血酶的DNA环(跑道2)无法进行滚环复制扩增，小分子能够在聚丙烯酰胺电泳中跑的较快；而未结合凝血酶的DNA环(跑道3)则能进行滚环复制扩增，形成的大分子在聚丙烯酰胺电泳中跑的更慢。由此证明了凝血酶与DNA环结合产物的生成。

图2中从左到右依次为加入1μL 10^-15，5×10^-16，10^-16，5×10^-17，10^-17，0M凝血酶反应后，反应液溶液颜色的照片，检出限可达10^-17M。

图3为加入1μL 0，10^-17，5×10^-17，10^-16，5×10^-16，10^-15M凝血酶反应后，反应溶液在540nm处光吸收值。540nm处的吸收值随凝血酶浓度的增大而增大，且趋于平缓；检出限可达10^-17M。

图4中从左到右依次为加入1μL 10^-15M的凝血酶、牛血清白蛋白、牛血红蛋白、溶菌酶、核仁素以及空白反应后，反应溶液颜色的照片。只有当凝血酶存在时才能特异性结合circle template形成的DNA环，阻止滚环复制的发生，进而无法形成滚环复制产物与hemin结合生成DNA酶，使过氧化氢足量，形成分散良好的红色纳米金溶液。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

一种检测凝血酶的比色法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。