专利摘要

本发明公开一种偶氮染料金橙II降解菌及其生产的菌剂。该菌株是氧化微杆菌Microbacteriumoxydans的菌株L-11，于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNO.9130，主要生物学特性为菌落圆形不透明，培养1～3天菌落为白色，继续培养菌活为黄色，液体培养为黄色，培养最适温度28～30℃，pH7.2；该菌属放线菌。降解菌L-11能使偶氮染料金橙II的残留量降低80﹪以上。本发明偶氮染料金橙II降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合水及土壤的污染治理。 CGMCCNO.9130 2014.05.08

权利要求

1. 一种偶氮染料金橙II降解菌，其特征在于该菌株是氧化微杆菌Microbacterium oxydans的菌株L-11，于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.9130，主要生物学特性为菌落圆形不透明，培养1～3天菌落为白色，继续培养菌活为黄色，液体培养为黄色，培养最适温度28～30℃，pH 7.2；该菌属放线菌。

2.利用如权利要求1所述的一种偶氮染料金橙II降解菌生产的菌剂，该菌剂是通过以下方法制备而成，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1).将偶氮染料金橙II降解菌的试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

步骤(2).将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方及质量含量为：蛋白胨0.5﹪、酵母膏0.25﹪，用蒸馏水配制，pH为7.0；

步骤(3).将种子液按10﹪接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

步骤(4).在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48～60h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种偶氮染料金橙II降解菌及其生产的菌剂，是利用微生物的方法降解染料，适用于环境污染的治理。

背景技术

微生物由于种类多，代谢类型多样，在处理染料废水较之物理、化学方法有很大优势，尤其是微生物处理偶氮染料。好氧条件下，菌体不能很好的代谢偶氮染料；厌氧条件下，很多微生物种类能断裂亲电性的偶氮键，由偶氮还原酶将偶氮染料降解成2种无色芳香胺。这些芳香胺厌氧条件下不能进一步降解，且对动物体有毒，致癌。但芳香胺为好氧生物降解的有效底物，在好氧条件下可进一步降解为苯酚等物质，如果好氧—厌氧工艺用于废水处理，芳香胺可通过好氧条件下氧化途径开环机理被彻底矿化。

偶氮分子的发色基是偶氮键，助色基是氨基、羟基、甲基和磺酸基等，当光线射入后发生选择性吸收而产生视觉所感受到的各种颜色。偶氮染料生物脱色过程的最初脱色反应是在偶氮还原酶的催化作用下进行的偶氮键断裂[16]。脱色过程可以在好氧条件下进行，但厌氧条件能显著促进脱色过程。脱色反应可用下式表示：

在对具有偶氮染料废水脱色能力的微生物的筛选上己得到多个菌株，脱色菌多数是从污水处理厂污泥或受染料污染的土壤中获得。如徐文东等从驯化后的处理毛纺厂染料废水活性污泥中分离得到一株降解高效菌，经鉴定该菌为嗜热鞘氨醇杆菌。罗志腾从长期染色废水污染土壤中，筛选到1株酵母菌能够以直接橙8作唯一氮源。刘生浩等采用富集培养的方法，从土壤中分离得到一株对偶氮染料酸性大红(GR)和酸性黑(ATT)有较强脱色能力的青霉菌P-93。

自然界中能降解吡唑类的微生物资源正在不断被发现，这些微生物资源为难降解有机工业废水的强化处理奠定了基础。偶氮染料金橙II产品可溶于水，偶氮染料金橙II对环境的污染，已严重危害着人类的健康其环境的综合治理，偶氮染料金橙II在环境中的降解菌的开发未见有比较成熟的技术。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种偶氮染料金橙II降解菌。

本发明提供的偶氮染料金橙II降解菌，其菌株是氧化微杆菌Microbacterium oxydans的菌株L-11，于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.9130，主要生物学特性为菌落圆形不透明，培养1～3天菌落为白色，继续培养菌活为黄色，液体培养为黄色，培养最适温度28～30℃，pH7.2；该菌属放线菌。

本发明的另一个目的提供利用上述的偶氮染料金橙II降解菌生产菌剂的方法，其工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—产品(包装剂型为液体菌剂)。

该方法的具体步骤是：

步骤(1).将偶氮染料金橙II降解菌的试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

步骤(2).将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方及质量含量为：蛋白胨0.5﹪、酵母膏0.25﹪，用蒸馏水配制，pH为7.0；

步骤(3).将种子液按10﹪接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

步骤(4).在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～240r/min，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为48～60h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。

本发明的具体有益效果：

本发明偶氮染料金橙II降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合水及土壤的污染治理。本发明对于保护生态环境，保护人类身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌L-11能使偶氮染料金橙II的残留量降低80﹪以上。L-11菌株能以偶氮染料金橙II为碳源和能源进行生长，并可在短时间内偶氮染料金橙II降解。

附图说明

图1为接种量对L-11降解效率的影响；

图2为初始pH对L-11降解效率的影响；

图3为温度对L-11降解效率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的分析。

偶氮染料金橙II降解菌，其菌株是氧化微杆菌Microbacterium oxydans的菌株L-11，于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.9130。

1.菌株的分离和鉴定

取污染土壤10g，置于100ml的无菌水中，振荡5min，得土壤菌悬液；取5ml的土壤菌悬液，加入到100ml的无机盐培养基[NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0]中，添加金橙II作为碳源，置于30℃，150r/min摇床培养获得富集液，连续在添加金橙II的培养基平板上涂布，直到获得金橙II的降解菌株。该降解菌命名为L-11，进一步纯化并鉴定为氧化微杆菌Microbacterium oxydans。L-11菌株主要生物学特性菌落圆形不透明，培养1～3天菌落为白色，继续培养菌活为黄色，液体培养为黄色。培养最适温度28～30℃，pH7.2。该菌属放线菌。能以金橙II为碳源进行生长，最适生长温度为30℃。在实验室摇瓶培养条件下金橙II的降解率达75﹪以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

2.实验室生物降解实验

2.1接种量对L-11降解效率的影响

菌株L-11在LB培养基(LB培养基配方g/L：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L,pH7.0)中培养至对数期，按0.5﹪、1﹪、2﹪、3﹪、4﹪、5﹪的接种量分别接种到培养液[无机盐培养基[NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0]，置于30℃、150r/min摇床培养，在培养后24h分别测定培养液在600nm处的OD值。结果如图1所示，接种量越大，金橙II的降解效率就越高；当接种量大于2﹪时在增大接种量对金橙II降解影响不大。虽然菌体的生长量随着接种量增加而提高，考虑到菌体生长情况以及经济的原因，采用1﹪的接种量即可达到要求。

2.2pH对L-11降解效率的影响

pH值是影响微生物生长和生存的另一个重要环境因素，微生物生长有一个适宜的pH值范围，超过适宜生长的pH值范围，大多数微生物都不能很好人的生长。

菌株L-11在LB培养基(LB培养基配方g/L：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L,pH7.0)中培养至对数期；按1﹪的接种量分别接种到七种不同pH的培养液，其中培养液[无机盐培养基[NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0]pH值分别调至4.0、6.0、7.0、8.0、10.0；置于30℃、150r/min摇床培养，在培养后8h、16h、24h和32h分别测定培养液在600nm处的OD值。pH对菌株L-11生长的影响如图2所示。结果表明：L-11菌株生长的适宜pH值范围在7～10，最佳pH值为7～8。

2.3温度对L-11降解效率的影响

温度是影响微生物生长和生存的最重要的环境因素之一。菌株L-11在LB培养基(LB培养基配方g/L：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L,pH7.0)中培养至对数期，按1﹪的接种量接种到培养液[无机盐培养基[NH₄NO₃：407mg/L；KH₂PO₄：98mg/L；K₂HPO₄：33mg/L；NaCl：30mg/L；MgSO₄：200mg/L；pH7.0]，分别置于18℃、28℃、30℃、33℃、37℃下培养，在培养后8h、16h和24h分别测定培养液在600nm处的OD值。温度对菌株L-11生长的影响如图3所示。结果表明：在实验的温度范围内，菌体均有不同程度的生长，温度为28～30℃时，生长最好，超过或低于该温度时，菌体生长速度减慢，而在37℃下培养时，菌种易老化。因此，L-11的最佳生长温度为28～30℃。3.生产实施例

将金橙II降解菌的试管种接种到发酵培养基中，振荡培养至对数期，准备接种种子罐；然后将上述培养好的菌种按10﹪的接种量接种到500L种子罐，恒温培养至对数生长期，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，培养温度为30℃，搅拌速度为180～240r/min，种子罐所用的培养基配方的质量含量为：葡萄糖0.1﹪，蛋白胨0.5﹪，酵母膏0.25﹪，用无菌水配制，pH7.2～7.5；将种子罐中的种子液按10﹪接种量接入生产罐中培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，培养温度为30℃，搅拌速度为180～240r/min，整个工艺流程培养时间为48～60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。该液体剂即为菌剂。

一种偶氮染料金橙II降解菌及其生产的菌剂专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。