IPC分类号 : C07K16/40,C07K16/06,C12N9/02,C12N15/53,C12N15/70
专利摘要
一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于,包括以下步骤： 步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆： 提取黄鳝总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；进行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示； 步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建： 根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物re-ex-F和re-ex-R，分别在上、下游引物添加了EcoR I和Hind III酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-Eakr； 步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化： 将步骤(2)得到的重组表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况； 以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS-PAGE电泳检测纯化的黄鳝Eakr重组蛋白； 步骤(4)多克隆抗体的制备及Western blot分析： 将步骤(3)纯化的黄鳝pET-Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗血清，纯化得到黄鳝Eakr多克隆抗体。 2.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一对特异性引物为： 引物名称为AKR-F，引物序列为：5’-ACATCCAGACCAGCGACCTGCA-3’； 引物名称为oligod(T)，引物序列为： 5’-TGCCGAATCTTTTTTTTTTTTTAGC-3’。 3.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增时，PCR扩增的反应体系为，总体积为25μL时： 反应条件为： 4.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第二对特异性引物为： 上游引物名称为re-ex-F， 引物序列为：5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’； 下游引物名称为re-ex-R， 引物序列为：5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’； 任选地，PCR扩增的反应体系为，总体积为25μL时： 反应条件为： 5.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，IPTG进行诱导时，IPTG的添加时间点为大肠杆菌BL21(DE3)进入指数生长期时，IPTG的终浓度为0.05mol/L，IPTG的诱导时间为3小时；所述裂解缓冲液组分为：6mol/L盐酸胍， 10mmol/L咪唑，50mmol/L PBS。 6.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，黄鳝Eakr重组蛋白的分子量为37.7kDa。 7.如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述免疫的免疫量为0.2mg。
一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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