专利摘要

本发明公开了一种高灵敏检测次氯酸根的荧光探针及其合成方法和应用，属于化学分析检测技术领域。本发明探针由醛基化苯并唑荧光团与羟胺通过脱水缩合得到，具有如下结构通式：此探针的荧光团为苯并噻唑骨架结构，对次氯酸根的响应基团为羟胺单元。单独的探针在溶液中的紫外吸收峰位于~350nm，无显著荧光发射。与次氯酸根反应后，其紫外吸收峰红移至~410nm；在~540nm处荧光发射显著增强，紫外灯下发出黄色荧光。该探针分子对次氯酸根有高的选择性和灵敏度，检测范围为0.5–18μmol·L‑1，检测限为0.08μmol·L‑1。该探针可用于活细胞中次氯酸根的成像检测。

权利要求

1.一种检测次氯酸根的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中R₁为S、O或NH；R₂为SH、OH或NH₂；n为1至18的整数。

2.如权利要求1所述的检测次氯酸根的荧光分子探针，其特征在于，

R₁为S或O；R₂为SH或OH；n为1至6的整数。

3.如权利要求2所述的检测次氯酸根的荧光分子探针，其特征在于，

R₁为S；R₂为OH；n为1至4的整数。

4.如权利要求3所述的检测次氯酸根的荧光分子探针，其特征在于，荧光分子探针具体结构为：

。

5.合成如权利要求1所述的检测次氯酸根的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

I

将具有通式I所示的醛基化苯并唑与羟胺在有机溶剂中溶解，加入有机碱，回流反应，分离纯化后得到探针分子；

其中：R₁为S、O或NH；R₂为SH、OH或NH₂；n为1至18的整数；

所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；有机碱为三乙胺，哌啶，吡啶中的一种或多种。

6.如权利要求4所述的检测次氯酸根的荧光分子探针的合成方法，其特征在于，通过如下方法实现：

II

将具有式II所示的醛基苯并噻唑在乙醇中溶解后加入羟胺与三乙胺，回流反应，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。

7.如权利要求1-4其中之一所述的检测次氯酸根的荧光分子探针的应用，其特征在于，利用该分子探针对水体及生物体系中次氯酸根进行定性或定量测定。

8.如权利要求7所述的检测次氯酸根的荧光分子探针的应用，其特征在于，采用荧光检测时，将本发明分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲体系中，加入含不同浓度次氯酸根溶液，测试其在540 nm处的荧光强度，然后以溶液在540 nm 处荧光发射强度对次氯酸根的浓度作标准图，根据标准图，定量检测次氯酸根在待测溶液中的含量。

9.如权利要求7所述的检测次氯酸根的荧光分子探针的应用，其特征在于，通过将细胞生物样品与本发明分子探针培育，利用荧光成像的方法对细胞生物样品中的次氯酸根进行捡测。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种荧光法检测次氯酸根的分子探针及其制备方法和在检测次氯酸根方面的应用。

背景技术

次氯酸根(ClO^-)或次氯酸(HClO)是一种常用的消毒剂与氧化剂。而在生物体内又是一种非常重要活性氧，在很多生理过程和疾病中发挥着重要的作用。如，在人体炎症发生过程中，由骨髓过氧化物酶催化过氧化氢和氯离子产生的ClO^-具有强大的杀菌功能。另一方面ClO^-在人体内能的异常代谢能导致氧化氨基酸、蛋白质、胆固醇及核酸的氧化，从而使得这些重要生物分子的功能发生紊乱。因此，开发高灵敏、高选择检测次氯酸根的方法对人体健康状况的准确监测是非常必要的。

传统的检测次氯酸根的方法有滴定法，电化学方法等。但这些方法一般操作繁琐，而且难以实现生物活性样品的原位检测。而利用分子探针荧光法检测次氯酸根具有样品处理简洁、测量速度快、能实现原位实时检测等优点，近年来得到了发展与利用。但目前开发的用于检测次氯酸根的探针分子存在一些缺陷，如灵敏度低，合成繁琐，制备成本高，反应机理复杂难以准确再现等(文献Jin X.L.Sens.Actuators B.2016,232,300；FanJ.L.Analyst.2015,140,4594；Liao,Y-X.RSC Adv.,2015,5,18275；LiX.H.Sens.Actuators B.2017.247.609.)。因此，亟待开发性能优良的次氯酸根探针克服存在的上述问题。

发明内容

对于上述情况，本发明目的是提供一种新的易于制备、性能稳定的高灵敏检测次氯酸根的荧光探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对次氯酸根进行高选择性和高灵敏度的检测方法。

为实现本发明目的，本发明一方面利用次氯酸根具有较强的特殊氧化性，能氧化特殊的富电子的有机基团，设计一定结构的羟胺基团选择性的被次氯酸根氧化；另一方面醛基化的苯并唑具有优良的光谱特性，其醛基与羟胺缩合反应后，荧光能够被有效猝灭，而次氯酸根将羟胺氧化后，又能恢复其强荧光发射。基于此，设计了一种羟胺为响应基团，醛基化的苯并唑作为发光团的用于检测次氯酸根的荧光分子探针。

所述检测次氯酸根的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中，R₁为S、O或NH；R₂为SH、OH或NH₂；n为1至18的整数；

优选：R₁为S或O；R₂为SH或OH；n为1至6的整数，

更优选：R₁为S；R₂为OH。n为1至4的整数。

进一步优选为：

其合成方法具体如下：

将醛基化苯并唑与羟胺在有机溶剂中溶解，加入有机碱，回流反应，分离纯化后得到探针分子。

其中，R₁，R₂n同上。

所述有机溶剂为二氯甲烷、乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。

有机碱为三乙胺，哌啶，吡啶中的一种或多种。

上述方法中反应温度为溶剂回流温度。

上述方法中反应时间为0.5-24h。

优选其制备方法如下：

将醛基苯并唑在乙醇中溶解后加入羟胺与三乙胺，回流反应2-8h，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。

化合物1合成方法如下：

将醛基苯并噻唑在乙醇中溶解后加入羟胺与三乙胺，回流反应2h，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物1。反应流程如下：

利用该分子探针对次氯酸根进行定性和定量测定，用于水体或生物体系中次氯酸根的检测。

采用荧光法对次氯酸根进行检测，将所述分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲体系中，加入含不同浓度次氯酸根溶液，测试其在540nm处荧光强度，然后以溶液在540nm处荧光强度对次氯酸根的浓度作标准图，根据标准图，定量检测待测次氯酸根溶液含量。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对次氯酸根的检测浓度为0.5–1μmol·L^-1，检测限为0.08μmol·L^-1。

本发明所述检测次氯酸根的分子探针的另一种应用方式为通过将细胞生物样品与所述分子探针培育，利用荧光成像的方法对细胞生物样品中的次氯酸根进行捡测。

本发明所述荧光法检测次氯酸根的分子探针，优选采用醛基苯并噻唑与羟胺通过缩合反应合成得到，醛基苯并噻唑为荧光基团；羟胺为次氯酸根的响应基团。

在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。将本发明荧光分子探针溶解于水与二甲基亚砜(DMSO)的混合缓冲溶液中，当加入次氯酸根后，次氯酸根能氧化羟胺基团，从而抑制-C＝N-键的扭转猝灭效应，使探针溶液荧光发射显著增强，室温下便可以对次氯酸根进行测试。

本发明荧光法检测次氯酸根的分子探针具体特征如下：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前最大吸收波长为～350nm，无显著荧光发射；随着次氯酸根的加入，探针分子在紫外谱图在～410nm处出现了一个小的吸收峰，并在～540nm处呈现及强的荧光发射，观测到的黄色荧光。

本发明优点：所述的探针分子原料易得，合成产率较高，达65％以上。光学性能稳定(探针溶液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变)，灵敏度较高，对次氯酸根识别能力强，选择性好，且响应速度较快，响应范围为0.5–18μmol·L^-1，检测限低(0.08μM，基于国际纯粹与应用化学联合会给出的3倍空白样品标准差的方法)，因此，该类型探针可用于水体及生物体系中次氯酸根的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱。

图2为本发明10μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度次氯酸根后紫外吸收谱图，从a至m，次氯酸根浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μmol·L^-1，溶液体系为水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液(H₂O/DMSO＝9/1,v/v,10mM HEPES,pH 7.4)，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图3为本发明10μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度次氯酸根后荧光发射光谱图，从a至m，次氯酸根浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μmol·L^-1，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为次氯酸根的浓度标准曲线图，即10μmol·L^-1本发明分子探针，反应前后在540nm处荧光发射强度和次氯酸根浓度的线性关系；横坐标为次氯酸根的浓度，纵坐标为荧光发射强度值。

图5为本发明分子探针对次氯酸根选择性；即10μM本发明分子探针，加入20μmol·L^-1氧化活性物质(^tBuOOH、Fe³⁺、H₂O₂、NO、¹O₂、·OH、·O₂^–、TBHP)后，在540nm处荧光发射强度值；横坐标为测试的物质，坐标为荧光发射强度值。

图6为本发明分子探针检测Hela细胞内次氯酸根的成像图片。(A,B)分别是本发明荧光探针(10μmol·L^-1)培养的HeLa的明场图片和荧光图片；(C,D)分别是本发明荧光探针(10μmol·L^-1)和次氯酸根(20μmol·L^-1)培养的Hela细胞的明场图片和荧光图片。标尺：50μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：本发明荧光分子探针的合成

将羧基苯并噻唑(0.135g,0.5mmol)与羟胺(0.033g,1.0mmol)溶于乙醇(10mL)，加入三乙胺(0.101g,1.0mmol)后加热回流反应2h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析住分离(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇＝2/3的混合溶液)得到产物白色固体0.183g(收率：65％)。产物结构式如下:

¹H NMR(400MHz,DMSO):δ11.63(s,1H),8.45(s,1H),8.18(d,J＝7.6Hz,1H),8.09(d,J＝7.7Hz,1H),7.99(s,1H),7.56(d,J＝7.8Hz,2H),7.49(d,J＝7.6Hz,1H),2.36(s,3H).(see Figure S1).MS[ESI]:m/z,calcd for[M+H]⁺258.06；found 285.01.。

实施例2：探针对次氯酸根的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液(H₂O/DMSO＝9/1,v/v,10mM HEPES,pH 7.4))，配制成10μmol·L^-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的10μmol·L^-1本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的次氯酸根后均匀混合，测试其紫外与荧光光谱，结果如图2，3所示。以溶液在540nm处荧光发射强度值对次氯酸根的浓度作图，次氯酸根浓度在0.5–18μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图4)。并且此探针不受其它一些常见活性氧化物质的影响，如：^tBuOOH、Fe³⁺、H₂O₂、NO、¹O₂、·OH、·O₂^–、TBHP。在上述干扰离子存在的条件下，探针对含次氯酸根仍具有良好的选择性和灵敏度(图5)。

将细胞与含本发明探针培养液培养后，再与含次氯酸根的溶液培养。细胞荧光成像可观测到红色荧光(图6)。

可以看出，本发明能实现对次氯酸根的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达0.08μmol·L^-1，且抗干扰强，并能实现细胞内次氯酸根的检测。

一种高灵敏检测次氯酸根的荧光探针及其合成方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。