专利摘要

本发明公开了一种可识别微丝菌的能量共振体系及其制备方法，先制备碲化镉量子点和长链烷基罗丹明荧光探针，再利用季铵盐溶液为载体制备共振体系来识别微丝菌。本发明效果为长链烷基罗丹明荧光探针量子产率高，荧光强度高，荧光性质稳定，共振后识别浓度低至0.05μmol/L。本发明中所制备量子点把能量通过能量共振转移给荧光探针，从而把荧光探针对微丝菌的识别浓度从10μmol/L降低至0.05μmol/L。

权利要求

1.一种可识别微丝菌的能量共振体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)碲化镉量子点的制备：按照超纯水：碲粉：硼氢化钠＝(180-220)ml：1g：0.45-1.6g的比例加入到反应釜中，氮气置换三次，40-50℃反应20-40分钟，得到前驱体；

按照氯化镉：巯基乙酸：超纯水：＝1g：0.45-1.6g：(1800-2200)ml的比例加入到反应釜中，用氮气置换三次，然后按照氯化镉：前驱体＝0.025g：0.8-5ml，加入上述制备的前驱体，水浴加热至回流，停止加热，降温待用，此为量子点水溶液；

(2)具有长疏水链的长链烷基罗丹明荧光探针制备

按照N,N-二甲氨基酮酸：3-(单或双)长链烷氨基-苯酚：甲基磺酸＝1mmol：1-1.25mmol：5-10ml的比例加入到反应釜中，在N₂保护下，加热至85-100℃反应，10-16小时后停止反应，降至室温后加入甲基磺酸体积10倍的冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝5-7，过滤，将滤饼真空干燥得粗品，经柱层析分离，得长链烷基罗丹明；

(3)能量共振体系的建立

在50-100μmol/L的季铵盐水溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.1-1μmol/L，加入上述长链烷基罗丹明荧光探针使其终0.05-0.1μmol/L，震荡1分钟，能量共振溶液制备完成。

2.根据权利要求1所述可识别微丝菌的能量共振体系的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中水浴加热至回流3-30分钟。

3.根据权利要求1所述可识别微丝菌的能量共振体系的制备方法，其特征在于，所述3-(单或双)长链烷氨基-苯酚为3-辛烷氨基-苯酚、3-双辛烷氨基-苯酚、3-十二烷氨基-苯酚、3-双十二烷氨基-苯酚、3-十六烷氨基-苯酚和3-双十六烷氨基-苯酚。

4.根据权利要求1所述可识别微丝菌的能量共振体系的制备方法，其特征在于在于，所述季铵盐为四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵或苄基三乙基氯化铵。

5.根据权利要求1所述可识别微丝菌的能量共振体系的制备方法，其特征在于在于，所述步骤(2)中，柱层析所用溶剂体积比甲醇:二氯甲烷＝1：20。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的方法制备的可识别微丝菌的能量共振体系。

说明书

技术领域

本发明用于污水处理领域中微生物检测，尤其是一种可识别微丝菌的能量共振体系及其制备方法。

背景技术

活性污泥法是常用的一种污水处理方法，但污泥膨胀问题一直是困扰污水处理厂正常运行的一个世界性难题。活性污泥膨胀由丝状菌过度生长引起的丝状膨胀和非丝状膨胀。微丝菌是污泥起泡和膨胀过程中最常见的一种丝状菌，特别是涉及营养物去除的污水处理系统中，因而对这类丝状菌进行鉴别研究，对污泥膨胀现象的预警和控制具有重要意义。

CN201410225878.5根据J.L.Nielsen等人发现微丝菌表面具有一定的疏水性。制备了长碳咔唑盐类化合物对微丝菌进行识别。识别用荧光探针浓度为10μmol/L；使用浓度较高；且荧光探针量子产率低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种可识别微丝菌的能量共振体系及其制备方法，利用能量共振体系将量子点的能量转移给荧光探针，实现超低探针浓度对微丝菌的识别。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种可识别微丝菌的能量共振体系的制备方法，包括以下步骤：

(1)碲化镉量子点的制备：按照超纯水：碲粉：硼氢化钠＝(180-220)ml：1g：0.45-1.6g的比例加入到反应釜中，氮气置换三次，40-50℃反应20-40分钟，得到前驱体；

按照氯化镉：巯基乙酸：超纯水：＝1g：0.45-1.6g：(1800-2200)ml的比例加入到反应釜中，用氮气置换三次，然后按照氯化镉：前驱体＝0.025g：0.8-5ml，加入上述制备的前驱体，水浴加热至回流，停止加热，降温待用，此为量子点水溶液；

(2)具有长疏水链的长链烷基罗丹明荧光探针制备

按照N,N-二甲氨基酮酸：3-(单或双)长链烷氨基-苯酚：甲基磺酸＝1mmol：1-1.25mmol：5-10ml的比例加入到反应釜中，在N₂保护下，加热至85-100℃反应，10-16小时后停止反应，降至室温后加入甲基磺酸体积10倍的冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝5-7，过滤，将滤饼真空干燥得粗品，经柱层析分离，得长链烷基罗丹明；

(3)能量共振体系的建立

在50-100μmol/L的季铵盐水溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.1-1μmol/L，加入上述长链烷基罗丹明荧光探针使其终0.05-0.1μmol/L，震荡1分钟，能量共振溶液制备完成。

所述步骤(1)中水浴加热至回流3-30分钟。

所述3-(单或双)长链烷氨基-苯酚为3-辛烷氨基-苯酚、3-双辛烷氨基-苯酚、3-十二烷氨基-苯酚、3-双十二烷氨基-苯酚、3-十六烷氨基-苯酚和3-双十六烷氨基-苯酚。

所述季铵盐为四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵或苄基三乙基氯化铵。

所述步骤(2)中，柱层析所用溶剂体积比甲醇:二氯甲烷＝1：20。

上述的方法制备的可识别微丝菌的能量共振体系。

本发明的有益效果是：所制备的长链烷基罗丹明，荧光量子产率高(通过测定，量子产率为110％(以罗丹明B乙醇溶液495nm激发量子产率89％为标准)。能量共振后，识别微丝菌用的探针浓度低至0.05-0.10μmol/L，比专利CN201410225878.5的探针使用浓度降低200倍。

附图说明

图1为本发明能量共振体系对微丝菌识别后荧光显微镜镜检图；

图2为本发明的能量共振荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的可识别微丝菌的能量共振体系及其制备方法，先制备碲化镉量子点和具有长疏水链的长链烷基罗丹明荧光探针，包括以下步骤：

(1)碲化镉量子点的制备：按照超纯水：碲粉：硼氢化钠＝(180-220)ml：1g：0.45-1.6g的比例加入到反应釜中，氮气置换三次，40-50℃反应20-40分钟，得到前驱体；

按照氯化镉：巯基乙酸：超纯水：＝1g：0.45-1.6g：(1800-2200)ml的比例加入到反应釜中，用氮气置换三次，然后按照氯化镉：前驱体＝0.025g：0.8-5ml，加入上述制备的前驱体，水浴加热至回流，停止加热，降温待用，此为量子点水溶液；

(2)具有长疏水链的长链烷基罗丹明荧光探针制备

按照N,N-二甲氨基酮酸：3-(单或双)长链烷氨基-苯酚：甲基磺酸＝1mmol：1-1.25mmol：5-10ml的比例加入到反应釜中，在N₂保护下，加热至85-100℃反应，10-16小时后停止反应，降至室温后加入甲基磺酸体积10倍的冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝5-7，过滤，将滤饼真空干燥得粗品，经柱层析分离，得长链烷基罗丹明；

(3)能量共振体系的建立

在50-100μmol/L的季铵盐水溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.1-1μmol/L，加入上述长链烷基罗丹明荧光探针使其终0.05-0.1μmol/L，震荡1分钟，能量共振溶液制备完成。

所述步骤(1)中水浴加热至回流3-30分钟。

所述3-(单或双)长链烷氨基-苯酚为3-辛烷氨基-苯酚、3-双辛烷氨基-苯酚、3-十二烷氨基-苯酚、3-双十二烷氨基-苯酚、3-十六烷氨基-苯酚和3-双十六烷氨基-苯酚。

所述季铵盐为四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵或苄基三乙基氯化铵。

所述步骤(2)中，柱层析所用溶剂体积比甲醇:二氯甲烷＝1：20。

上述的方法制备的可识别微丝菌的能量共振体系。

分别如图1和图2所示。图1为本发明能量共振体系对微丝菌识别后荧光显微镜镜检图；图2为本发明的能量共振荧光光谱图，说明本申请所制得的具有长疏水链的荧光探针可很好地识别微丝菌。

实施例1

1、量子点制备

在10ml的反应瓶中加入4.6ml超纯水、0.0255g的碲粉和0.0126g的硼氢化钠，氮气置换三次，40度反应20分钟备用(前驱体，下同)。

在装有搅拌子的100ml的单口瓶中加入0.0255g的氯化镉、0.0126g的巯基乙酸和46ml超纯水，用氮气置换三次，加入1ml前驱体，水浴加热至回流5分钟即停止加热，降温待用。

2、探针的制备

向装有搅拌子的100ml四口烧瓶中加入N,N-二甲氨基酮酸0.285g(1.00mmol)，3-辛氨基-苯酚0.22g(1.00mmol)和甲基磺酸5ml。在N₂保护下，加热至85℃反应。10小时后停止反应，降至室温后加入50ml冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝5，过滤，将滤饼真空干燥得粗品。干法上样经柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1：20，v/v)分离，得单辛烷基罗丹明(0.266g，56.5％)。

3、能量共振体系的建立以及对微丝菌的识别

以100μmol/L的四丁基溴化铵水溶液为基液配制10个1ml的共振溶液，共振溶液的量子点终浓度为1.0μmol/L时，探针的终浓度分别为0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.0375、0.05、0.075、0.125μmol/L；把10个样品震荡1分钟后进行荧光测试，确定能量共振发生(见图2)。选择荧光探针浓度为0.05μmol/L的共振溶液加入含有微丝菌的污泥摇匀后进行标记识别。标记后的微丝菌在荧光显微镜下显示红色丝状物，标记成功。

实施例2

1、量子点制备

在10ml的反应瓶中加入5.6ml超纯水、0.0255g的碲粉和0.0378g的硼氢化钠，氮气置换三次，45度反应40分钟备用。

在装有搅拌子的100ml的单口瓶中加入0.0255g的氯化镉、0.0378g的巯基乙酸和56ml超纯水，用氮气置换三次，加入5ml前驱体，水浴加热至回流10分钟即停止加热，降温待用。

2、探针的制备

向装有搅拌子的100ml四口烧瓶中加入N,N-二甲氨基酮酸0.285g(1.00mmol)，3-双辛氨基-苯酚0.41g(1.25mmol)和甲基磺酸10ml。在N₂保护下，加热至95℃反应。16小时后停止反应，降至室温后加入100ml冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝6，过滤，将滤饼真空干燥得粗品。干法上样经柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1：20，v/v)分离，得双辛烷基罗丹明(0.43g，75.1％)。

3、能量共振体系的建立以及对微丝菌的识别

在50μmol/L的十六烷基三甲基溴化铵溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.1μmol/L，加入上述双辛烷基罗丹明荧光探针使其终0.1μmol/L，震荡1分钟，加入含有微丝菌的污泥摇匀后进行标记识别。标记后的微丝菌在荧光显微镜下显示红色丝状物，标记成功。

实施例3

1、量子点制备

在10ml的反应瓶中加入5.0ml超纯水、0.0255g的碲粉和0.0252g的硼氢化钠，氮气置换三次，48度反应30分钟备用。

在装有搅拌子的100ml的单口瓶中加入0.0255g的氯化镉、0.0252g的巯基乙酸和50ml超纯水，用氮气置换三次，加入3ml前驱体，水浴加热至回流保持15分钟即停止加热，降温待用。

2、探针的制备

向装有搅拌子的100ml四口烧瓶中加入N,N-二甲氨基酮酸0.285g(1.00mmol)，3-十二烷基-苯酚0.305g(1.1mmol)和甲基磺酸(5ml)。在N₂保护下，加热至100℃反应。14小时后停止反应，降至室温后加入50ml冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝7，过滤，将滤饼真空干燥得粗品。干法上样经柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1：20，v/v)分离，得单十二烷基罗丹明(0.316g，60.1％)。

3、共振体系的建立以及对微丝菌的识别

在75μmol/L的苄基三乙基氯化铵水溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.5μmol/L，加入上述单十二烷基罗丹明荧光探针使其终0.075μmol/L，震荡1分钟，加入含有微丝菌的污泥摇匀后进行标记识别。标记后的微丝菌在荧光显微镜下显示红色丝状物，标记成功。

实施例4

1、量子点制备

在10ml的反应瓶中加入5.0ml超纯水、0.0255g的碲粉和0.0378g的硼氢化钠，氮气置换三次，40度反应30分钟备用。

在装有搅拌子的100ml的单口瓶中加入0.0255g的氯化镉、0.0378g的巯基乙酸和50ml超纯水，用氮气置换三次，加入4ml前驱体，水浴加热至内温90度保持10分钟即停止加热，降温待用。

2、探针的制备

向装有搅拌子的100ml四口烧瓶中加入N,N-二甲氨基酮酸0.285g(1.00mmol)，3-十六烷基-苯酚0.416g(1.25mmol)和甲基磺酸(6ml)。在N₂保护下，加热至90℃反应。12小时后停止反应，降至室温后加入60ml冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝5，过滤，将滤饼真空干燥得粗品。干法上样经柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1：20，v/v)分离，得单十六烷基罗丹明(0.326g，58％)。

3、共振体系的建立以及对微丝菌的识别

在50μmol/L的四丁基溴化铵水溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.2μmol/L，加入上述单十六烷基罗丹明荧光探针使其终0.06μmol/L，震荡1分钟，加入含有微丝菌的污泥摇匀后进行标记识别。标记后的微丝菌在荧光显微镜下显示红色丝状物，标记成功。

实施例5

1、量子点制备

在10ml的反应瓶中加入5.3ml超纯水、0.0255g的碲粉和0.0252g的硼氢化钠，氮气置换三次，50度反应25分钟备用。

在装有搅拌子的100ml的单口瓶中加入0.0255g的氯化镉、0.0300g的巯基乙酸和48ml超纯水，用氮气置换三次，加入5ml前驱体，水浴加热至内温90度保持20分钟即停止加热，降温待用。

2、探针的制备

向装有搅拌子的100ml四口烧瓶中加入N,N-二甲氨基酮酸0.285g(1.00mmol)，3-双十六烷基氨基-苯酚0.66g(1.20mmol)和甲基磺酸(10ml)。在N₂保护下，加热至90℃反应。15小时后停止反应，降至室温后加入100ml冰水，用饱和碳酸钠溶液中和至pH＝5，过滤，将滤饼真空干燥得粗品。干法上样经柱层析(甲醇：二氯甲烷＝1：20，v/v)分离，得双十六烷基不对称罗丹明(3)(0.25g，31％)。

3、共振体系的建立并对微丝菌的识别

在50μmol/L的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，加入上述制备的量子点水溶液使其终浓度为0.2μmol/L，加入上述双十六烷基罗丹明荧光探针使其终0.06μmol/L，震荡1分钟，加入含有微丝菌的污泥摇匀后进行标记识别。标记后的微丝菌在荧光显微镜下显示红色丝状物，标记成功。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

一种可识别微丝菌的能量共振体系及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。