IPC分类号 : C12N7/00,A61K35/76,A61P31/04,C12R1/92
专利摘要
本发明公开了一种调控珊瑚菌群的温和噬菌体VneM1及其应用。噬菌体VibrioneocaledonicusbacteriophageVneM1,保藏号:GDMCCNO.61215‑B1。本发明从珊瑚共生菌VibrioneocaledonicusSCSIO43009中分离得到一种新的噬菌体—噬菌体VibrioneocaledonicusbacteriophageVneM1,该噬菌体VneM1对珊瑚共生弧菌具有裂解作用,调控珊瑚共生微生物组成,水螅体侵染实验证实其能延缓升温引起的珊瑚白化。噬菌体VneM1是温和噬菌体,通常情况下,整合在溶原菌SCSIO43009基因组上以原噬菌体形式存在。可自发进行溶原‑裂解转换产生噬菌体,并且环境因素,如SOS应激反应能促进其溶原‑裂解转换。
权利要求
1.噬菌体
2.权利要求1所述的噬菌体
3.一种裂解弧菌
说明书
本发明属于海洋生物领域,具体涉及一种调控珊瑚肠道菌群的温和噬菌体及其应用。
背景技术
珊瑚礁是由珊瑚、鱼类、藻类等海洋动植物以及微生物等组成的一类物种多样性丰富的海洋生态系统。珊瑚礁生态系统生产力极高,具有重要的经济价值,同时对在生物地球化学循环等过程中有重要作用。然而,在全球变暖等环境压力和人为压力的共同作用下,珊瑚礁生态系统的生产力在过去30年间急剧下降。我国的珊瑚礁现状尤为严峻,构成大陆与海南岛暗礁的造礁珊瑚数量已经下降了80%。据报道,造成其急剧下降的重要原因之一是珊瑚疾病的爆发。其中,一半以上的珊瑚疾病与其共生的微生物密切相关。珊瑚组织内部和表面粘液中都含有丰富的微生物,珊瑚和这些与其相关的微生物共同构成珊瑚共生总体(coral holobiont)。珊瑚共生微生物的群落组成和结构是影响珊瑚共生总体健康的重要因素。在环境压力下,珊瑚共生总体将通过微生物基因组重组和突变、功能微生物类群的获得或丢失、水平基因转移等多种方式进化,选择出对珊瑚共生总体有益的微生物组,从而使珊瑚更能耐受环境压力。同时,珊瑚共生总体中的微生物可以通过多种方式,例如光合作用、固氮、提供营养和抵御疾病等,来维持共生总体的平衡,这种平衡是共生微生物和环境因子直接动态作用的结果。但是,珊瑚共生微生物也可能直接导致珊瑚疾病。温度升高、酸化等环境压力下,珊瑚条件致病菌
在人和动物共生总体中,噬菌体是人和动物肠道菌群的核心成员和潜在的调节因子,通过调控肠道微生物群落组成影响人和动物的健康。使用限菌小鼠模型研究发现,噬菌体的裂解作用不仅直接调控敏感细菌的种群,还通过细菌间互作对其他细菌种群产生级联效应,从而影响定植在肠道中的其他噬菌体非敏感细菌的种群。不仅如此,噬菌体引起的菌群变化直接影响肠道代谢组,从而影响动物宿主的健康。研究者们也在致力于通过对噬菌体和肠道菌群关系深入认识一些人类疾病,比如II型糖尿病,哮喘症及肥胖,从中寻求一些有效的治疗手段。在珊瑚共生总体中,噬菌体对珊瑚的健康起重要作用。噬菌体可能通过裂解病原菌来帮助珊瑚抵御疾病,比如利用BA3噬菌体特异性杀死珊瑚致病菌
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能裂解珊瑚共生弧菌,调控珊瑚共生微生物菌群,增强丛生盔形珊瑚的高温耐受性的噬菌体
本发明的第二个目的是提供噬菌体
本发明的第三个目的是提供一种裂解珊瑚共生弧菌的制剂、调控珊瑚共生微生物菌群的制剂和/或增强珊瑚的高温耐受性的制剂,其含有噬菌体
所述的珊瑚共生弧菌优选为
所述的珊瑚优选为丛生盔形珊瑚。
本发明从珊瑚共生菌
综上,本发明中发现VneM1对珊瑚肠道菌群的调控作用在该领域具有开创性,为利用噬菌体治疗珊瑚弧菌引起的珊瑚疾病提供了备选噬菌体。
噬菌体
附图说明
图1 中的A是噬菌体VneM1的序列分析,图1中的B是透射电子显微镜观察噬菌体VneM1的形态。
图2 中的A是原噬菌体VneM1可进行溶原-裂解转换介导宿主菌的自裂解,图2中的B是产生噬菌斑(指示菌为SCSIO 43009),图2中的C是荧光显微镜观察噬菌体VneM1在溶原菌SCSIO 43009培养过程中可自发进行溶原-裂解转换。荧光强度表示噬菌体的增殖情况。其中SCSIO 43009表示含有VneM1原噬菌体的宿主菌。+MMC表示加入了1 mM 丝裂霉素C诱导细胞的SOS应激反应。ΔVneM1表示在SCSIO 43009中敲除VneM1原噬菌体的突变株。PC表示白光下视野;GFP表示荧光下视野;Merge表示两个视野叠加。
图3 是噬菌体VneM1对多种珊瑚共生菌的裂解作用。
图4 是利用单水螅体侵染模型,检测高温胁迫条件(32℃)下,分别注射海水、无VneM1原噬菌体的SCSIO 43009菌液、整合VneM1的SCSIO 43009菌液和注射VneM1噬菌体对丛生盔型珊瑚的健康的影响和白化率情况。
图5 是注射海水、噬菌体VneM1的珊瑚样品在高温胁迫条件下(32℃)处理7天后的珊瑚共生微生物多样性分析结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
一、
-80℃保存的珊瑚共生菌
二、噬菌体VneM1的分离鉴定
本研究采用双层平板法对VneM1噬菌体进行分离、纯化:首先,分别配置好半固体的R-top培养基(含0.75%琼脂的2216E培养基)和R-bottom培养基(含1.5%琼脂的2216E培养基);将SCSIO 43009在2216E培养基中培养过夜,将1 µg/ml的丝裂霉素加入过夜培养的SCSIO43009菌液中,以1:3的体积比与半固体的R-top培养基混合,铺在倒好的R-bottom培养基上,30℃培养箱中过夜孵育,至能观察到噬菌斑。其次,在形成大量噬菌斑的平板上用牙签轻轻挑出单个噬菌斑溶于100 µl的SM buffer(100 mM NaCl,8 mM MgSO4,50 mM Tris-HCl)中;取2 µl与过夜培养的SCSIO 43009菌液混合,30℃培养箱中过夜孵育,直至能观察到噬菌斑;重复上述纯化步骤三次,将平板上形成的噬菌斑溶于SM buffer 中,最终得到大量纯的噬菌体存储溶液备用。
噬菌体总DNA提取:挑取SCSIO 43009 单菌落于25 ml 2216E培养基中,30℃过夜摇瓶培养。按1:100的比例接种过夜菌液于1 L的2216E培养基中,30℃摇瓶培养12 h。取1ml噬菌体存储溶液加入1 L菌液中,继续摇瓶培养6 h。用PEG8000沉淀噬菌体,方法如下:将孵育过后的菌液冷却至室温,加胰DNase I 和 RNase至终浓度为1 µg/ml,室温孵育30min;每500 ml培养物中加入29.2 g固体NaCl,搅拌使其溶解,然后冰浴1 h;4℃,11000 g离心10 min以去除细胞碎片;取上清,加PEG8000至终浓度为10%(m/V),缓慢搅拌至其完全溶解;溶解后的溶液4℃静置,过夜沉淀。4℃,11000 g离心10 min以回收沉淀的噬菌体,去上清,去除残余液体,得到噬菌体沉淀。沉淀后的噬菌体纯度高,直接采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,BEIJING)进行总DNA提取,由此得到噬菌体基因组DNA,用于VneM1噬菌体的全基因组测序。
接着,我们对噬菌体分别进行了总DNA测序和透射电子显微镜观察。测序结果表明,VneM1噬菌体基因组为双链环状DNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,大小为35kb左右,编码48个ORF,经注释发现具有功能的ORF有22个,包括噬菌体的整合酶、调控基因、复制蛋白和结构蛋白等,其余的ORF均为假想蛋白或未知功能蛋白(表1和图1A)。对噬菌体VneM1进行定位分析,发现VneM1的DNA整合在SCSIO 43009染色体上DsbA家族硫氧还原蛋白编码基因的5’端,由于VneM1原噬菌体两端的整合位点序列一致,VneM1的整合不影响侧翼基因的序列。同时,透射电镜检测结果显示噬菌体VneM1是典型的有尾噬菌体,具有二十面体的头部和可伸缩的尾部,属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)(图1B),将噬菌体VneM1命名为:噬菌体
表1.噬菌体VneM1所含基因的功能注释
三、原噬菌体VneM1可经过溶源-裂解转换成噬菌体
SCSIO 43097中原噬菌体VneM1敲除株的构建方法如下:
本研究选用了依赖于CRISPR/Cas9系统的质粒pMBLcas9(构建方法参见文献:Wang etal.,
研究发现,SCSIO 43009在2216E培养基中过夜培养时,菌体自发裂解,而敲除VneM1原噬菌体的突变株后,不发生自裂解现象。经双层平板检测确定这是由于整合在SCSIO 43009上的VneM1原噬菌体经过溶原裂解转换产生了噬菌体粒子,使宿主菌SCSIO43009发生了自裂解导致的。在2216E培养基中添加1 µg/ml丝裂霉素会促进自裂解的发生,释放的噬菌体粒子效价增加了1000倍(图2A和2B),说明细菌的SOS应激反应会激活VneM1原噬菌体的溶源-裂解转换。噬菌体自身编码的主要衣壳蛋白MCP是噬菌体组装的必须因子,当噬菌体以原噬菌体形式整合在基因上时表达量低,荧光显微镜观察不到绿色荧光,只有在噬菌体大量复制和组装过程中高表达,这时可以观察到荧光,因此可用来指示噬菌体形成和释放过程。
于是本研究利用自杀质粒plp12(Luo et al., PLoS ONE, 2015, 10 (12):e0144465)对VneM1噬菌体的Peg902主要衣壳蛋白(MCP)进行绿色荧光标记,实验过程如下:首先,设计引物将
对菌株43009 MCP::gfp在2216E液体培养基中培养过夜,取少量菌体进行荧光显微镜观察,实验发现43009 MCP::gfp在培养过程中一部分细胞能发出绿色荧光,且有的细胞荧光很强,充满整个细胞;荧光视野中细胞外存在大量荧光颗粒(见图2C),这些说明VneM1是一株温和噬菌体,在培养过程中可发生溶源-裂解转换,在宿主细胞内进行复制和扩增,并释放到胞外。
表2 本发明中使用的引物
四、噬菌体VneM1裂解多种珊瑚共生弧菌
利用双层平板法检测噬菌体VneM1对珊瑚共生菌的裂解作用,首先,分别配置好半固体的R-top培养基(含0.75%琼脂的2216E培养基)和R-bottom培养基(含1.0%琼脂的2216E培养基);其次,以各种珊瑚肠道消化循环腔中分离的共生弧菌为测试菌,用2216E培养基进行过夜培养,将获得的菌液与半固体的R-top培养基以1:3的体积混合,铺在倒好的R-bottom培养基上,然后将梯度稀释好的VneM1噬菌体储存溶液点于倒好的R-top培养基上,30℃培养箱中过夜孵育,观察到噬菌斑的产生情况并记录拍照。双层平板法检测发现,噬菌体VneM1可裂解多种珊瑚共生弧菌,包括来自
五、噬菌体VneM1能调控珊瑚共生微生物菌群,增强丛生盔形珊瑚的高温耐受性
检测VneM1噬菌体对珊瑚肠道菌群组成和珊瑚健康的影响是通过单水螅体侵染模型在珊瑚体内完成的,采用的实验珊瑚是南海造礁珊瑚丛生盔形珊瑚。首先,选取珊瑚群体非边缘部分的成熟健康单杯,将单杯珊瑚用胶水固定于陶瓷基底上,并在珊瑚循环养殖系统中暂养14 天,以消除分离过程中对珊瑚造成的生理损伤。随后,设置实验组和对照组,每组10个珊瑚水螅体,置于含有1.8L海水的烧杯中,置于循环加热系统中。分别将20μl海水、无VneM1原噬菌体的SCSIO 43009菌液(10
利用单水螅体侵染模型,检测高温胁迫条件(32℃)下,噬菌体VneM1对珊瑚健康的影响,结果表明只注射海水的对照组在升温后第3天白化率为20%,第5天白化率达到100%;注射不含有VneM1的SCSIO 43009菌液的珊瑚升温第4天白化率为10%,第6天达到100%;而注射整合VneM1的SCSIO 43009菌液的珊瑚和注射噬菌体VneM1的珊瑚白化现象明显延后,其中注射VneM1噬菌体悬液对珊瑚白化的延缓作用最为明显,第6天开始有白化现象,白化率为10%(图4)。随后,选取实验前、注射海水和注射噬菌体升温培养7天的珊瑚个体,对水螅体活体部分进行研磨处理,冷冻保存送公司进行基因扩增子高通量测序,明确溶源性噬菌体VneM1对丛生盔形珊瑚细菌群落结构和多样性的影响。通过16s rRNA扩增子高通量测序分析发现,相对实验前的健康珊瑚,高温胁迫条件(32℃)下,注射噬菌体的珊瑚比注射海水的对照组珊瑚微生物多样性更为丰富,弧菌上升的比例较小(图5)。以上结果表明:VneM1噬菌体能调控丛生盔型珊瑚微生物菌群,增强丛生盔型珊瑚的高温耐受性。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种调控珊瑚菌群的温和噬菌体VneM1及其应用
<141> 2020-10-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35529
<212> DNA
<213> 噬菌体(Vibrio neocaledonicus bacteriophage VneM1)
<400> 1
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tttaaaatca ccaatatatg aatgttgctg gtaaatggtg agtgttgctg agcaacgccg 120
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atttctaaga acatcgacgg ctttgctatg gacgatgaag tgtccgacga aacaggcaaa 12060
tcagtcaaag acatggcgaa gaacgtcagc gcatggaaaa gccgctgggc gattcgccag 12120
tttcaatttt ttggtggtgc gccggttacg acttaccgag agctgcgccg cttcgcgagc 12180
Q:办理专利转让的流程及所需资料
A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。
1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2:按规定缴纳著录项目变更手续费。
3:同时提交相关证明文件原件。
4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q:专利转让变更,多久能出结果
A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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