专利摘要

本发明公开了一种氯化藻类有机质溶液、及其制备方法和毒性分析方法。本发明的氯化藻类有机质溶液是通过先采用氮气吹干的方法获得小球藻藻体，液氮研磨后复溶，保持溶液总有机碳含量为40～60mg/L，氯化，并以碱性溶液进行中和，制备了一种稳定的Cl‑AOM溶液，本发明的Cl‑AOM毒性分析是通过PCR技术检测Cl‑AOM暴露caco‑2细胞后其P450系统中CYP1A1和CYP1B1的表达量来实现的，其在Cl‑AOM混合溶液水平直接进行毒性检测，大大节省了时间。此外，PCR技术能够检测到微量的基因表达差异，具有检测限低、准确度高和灵敏度好的特点，能够对痕量毒性物质引起的基因表达差异进行检测。

权利要求

1.一种氯化藻类有机质的毒性分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将氯化藻类有机质溶液溶解DMEM干粉后进行灭菌；

(2)、在无菌的氯化藻类有机质溶液中加入FBS、青霉素和链霉素，使其浓度分别为20％v/v、100U/mL和100μg/mL；

(3)、将步骤(2)的溶液作用于人源细胞caco-2 1h，当细胞活力低于80％时，检测P450系统中CYP1A1和CYP1B1基因的表达水平；

所述氯化藻类有机质溶液的制备方法包括以下步骤：

a、使用BG11培养基培养小球藻后，离心干燥，得到小球藻藻粉；

b、使用缓冲液溶解藻粉，调节溶液的有机碳含量为40～60mg/L，离心，取上清液过0.45um滤膜；所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸二氢钠-氢氧化钠、甘氨酸-氢氧化钠中的一种或几种；

c、加入次氯酸钠溶液，于16～37℃氯化1～72h后，氯化后溶液余氯含量为1.80～2.40mg L-1，碱性溶液中和余氯，即得氯化藻类有机质溶液。

2.根据权利要求1所述的氯化藻类有机质的毒性分析方法，其特征在于，所述CYP1A1和CYP1B1基因表达水平采用PCR技术进行分析。

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，更具体的，本发明涉及一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法。

背景技术

水体中的藻类(小球藻)过度繁殖会导致水体中有机质的增加，这些有机质经自来水厂氯化消毒后会产生成百上千种消毒副产物(Disinfectionbyproducts，DBPs)，如氯仿、三氯甲烷和氯乙腈等。目前已有大量关于单种DBPs毒性分析的报道，但氯化藻类有机质(chlorinated algae organic matter，Cl-AOM)的制备及毒性研究尚鲜有报道，Cl-AOM经消化系统进入人体，其毒性是其含有的各种DBPs及其它毒性物质综合作用的结果，因此，基于Cl-AOM进行毒性检测具有重要的现实意义。

人源细胞由于来源于人体组织，具有良好的代表性，Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，与分化的小肠上皮细胞具有类似的结构和功能，是Cl-AOM毒性分析的首选细胞模型。Caco-2细胞具有细胞色素P450系统，细胞色素P450系统的酶系是人体细胞催化代谢外来物质的主要酶系，能够通过氧化反应消除或减弱部分外来物质的毒性。毒性物质作用于细胞后，会刺激基因mRNA的表达，随之P450蛋白合成增加，表现在酶活的增加。P450系统中的酶能催化7-乙氧基异吩恶唑酮生产异吩恶唑，通过检测异吩恶唑的荧光活性，能反应P450酶的活性，进而检测物质的毒性。

目前，已有通过细胞色素P450系统酶活进行毒理学研究的报道，常见的是使用7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶(EROD)活性进行检测。如许友卿等在发明专利CN106093332A中公开了利用鱼的EROD检测水体污染的方法，徐镜波等通过鱼肝微粒体EROD活性对9种硝基苯的毒性进行了报道，刘芸等在发明专利CN102520154A中公开发明了一种通过检测大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞EROD酶活性检测环境中二恶英类物质的方法，江艳艳等(1980)用苯并[α]芘对人胎盘绒毛膜上皮细胞进行诱导，通过EROD活性检测发现细胞色素P4501A1的活性明显增加，陈曦等(2011)用DEHP和B(a)P联合染毒诱导HepG2细胞，发现细胞的CYP1A1在基因、蛋白和酶活性水平均具有一定程度的变化。

国内外对于Cl-AOM的相关污染物的毒性常采用动物的EROD实验进行检测。然而，动物的P450酶与相对应的哺乳动物的酶在底物专一性上有很大差别，不能反映出物质的人体毒性情况。此外，EROD实验操作繁琐，结果精确度不高，不同实验存在一定的差别。人源细胞模型是模拟人体、检测毒性的理想模型，但如何选择检测靶点是目前应用细胞模型进行Cl-AOM毒性分析的难点。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)、使用BG11培养基培养小球藻后，离心干燥，得到藻粉；

(2)、使用缓冲液溶解藻粉，调节溶液的有机碳含量为40～60mg/L，离心，取上清液过0.45um滤膜；

(3)、加入次氯酸钠溶液，于16～37℃氯化1～72h后，氯化后溶液余氯含量为1.80～2.40mg L^-1，碱性溶液中和余氯，即得氯化藻类有机质溶液。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述离心条件为5000rpm10min，步骤(2)中所述离心条件为8000rpm 5min。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述干燥为低温冷冻干燥、氮气吹干、真空干燥中的一种或几种，优选为氮气吹干。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述有机碳含量是采用TOC-10B、TOC-500、TOC-5000、TOC-V系列、TOC-4100、1270-M、1555B、6800或Lotix-TOC仪器进行测定的，优选采用Lotix-TOC进行测定。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸二氢钠-氢氧化钠、甘氨酸-氢氧化钠，优选为磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH 7，0.2M NaH₂PO₄和0.2M NaOH)。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述有机碳含量为50mg/L。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述氯化后溶液余氯含量为2.0mg L^-1。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述碱性溶液为Na₂SO₃、NaOH、Ca(OH)₂中的一种或几种，优选为Na₂SO₃溶液。

在其中一些实施例中，步骤(3)中于20℃氯化24h。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的氯化藻类有机质溶液。

本发明还提供了氯化藻类有机质的毒性分析方法，包括以下步骤：

(1)、将上述氯化藻类有机质溶液溶解DMEM干粉后进行灭菌；

(2)、在无菌的氯化藻类有机质溶液中加入FBS、青霉素和链霉素，使其浓度分别为20％v/v、100U/mL和100μg/mL；

(3)、将步骤(2)的溶液作用于人源细胞1h，当细胞活力低于80％时，检测P450系统中CYP1A1和CYP1B1基因的表达水平。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述灭菌为高压灭菌或无菌滤头过滤灭菌，优选为无菌滤头过滤灭菌。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述人源细胞为caco-2、EC9706、BGC823或SW480，优选为caco-2。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述CYP1A1和CYP1B1基因表达水平采用PCR(聚合酶链式反应)技术进行分析。

本发明申请人通过基因组学检测方法对Cl-AOM溶液作用caco-2细胞后的总RNA进行分析，发现P450系统中的CYP1A1和CYP1B基因表达明显受到Cl-AOM溶液的影响，表达水平显著增高，是Cl-AOM溶液毒性分析的潜在靶点。因此，通过分析P450系统中CYP1A1和CYP1B基因表达量能一定程度上对外来物质的毒性进行分析。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的氯化藻类有机质(Cl-AOM)溶液是通过先采用氮气吹干的方法获得小球藻藻体，液氮研磨后复溶，保持溶液总有机碳含量为40～60mg/L，氯化，并以碱性溶液进行中和，制备了一种稳定的Cl-AOM溶液，目前尚未见细胞实验用小球藻氯化溶液制备方法的报道；

2、氯化藻类有机质(Cl-AOM)溶液中含有大量毒性物质，常用方法是先对各种毒性物质进行检测，然后逐一进行毒性分析，本发明的Cl-AOM毒性分析是通过PCR技术检测Cl-AOM暴露caco-2细胞后其P450系统中CYP1A1和CYP1B1的表达量来实现的，其在Cl-AOM混合溶液水平直接进行毒性检测，大大节省了时间，此外，PCR技术能够检测到微量的基因表达差异，具有检测限低、准确度高和灵敏度好的特点，能够对痕量毒性物质引起的基因表达差异进行检测。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1 一种氯化藻类有机质溶液的制备方法

本实施例的一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)、使用BG11培养基培养小球藻，于1000勒克斯(lux)光照下进行培养，光照周期为14:10h，当藻生长至对数期后，5000转每分钟离心10分钟，收集小球藻，使用超纯水洗涤一次，低温冷冻干燥，液氮研磨后即为小球藻藻粉；

(2)、使用超纯水溶解后，过0.45μm滤膜，使用TOC仪进行总有机碳含量测定，使用pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液再次溶解藻粉，调节总有机碳含量为40mg/L，8000rpm离心5min，取上清液过0.45um滤膜；

(3)、加入次氯酸钠溶液对小球藻溶液进行氯化，氯化条件为避光、16℃、1h，余氯含量为1.80mg L^-1，使用NaOH溶液中和余氯，然后用此溶液溶解杜尔贝科改良伊格尔培养基粉末(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)，得到Cl-AOM溶液。

实施例2 一种氯化藻类有机质溶液的制备方法

本实施例的一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)、使用BG11培养基培养小球藻，于1000勒克斯(lux)光照下进行培养，光照周期为14:10h，当藻生长至对数期后，5000转每分钟离心10分钟，收集小球藻，使用超纯水洗涤一次，真空干燥，液氮研磨后即为小球藻藻粉；

(2)、使用超纯水溶解后，过0.45μm滤膜，使用TOC仪进行总有机碳含量测定，使用pH7.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液再次溶解藻粉，调节总有机碳含量为60mg/L，8000rpm离心5min，取上清液过0.45um滤膜；

(3)、加入次氯酸钠溶液对小球藻溶液进行氯化，氯化条件为避光、37℃、72h，余氯含量为2.40mg L^-1，使用Ca(OH)₂溶液中和余氯，然后用此溶液溶解杜尔贝科改良伊格尔培养基粉末(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)，得到Cl-AOM溶液。

实施例3 一种氯化藻类有机质溶液的制备方法

本实施例的一种氯化藻类有机质溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)、使用BG11培养基培养小球藻，于1000勒克斯(lux)光照下进行培养，光照周期为14:10h，当藻生长至对数期后，5000转每分钟离心10分钟，收集小球藻，使用超纯水洗涤一次，氮气吹干，液氮研磨后即为小球藻藻粉；液氮吹干对仪器要求较低，干燥效果好，能降低成本、提高效率。

(2)、使用超纯水溶解后，过0.45μm滤膜，使用TOC仪进行总有机碳含量测定，使用pH7.0的磷酸盐缓冲液再次溶解藻粉，调节总有机碳含量为50mg/L，8000rpm离心5min，取上清液过0.45um滤膜；

(3)、加入次氯酸钠溶液对小球藻溶液进行氯化，氯化条件为避光、20℃、24h，余氯含量为2.0mg L^-1，使用Na₂SO₃溶液中和余氯，然后用此溶液溶解杜尔贝科改良伊格尔培养基粉末(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)，得到Cl-AOM溶液。

实施例4 一种氯化藻类有机质溶液的毒性分析方法

本实施例的氯化藻类有机质的毒性分析方法，包括以下步骤：

(1)、将实施例1的氯化藻类有机质溶液使用无菌滤头过滤；

(2)、在灭菌后的氯化藻类有机质溶液中加入20％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；

(3)、使用步骤(2)的溶液作用于caco-2细胞1h，使细胞活力小于80％后，提取细胞的总RNA，使用TakaraprimeScript RT mastermix perfect real time试剂盒进行逆转录，使用SYBR Premix Ex TaqII试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件分别如下：

使用2^{-[(处理组目的基因Ct-对照组目的基因Ct)-(处理组内参基因Ct-对照组内参基因△Ct)]}进行结果分析，发现Cl-AOM溶液作用caco-2细胞后，CYP1A1和CYP1B1基因表达量分别升高了3.04倍和2.12倍。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

一种氯化藻类有机质及其制备方法和毒性分析方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。