专利摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法；具体步骤为：首先将鱼鳔解冻、清洗、沥干、切块、搅碎、除杂，加入工业酒精进行超声辅助脱脂；压滤并粉碎后，再加入六号溶剂油进行超声辅助脱脂；然后压滤，加入热水提取胶原蛋白，过滤取滤液；冷却后，加入浓盐酸和胃蛋白酶模拟胃相消化；调节pH后，再加入胰酶模拟肠相消化；最后煮沸、冷却、离心，将得到的上清液进行超滤，滤出液再次进行纳滤，收集截留液进行喷雾干燥，得到鱼源胶原蛋白肽；本发明实现了鱼类加工废弃物的高利化利用，制备的胶原蛋白肽具有延缓衰老的作用；生产工艺简单，周期短，成本低，无环境污染，胶原蛋白肽可应用于食品、医药、化妆品等领域。

权利要求

1.一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)原料的预处理：将鱼鳔解冻、清洗、沥干、切块、搅碎、除杂后，加入工业酒精超声辅助脱脂；压滤并粉碎后，再加入六号溶剂油超声辅助脱脂，然后压滤，得到脱脂鱼鳔；

(2)胶原蛋白的提取：将步骤(1)得到的脱脂鱼鳔置于50～60℃的热水中，连续搅拌浸提胶原蛋白，过滤后得到滤液，即为胶原蛋白溶液；

(3)胶原蛋白的酶解：将步骤(2)得到的胶原蛋白溶液冷却后，加入浓盐酸和胃蛋白酶，搅拌模拟胃相消化；所述浓盐酸与胶原蛋白溶液的体积比为1:100～150，胃蛋白酶为2500～5000U/mL，时间为2～3h。再用氢氧化钠调节pH为6.8～7.4后，加入胰酶，搅拌模拟肠相消化；最后煮沸、冷却、离心，所得上清液即为胶原蛋白的酶解产物；所述胰酶为20000～30000U/mL，时间为4～6h；

(4)胶原蛋白肽的分离：将步骤(3)得到的胶原蛋白酶解产物进行超滤，滤出液再次进行纳滤，收集截留液进行喷雾干燥，得到具有延缓衰老功效的胶原蛋白肽；所述进行纳滤时纳滤膜的截留分子量为150Da，进水压力为0.2～0.5MPa。

2.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述鱼鳔与工业酒精、六号溶剂油的比例均为1kg:3～5L；所述辅助脱脂的超声条件均为强度10～50W/L，时间3～5h，温度30～50℃。

3.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述脱脂鱼鳔与热水比例为1kg:7～10L；所述搅拌速度为200～300rpm；所述浸提时间为1～2h。

4.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冷却温度为35～40℃。

5.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述模拟胃相消化和肠相消化的温度均为37℃，搅拌速度均为150～200rpm。

6.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述煮沸时间为10～15min；所述离心条件为(5000～10000)g×(20～30)min。

7.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述进行超滤时超滤膜的截留分子量为1000Da，进水压力为0.1～0.3MPa。

8.根据权利要求1所述的一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述喷雾干燥的进风温度为180～220℃，出风温度为110～120℃。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法。

技术背景

胶原蛋白制品已广泛应用于食品、医药、化妆品、生物材料等领域。传统上胶原蛋白主要来源于畜禽，但由于人与畜禽共患病(口蹄疫、疯牛病、猪链球菌、禽流感)的频繁发生，其安全性越来越让人担心；同时，宗教习俗也使其应用和贸易受到了一定限制。我国是一个渔业大国，每年大量的加工废弃物造成了严重的资源浪费和环境污染。因此，以水产加工废弃物为原料生产可以替代传统畜禽来源的胶原蛋白制品，是促进食品安全和渔业发展的有效途径。

皮肤是人体最大的器官，担负着保护、感觉、调节体温、分泌、排泄和免疫等诸多生理功能。但随着年龄的增长，皮肤不可避免地发生退行性变，结构萎缩，功能衰退或丧失，不仅会对外貌和心理产生负面影响，而且与许多皮肤疾病有着密切的病因学联系，如溃疡、痤疮、苔藓、疱疹、角化病、白癜风、银屑病、红斑狼疮、皮肤癌等。延缓皮肤衰老进程是众多爱美人士的不懈追求，也是征服皮肤疾病的有效途径，成为当前生命科学的研究热点之一。

胶原蛋白在延缓皮肤衰老中已有较长的研究和应用历史。早在东汉时期，《伤寒论》中记载猪肤有“和血脉，润肌肤”的功效；在我国民间，人们多吃猪蹄、鸡爪等富含胶原蛋白的食物以期养颜美容；在当今市场，从粉剂、胶囊到口服液，用于改善皮肤质量的胶原蛋白制品多不胜数。近年来，北京大学、江南大学、中国海洋大学、中国农业大学和日本、韩国、德国、意大利、巴西的研究人员也分别从不同的角度证实了胶原蛋白延缓皮肤衰老的功效。然而，由于缺乏充足的实验证据和理论依据，致使胶原蛋白在延缓皮肤衰老中的应用一直倍受争议和质疑，加之生产企业的过度宣传导致其负面事件频发，市场乱象环生。

鱼鳔为一种富含胶原蛋白的鱼类加工废弃物，长期以来作为食药材和滋补品在中国和东南亚国家倍受青睐。传统中医认为，鱼鳔胶原蛋白制品具有改善气血、补肾固精、养颜润肤、滋养筋脉、提高免疫、健脑补智、御寒祛湿、止血散瘀、催乳消肿等多种生理功效，但其几乎均未得到现代科学研究的证实。因此，以鱼鳔为原料，生产一种具有延缓衰老功效的胶原蛋白肽，并阐明其分子机制，对促进食品安全和渔业发展、提高人们生活质量和健康水平具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一；本发明以鱼鳔为原料，利用超声辅助脱脂、模拟胃肠消化、超纳滤分离、喷雾干燥等技术，生产一种具有延缓衰老功效的鱼源胶原蛋白肽，可应用于食品、医药、化妆品等领域。

为了实现以上目的，本发明采取以下技术方案：

(1)原料的预处理：将鱼鳔解冻、清洗、沥干、切块、搅碎、除杂后，加入工业酒精进行超声辅助脱脂；压滤并粉碎后，再加入六号溶剂油进行超声辅助脱脂，然后压滤，得到脱脂的鱼鳔；

(2)胶原蛋白的提取：将步骤(1)得到的脱脂鱼鳔置于热水中，连续搅拌浸提胶原蛋白，过滤后得到的滤液，即为胶原蛋白溶液；

(3)胶原蛋白的酶解：将步骤(2)得到的胶原蛋白溶液冷却后，加入浓盐酸和胃蛋白酶，搅拌模拟胃相消化；再用氢氧化钠调节pH后，加入胰酶，搅拌模拟肠相消化；最后煮沸、冷却、离心，所得上清液即为胶原蛋白的酶解产物；

(4)胶原蛋白肽的分离：将步骤(3)得到的胶原蛋白酶解产物进行超滤，滤出液再次进行纳滤，然后收集截留液进行喷雾干燥，得到具有延缓衰老功效的胶原蛋白肽。

优选的，步骤(1)中所述鱼鳔与工业酒精、六号溶剂油的比例均为1kg:3～5L；所述辅助脱脂的超声条件均为强度10～50W/L，时间3～5h，温度30～50℃。

优选的，步骤(2)中所述热水温度为50～60℃；所述脱脂鱼鳔与热水比例为1kg:7～10L；所述搅拌速度为200～300rpm；所述浸提时间为1～2h。

优选的，步骤(3)中所述冷却的温度为35～40℃；所述模拟胃相消化的浓盐酸与胶原蛋白溶液的体积比为1:100～150，胃蛋白酶为2500～5000U/mL，时间为2～3h。

优选的，步骤(3)中所述用氢氧化钠调节pH为6.8～7.4，胰酶为20000～30000U/mL，时间为4～6h。

优选的，步骤(3)中所述模拟胃相消化和模拟肠相消化的温度均为37℃，搅拌速度均为150～200rpm。

优选的，步骤(3)中所述煮沸时间为10～15min；所述离心条件为(5000～10000)g×(20～30)min。

优选的，步骤(4)中所述超滤膜的截留分子量为1000Da，进水压力为0.1～0.3MPa；所述纳滤膜的截留分子量为150Da，进水压力为0.2～0.5MPa。

优选的，步骤(4)中所述喷雾干燥的进风温度为180～220℃，出风温度为110～120℃。

上述技术方案中所述的鱼鳔包括鲟科、鳕科、鲿科或石首鱼科的鱼鳔。

本发明的有益效果

1.在原料的选择方面，本发明以鱼类加工废弃物为原料生产胶原蛋白肽，既避免了传统畜禽胶原蛋白肽的不安全因素，又避免了鱼鳔的资源浪费和环境污染，实现了鱼类加工废弃物的高值化利用。

2.在原料的预处理方面，本发明利用超声辅助工业酒精和六号溶剂油脱脂的方法，效果好，能耗低、时间短、易于实现产业化。

3.在胶原蛋白的提取方面，本发明采用热水浸提法，胶原蛋白提取率较高，分子结构也较为完整，相较于传统的盐、酸、酶法提取，工艺简单，周期短，成本低，且无环境污染。

4.在胶原蛋白的酶解方面，本发明通过体外模拟人体胃肠道消化的方法，不仅大大提高了胶原蛋白肽的消化率，而且有效避免了经口摄入后人体胃肠道再次消化酶解导致的生物活性显著降低，甚至完全消失的缺点。

5.在胶原蛋白肽的分离方面，本发明利用膜分离(超滤、纳滤)的方法，其兼有浓缩、分离、纯化的功能，又有高效、节能、环保、过程简单、易于控制的优势，既保留了酶解产物的功效组分，又提高了最终产物的生物效价。

6.在胶原蛋白肽的生物安全性和生理活性方面，本发明通过大鼠长期饲喂实验证实，该胶原蛋白肽不仅具有较高的生物安全性，而且能够显著改善皮肤组织结构和基质平衡，提高抗氧化酶活力，缓解氧化应激，有效延缓皮肤衰老进程；成纤维细胞体外培养实验还发现，胶原蛋白肽(Hyp-Gly)不仅可以促进细胞增殖，还能够通过p38蛋白磷酸化，激活MAPK细胞信号转导通路，调控I型胶原蛋白及其mRNA表达，有效维持皮肤的正常组织结构和生理生化功能。

附图说明

图1为实施例1制备的胶原蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图2为实施例1制备的胶原蛋白肽的凝胶渗透色谱图谱。

图3为实施例1制备的胶原蛋白肽对大鼠皮肤组织结构的影响；其中，HE：苏木精-伊红染色；MS：Masson染色；SRO：正常光下的天狼星红染色；SRP：偏光下的天狼星红染色；BC：空白对照组；YC：青年对照组；CT：胶原蛋白肽处理组。

图4中a为不同分子结构的胶原蛋白肽对L929细胞增殖的影响；b为不同浓度的Hyp-Gly对L929细胞增殖的影响，其中，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子；“*”表示与对照组存在显著性差异(P<0.05)。

图5为Hyp-Gly对L929细胞I型胶原蛋白分泌和COL1A1 mRNA表达的影响；其中，“*”表示与对照组存在显著性差异(P<0.05)。

图6为细胞信号转导通路抑制剂对Hyp-Gly诱导的L929细胞COL1A1 mRNA表达水平的影响；其中，Genistein为染料木黄酮，H7为蛋白激酶C通路抑制剂；“*”表示与对照组存在显著性差异(P<0.05)。

图7为Hyp-Gly对L929细胞p38蛋白磷酸化水平的影响；其中，“*”表示与对照组存在显著性差异(P<0.05)。

具体实施方式

结合以下实例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：

将10kg鲟鱼鳔解冻，清洗，沥干，切块(3×3cm)，搅碎后过5目筛去除杂质；然后，加入50L工业酒精，在30℃下以50W/L超声波辅助脱脂3h；压滤并粉碎后，再加入30L六号溶剂油，在50℃下以10W/L超声波辅助脱脂5h；然后压滤，得到脱脂的鲟鱼鳔约3.0kg；

向上述脱脂鱼鳔中加入50℃的热水30L，在200rpm搅拌下提取胶原蛋白1h；然后过20目筛，冷却至35℃，向滤液中加入浓盐酸0.3L和胃蛋白酶至2500U/mL，在150rpm连续搅拌3h模拟胃相消化；再用NaOH调节pH至6.8，加入胰酶至20000U/mL，在200rpm连续搅拌6h模拟肠相消化；最后煮沸10min，冷却，10000g离心20min，所得上清液即为胶原蛋白酶解产物；

利用截留分子量为1000Da的超滤膜，在进水压力0.1MPa下对胶原蛋白酶解产物进行超滤，直至无溶质滤出，收集滤出液；再利用截留分子量为150Da的纳滤膜，在进水压力0.2MPa下对上述滤出液进行纳滤，至无溶质滤出为止，收集截留液在进风温度180℃、出风温度110℃条件下进行喷雾干燥，得到白色粉沫，即为具有延缓衰老作用的胶原蛋白肽。

实施例2：

取10kg鳕鱼鳔解冻，清洗，沥干，切块(约1×1cm)，搅碎后过10目筛去除杂质；加入30L工业酒精，在50℃下以10W/L超声波辅助脱脂5h；压滤并粉碎后，再加入50L六号溶剂油，在30℃下以50W/L超声波辅助脱脂3h；最后压滤，得到脱脂的鳕鱼鳔约3.5kg；

向上述脱脂鱼鳔中加入60℃热水25L，在300rpm搅拌下提取胶原蛋白2h；然后过50目筛，冷却至40℃，向滤液中加入浓盐酸0.2L和胃蛋白酶至5000U/mL，在200rpm连续搅拌2h模拟胃相消化；再用NaOH调节pH至7.4，加入胰酶至30000U/mL，在150rpm连续搅拌4h模拟肠相消化；最后煮沸15min，冷却，5000g离心30min，所得上清液即为胶原蛋白酶解产物；

利用截留分子量为1000Da的超滤膜，在进水压力0.3MPa下对胶原蛋白酶解产物进行超滤，直至几乎无溶质滤出，收集滤出液；再利用截留分子量为150Da的纳滤膜，在进水压力0.5MPa下对上述滤出液进行纳滤，至几乎无溶质滤出为止，收集截留液在进风温度220℃、出风温度120℃条件下进行喷雾干燥，得到白色粉沫，即为具有延缓衰老作用的胶原蛋白肽。

实施例3：

将10kg鮰鱼鳔解冻，清洗，沥干，切块(约2×2cm)，搅碎后过5目筛去除杂质；加入40L工业酒精，在40℃下以30W/L超声波辅助脱脂4h；压滤并粉碎后，再加入40L六号溶剂油，在40℃下以30W/L超声波辅助脱脂4h；最后压滤，得到脱脂的鮰鱼鳔约3.2kg；

向上述预处理的鱼鳔中加入55℃热水27.5L，在250rpm的搅拌下提取胶原蛋白1.5h；然后过30目筛，冷却至37℃，向滤液中加入浓盐酸0.2L和胃蛋白酶至4000U/mL，在175rpm下连续搅拌2.5h模拟胃相消化；再用NaOH调节pH至7.0，加入胰酶至25000U/mL，在175rpm下连续搅拌5h模拟肠相消化；最后煮沸12min，冷却，7500g离心25min，所得无色透明的上清液即为胶原蛋白酶解产物；

利用截留分子量为1000Da的超滤膜，在进水压力0.2MPa下对胶原蛋白酶解产物进行超滤，直至几乎无溶质滤出，收集滤出液；再利用截留分子量为150Da的纳滤膜，在进水压力0.3MPa对上述滤出液进行纳滤，至几乎无溶质滤出为止，收集截留液在进风温度200℃、出风温度115℃条件下进行喷雾干燥，得到白色粉沫，即为具有延缓衰老作用的胶原蛋白肽。

性能测试

选择实施例1得到的胶原蛋白肽进行后续性能测试。

测试方法：

(1)胶原蛋白及多肽的理化特性分析

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：采用5％分离胶与3％浓缩胶不连续电泳系统；氨基酸组成：将样品于110℃的含有1％(v/v)苯酚的6M盐酸中水解24h后，利用氨基酸自动分析仪检测；真消化率：大鼠代谢笼法；分子量分布：凝胶渗透色谱(GPC)法，采用Waters Ultrahydrogel 120柱(7.8×300mm)，蒸馏水洗脱速度为0.5mL/min，检测波长为220nm。

(2)胶原蛋白肽的延缓皮肤衰老作用评价

将30只健康雌性6月龄SD大鼠随机分成2组：空白对照组(BC，AIN-93M标准饲料)和胶原蛋白肽处理组(CT，4％胶原蛋白肽+96％AIN-93M标准饲料)。自由进食和饮水12个月后，脱臼处死，收集大鼠脏器和背部皮肤。以健康雌性3月龄SD大鼠作为青年对照组(YC，AIN-93M标准饲料)。

羟脯氨酸含量：根据ISO3496进行比色法测定；氧化应激水平：根据试剂盒说明测定过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)含量；组织结构：将皮肤固定、脱水、包埋、切片后，分别进行苏木精-伊红(HE)、Masson和天狼星红染色，然后利用软件Halcon 12.0分析真皮厚度、胶原纤维密度和III、I型胶原蛋白比例。

(3)胶原蛋白肽延缓皮肤衰老的分子机制研究

将成纤维细胞(L929)复苏，传代培养，调整细胞浓度后接种于96孔细胞培养板，加入含有胶原蛋白肽的FBS-DMEM培养基：血球计数板进行细胞计数；ELISA检测I型胶原蛋白表达量；RT-PCR测定COL1A1 mRNA表达水平；阻断法分析细胞信号转导通路；Western blotting检测信号效应分子。

测试结果：

(1)胶原蛋白及多肽的理化特性；

利用50℃热水浸提1h，胶原蛋白提取率可达91.3％；通过模拟胃肠消化和超纳滤分离方法制备的胶原蛋白肽得率为66.5％，真消化率为98.6％。

图1为胶原蛋白的SDS-PAGE图谱。该胶原蛋白具有相对完整的分子结构，至少包含两条α链(α1和α2)及其二聚体(β)和多聚体，呈现典型的I型胶原蛋白电泳图谱特征。

图2为胶原蛋白肽的GPC图谱。该胶原蛋白肽分子量主要集中在200-600Da，平均分子量为374.2Da；氨基酸组成分析显示(表1)，该胶原蛋白肽富含甘氨酸(约占1/3)，丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和羟脯氨酸含量相对较高，酪氨酸和组氨酸含量相对较低，未检出色氨酸和半胱氨酸。

表1胶原蛋白肽的氨基酸组成(残基数/1000个残基)

(2)胶原蛋白肽的延缓皮肤衰老作用；

从表2可以看出，该胶原蛋白肽处理组大鼠的体重、进食量、脏器指数与空白对照组相比均无显著差异，证实了其较高的生物安全性。

图3为胶原蛋白肽对大鼠皮肤组织结构的影响。HE染色显示出空白对照组大鼠皮肤具有细胞稀疏、纤维紊乱、真表皮界线模糊等衰老的典型特征，真皮厚度也比青年对照组减少了20.1％。胶原蛋白肽处理组大鼠皮肤更为有序、紧致和完整，真皮厚度与青年对照组亦无显著差异。通过Masson染色观察到空白对照组大鼠皮肤胶原纤维松散、无序和碎片化，而胶原蛋白肽处理组胶原纤维紧密有序，密度增加了22.2％，羟脯氨酸增加了27.7％。天狼星红染色还显示，青年对照组大鼠皮肤主要为橙黄色或亮红色的I型胶原蛋白，空白对照组主要为绿色的III型，而胶原蛋白肽处理显著降低了III型和I型胶原蛋白的比例。该结果表明胶原蛋白肽能够显著改善大鼠皮肤的组织结构和胞外基质动态平衡。

表2胶原蛋白肽对大鼠生理指标和皮肤特征的影响

此外，胶原蛋白肽处理组大鼠皮肤的CAT、SOD、GSH-Px活力较空白对照组分别提高了48.0％、49.4％和24.2％，MDA含量则降低了31.5％。这表明胶原蛋白肽提高了抗氧化酶活力，抑制了脂质过氧化，缓解了皮肤的氧化应激。

(3)胶原蛋白肽延缓皮肤衰老的分子机制；

图4为不同分子结构的胶原蛋白肽(a)和不同浓度的Hyp-Gly(b)对L929细胞增殖的影响；从图4a可以看出，利用不同分子结构的胶原蛋白肽处理L929细胞7d后，Pro-Hyp、Hyp-Gly、Ala-Hyp、Ala-Hyp-Gly和Leu-Hyp均显著促进了细胞增殖，其中Hyp-Gly促进细胞增殖能力最强，细胞数比对照组提高了2.09倍，并且在0～200μmol浓度范围内呈剂量依赖关系(图4b)。

图5为Hyp-Gly对L929细胞I型胶原蛋白分泌和COL1A1 mRNA表达的影响；利用Hyp-Gly处理L929细胞24h后，I型胶原蛋白的含量比对照组提高了3.74倍，其α1链基因COL1A1 mRNA的表达量也增加了2.46倍。

图6为细胞信号通路抑制剂对Hyp-Gly诱导的L929细胞COL1A1 mRNA表达水平的影响；染料木黄酮和H7均阻断了Hyp-Gly的信号通路，显著降低了COL1A1 mRNA的表达。

图7为Hyp-Gly对L929细胞p38蛋白磷酸化水平的影响；Hyp-Gly在30min和60min时显著提高了p38磷酸化水平；这表明Hyp-Gly通过诱导p38磷酸化激活了MAPK信号通路，进而促进了COL1A1 mRNA表达。

综上所述：(1)利用50℃热水浸提的胶原蛋白具有较高的提取率(91.3％)和相对完整的I型胶原蛋白分子结构；(2)通过模拟胃肠消化和超纳滤分离方法制备的胶原蛋白肽得率为66.5％，真消化率为98.6％，分子量主要集中在200-600Da，平均分子量为374.2Da，富含甘氨酸，丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和羟脯氨酸等；(3)该胶原蛋白肽具有较高的生物安全性，能够改善皮肤的组织结构和基质平衡，缓解皮肤氧化应激，延缓皮肤衰老进程；(4)该胶原蛋白肽主要组分不仅能够促进成纤维细胞增殖，而且通过诱导p38蛋白磷酸化，激活MAPK细胞信号转导通路，促进COL1A1 mRNA表达和I型胶原蛋白合成分泌。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

一种延缓衰老的鱼源胶原蛋白肽的制备方法专利购买费用说明

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2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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