专利摘要

本发明公开了一种低荧光背景荧光探针及其合成方法和用途，为咔唑吡啶苯并吲哚类，以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1：1.1～2的2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化剂量哌啶，加热回流4-12小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。本发明的低荧光背景荧光探针与平行结构的G-四链体DNA(c-myc2345)结合后荧光增强超过百倍，具有抗肿瘤药物先导化合物的特性。本发明的低荧光背景荧光探针具有荧光背景低、与DNA结合特异性强、制备简单和结构稳定等特点。

权利要求

1.一种低荧光背景荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针结构如下：

2.一种如权利要求1所述低荧光背景荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1：1.1～2的2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化剂量的哌啶，加热回流4-12小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到低荧光背景荧光探针。

3.一种如权利要求1所述低荧光背景荧光探针的用途，其特征在于，用于与DNA-G四链体的特异性结合，用于抗肿瘤药物先导化合物的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成、化学分析和生物分析领域，尤其涉及一种低荧光背景荧光探针及其合成方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康和生命的重大疾病，近年来，以生物靶分子为基础进行抗肿瘤药物先导化合物的筛选时抗肿瘤的研究热点之一。如何快速高效的找到作用于特定靶标的药物，是目前药物研究要解决的瓶颈问题。DNA G-四链体结构的发现为解决上述问题提供了一个新的契机。

在人类基因启动区以及致癌基因(例如c-myc,k-ras,bcl-2,c-kit,RET)都存在富含鸟嘌呤的序列，且都能形成G-四链体结构，因此以DNA G-四链体为抗癌药物作用靶点对化合物进行筛选和结构设计是目前化学家和生物学家密切关注的热点。

DNA G-四链体与恶性肿瘤的关系密切，能诱导DNA G-四链体结构稳定的化合物能够为法阵新的抗肿瘤药物开辟一条行之有效的途径。

研究不同的核酸结构与小分子的相互作用对发展灵敏检测核酸的分子探针和设计靶向核酸的治疗药物均具有重要意义.研究一些染料在水溶液中的荧光量子产率非常低，与核酸结合后荧光量子产率显著增加，因此被作为分子探针广泛用于核酸的分析、检测与结构。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种咔唑吡啶苯并吲哚类的低荧光背景荧光探针及其合成方法和用途。

为了解决上述问题，本发明的低荧光背景荧光探针，所述的荧光探针结构如下：

所述低荧光背景荧光探针的合成方法，包括如下步骤：以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1：1.1～2的2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化剂量的哌啶，加热回流4-12小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到低荧光背景荧光探针。

所述低荧光背景荧光探针用于与DNA-G四链体的特异性结合，用于抗肿瘤药物先导化合物的筛选。

本发明的优点：1)价格低、荧光背景小、显色强。2)与DNA作用强，荧光增加倍数大。3)在抗肿瘤先导化合物研究方面具有潜在的参考价值。

附图说明

图1为6μM的荧光探针与11种18μM的DNA作用后的荧光发射光谱。

图2为荧光探针与11种DNA作用后的荧光增强倍数曲线(荧光探针浓度固定为6μM,DNA浓度为0、1.5、3.0、6.0、9.0、12和18μM)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的合成方程式：

咔唑吡啶苯并吲哚荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

以乙醇为溶剂，加入摩尔比为1：1.1～2的2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐和3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑以及催化剂量(0.1ml)哌啶，加热回流4-12小时；反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。

荧光探针与DNA相互作用操作步骤如下：

将探针用DMSO配制成浓度为1×10^-3mol/L的母液。G-四链体DNA采用pH＝7.4且含有10mmol/L KCl(或NaCl)的Tri-HCl进行溶解，根据样品在260nm处的吸收值和摩尔消光系数计算其浓度。

紫外吸收光谱测定。配制待测样品总体积为500μL，化合物的浓度固定为6μmol/L。DNA的浓度分别为0、1.5、3.0、6.0、9.0、12和18μmol/L。在4℃下孕育2小时，分别用紫外分光光度计来测定300-700nm之间的吸收光谱。再使用荧光分光度计进行荧光发射光谱的测定。

实施例1

在50ml的四口瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐(0.33g,1.0mmol)、3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(0.36g,1.1mmol)、25ml无水乙醇和0.1ml哌啶，加料完毕加热至回流4小时，TLC监控反应完毕，浓缩后进行柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(3:1)作为流动相得到荧光探针0.40g，收率63.0％。

实施例2

在50ml的四口瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐(0.33g,1.0mmol)、3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(0.65g,2mmol)、25ml无水乙醇和0.1ml哌啶，加料完毕加热至回流12小时，TLC监控反应完毕，浓缩后进行柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(3:1)作为流动相得到荧光探针0.42g，收率66.0％。

实施例3

在50ml的四口瓶中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸基盐(0.33g,1.0mmol)、3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(0.48g,1.5mmol)、25ml无水乙醇和0.1ml哌啶，加料完毕加热至回流4小时，TLC监控反应完毕，浓缩后进行柱层析分离，用二氯甲烷/甲醇(3:1)作为流动相得到荧光探针0.415g，收率65.0％。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆):δ1.39-1.43(t,J＝7.2Hz,3H),2.03-2.08(m,2H),2.10(s,6H),2.20-2.23(m,2H),2.84-2.87(t,J＝6.2Hz,2H),4.53-4.58(m,2H),4.84-4.88(m,2H),7.67(d,J＝5.6Hz,2H),7.70-7.78(m,4H),7.80-7.83(t,J＝6.8Hz,3H),8.07(d,J＝16Hz,1H),8.16(d,J＝9.2Hz,1H),8.22(d,J＝8.0Hz,1H),8.28-8.31(m,2H),8.44(d,J＝8.4Hz,1H),8.55(d,J＝5.6Hz,2H),8.75(d,J＝16Hz,1H),8.96(s,1H),9.65(s,1H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-D₆):δ182.18,170.81,155.2,150.0,145.9,144.0,141.2,138.9,138.2,134.0,133.4,,131.4,130.5,129.7,128.8,127.8,127.3,126.9,124.7,124.3,124.0,123.8,123.4,121.3,113.4,110.6,110.4,109.3,60.3,53.7,49.7,46.7,44.2,26.5,24.2,22.7,22.6,22.1,21.3,14.6,14.4.ESI Mass：m/z＝676.6(M+Na⁺).

实施例4

将荧光探针用DMSO配制成浓度为1×10^-3mol/L的母液。G-四链体DNA(采用pH＝7.4且含有10mmol/L KCl(或NaCl)的Tri-HCl进行溶解，根据样品在260nm处的吸收值和摩尔消光系数计算其浓度。

紫外吸收光谱测定。配制待测样品总体积为500μL，化合物的浓度固定为6μmol/L。DNA的浓度分别为0、1.5、3.0、6.0、9.0、12和18μmol/L。在4℃下孕育2小时，分别用紫外分光光度计来测定300-700nm之间的吸收光谱。再使用荧光分光度计进行荧光发射光谱的测定(如图1、2)。如图中所显示结果，荧光探针与c-myc(K⁺或Na⁺)作用后荧光增强倍数大于110倍。与其他DNA作用强度都小于40倍以下，与DNA结合特异性明显。

其中，所用的DNA序列为：

A24：(ttaggg)4；

H24：ttggg(ttaggg)3a；

c-myc2345:tgagggtggggagggtggggaa；

c-kit1:agggagggcgctgggaggaggg；

bcl-22345:gggcgcgggaggaattgggcggg；

S22:(ccctaa)3ccct；

VEGF:gggcgggccgggggcggg；

22AG in Na+:AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG；

S24:(ccctaa)4；

ds26:CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG；

D24(A24和S24按照1：1混合)。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

一种低荧光背景荧光探针及其合成方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。