专利摘要

本发明公开了一种耐热新城疫病毒突变株及其制备方法与应用。该突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：V202041。其制备方法是以新城疫病毒TS09‑C株作为母本株，在其HN蛋白中引入4个氨基酸突变：第3位精氨酸突变为丝氨酸，第197位的精氨酸突变为异亮氨酸，第203位的组氨酸突变为天冬酰胺和第495位的赖氨酸突变为颉氨酸。耐热试验结果表明，病毒突变株的耐热特性明显高于母本毒株，更是远远高于常用的疫苗株，证实了本发明进一步提升了现有耐热毒株的热稳定性。

权利要求

1.一种耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4，该病毒突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202041。

2.如权利要求1所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4，其特征在于，所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4是以新城疫病毒TS09-C株作为母本株，在其HN蛋白中引入4个氨基酸突变：第3位精氨酸突变为丝氨酸，第197位的精氨酸突变为异亮氨酸，第203位的组氨酸突变为天冬酰胺和第495位的赖氨酸突变为颉氨酸，得到所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4。

3.如权利要求1所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4，其特征在于，所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4的HN蛋白基因序列为SEQ ID NO:1。

4.如权利要求1至3任一项所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建新城疫病毒TS09-C株的转录质粒；b.将所述TS09-C株转录质粒中HN基因的第3、197、203和495位氨基酸分别突变为丝氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和颉氨酸；c.将突变的转录质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得新城疫病毒突变株。

5.如权利要求1至3任一项所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4在制备新城疫的耐热活疫苗方面的应用。

说明书

技术领域

本发明属疫苗基因工程领域，具体涉及一种耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-NU4。更具体地，本发明涉及到利用反向遗传操作技术，以点突变的方式，对新城疫病毒进行耐热改造，获得耐热改造的新突变病毒株，以及该毒株在疫苗制备方面的应用。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种高度接触性传染病，对全世界家禽业造成了巨大的威胁。NDV属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属成员，是一种含有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒。NDV基因组编码6个主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(Fusionprotein，F)和依赖性RNA聚合酶(L)。已有研究研究表明NDV的HN蛋白是决定病毒粒子热稳定性的关键因素。

目前新城疫的防控主要依赖于疫苗接种，传统疫苗主要是灭活苗和弱毒活疫苗，较大程度减少了新城疫流行带来的危害。目前临床上使用的灭活苗主要是LaSota株、Ulster2C株和Clone30株三种，油乳剂灭活苗可产生较高水平的抗体，且免疫保护期长，但需要肌肉注射，费工费时，免疫成本高，且影响禽肉品质。弱毒活疫苗主要是基因II型疫苗株LaSota株，由于其使用方便(饮水、滴鼻/点眼、喷雾等多种方式给苗)，在国内应用最为广泛。但由于此类活疫苗耐热性能较差和冷藏条件要求高，常因保存或使用不当而导致免疫不完全，甚至免疫失败，这也是造成非典型性新城疫频发的主要原因之一。部分新城疫病毒弱毒株具有较好的热稳定特性，如V4、TS09-C株等，此类疫苗便于在气温较高地区和冷链系统不完善的农村应用，在新城疫防控中发挥了重要作用。因此，探讨新城疫病毒的耐热机理以及如何进一步提升现有弱毒株的热稳定性显得极具意义。

NDV反向遗传学的快速发展使得对NDV进行点突变修饰、插入外源基因、基因片段交换等基因操作成为可能。关于新城疫耐热疫苗和反向遗传操作方法的文献较多，但均未涉及到对新城疫病毒进行点突变耐热改造方法的报道。例如：申请号为201110163109.3的专利文献“一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株及其制备方法和应用”公开了适应传代细胞系的新城疫病毒耐热株及其在耐热疫苗制备领域的应用。申请号为201210090099.4的专利文献“新城疫病毒耐热或疫苗载体系统及其应用”公开了新城疫病毒耐热活疫苗载体系统和通过HN基因交换改造病毒热稳定性的方法。通过HN基因交换的方法可一定程度提升非耐热病毒的热稳定性，但如何提升现有耐热毒株的热稳定？由于没有更耐热的病毒株HN基因可以交换，因此，HN基因互换方法无法进一步提升现有耐热毒株的热稳定性。故急需研发一种针对现有耐热毒株进一步提升其热稳定性的方法。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供一种热稳定性更强的耐热新城疫病毒突变株及其制备方法与应用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4，该病毒突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202041，保藏时间为2020年7月31日。

优选地，所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4是以新城疫病毒TS09-C株作为母本株，在其HN蛋白中引入4个氨基酸突变：第3位精氨酸突变为丝氨酸，第197位的精氨酸突变为异亮氨酸，第203位的组氨酸突变为天冬酰胺和第495位的赖氨酸突变为颉氨酸，得到所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4。所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4的HN蛋白基因序列为SEQ ID NO:1。

所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4的制备方法，包括以下步骤：a.构建新城疫病毒TS09-C株的转录质粒；b.将所述TS09-C株转录质粒中HN基因的第3、197、203和495位氨基酸分别突变为丝氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和颉氨酸；c.将突变的转录质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得新城疫病毒突变株。

所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4在制备新城疫的耐热活疫苗方面的应用。

本发明的有益效果是：

1)本发明以新城疫病毒耐热TS09-C株的转录质粒为基础，将TS09-C株转录质粒中HN基因的第3、197、203和495位氨基酸分别突变为丝氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和颉氨酸，构建出点突变的转录质粒，通过病毒拯救的方法，获得新的病毒突变株。耐热试验结果表明，病毒突变株的耐热特性明显高于母本毒株，更是远远高于常用的疫苗株，证实了本发明进一步提升了现有耐热毒株的热稳定性。

2)相对于其他新城疫病毒弱毒株，耐热改造后的弱毒株热稳定性更好，以其制备的活疫苗在保存和运输过程可以不过分依赖低温和冷链运输设备，不需要添加耐热保护剂就可以延长疫苗的保质期，降低成本，同时有利于疫苗在高温地区和冷藏设备不足的地区进行大规模推广和应用。热稳定性良好的活疫苗可以通过喷雾或者饮水等便捷的免疫方式进行应用。

附图说明

图1是新城疫病毒突变株的基因组结构示意图。

图2是新城疫病毒突变株的细胞增殖曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

本发明提供一种耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4，该耐热疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202041，保藏时间为2020年7月31日。

所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4是以新城疫病毒TS09-C株作为母本株，在其HN蛋白中引入4个氨基酸突变：第3位精氨酸突变为丝氨酸，第197位的精氨酸突变为异亮氨酸，第203位的组氨酸突变为天冬酰胺和第495位的赖氨酸突变为颉氨酸，得到所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4。所述耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4的HN蛋白基因序列为SEQ ID NO:1。

本发明还提供所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4的制备方法，包括以下步骤：a.构建新城疫病毒TS09-C株的转录质粒；b.将所述TS09-C株转录质粒中HN基因的第3、197、203和495位氨基酸分别突变为丝氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和颉氨酸；c.将突变的转录质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得新城疫病毒突变株。

本发明还提供所述的耐热新城疫病毒突变株rTS-HN-PU4在制备新城疫的耐热活疫苗方面的应用。

下面以具体实施例进行说明。

实施例1

新城疫病毒突变株转录质粒的构建和病毒拯救

根据突变方案，以基因合成的方式获得四种突变的HN基因序列(HN-P4、HN-PU4、HN-NU4和HN-UP4)。HN-P4的突变方案为62位的A突变为R、98位的N突变为K、293位的E突变为K、494位的D突变为G。HN-PU4的突变方案为3位的R突变为S、197位的R突变为I、203位H突变为N、495位的K突变为V。HN-UP4的突变方案为62位的A突变为R、280位的Q突变为R、353位的Q突变为R、570位的G突变为R。HN-NU4的突变方案为147位的D突变为G、293位的E突变为G、309位的D突变为N、494位的D突变为G。将其分别替换TS09-C株转录质粒中的HN基因，获得四种改造的转录质粒(pTS-HN-P4、pTS-HN-PU4、pTS-HN-NU4和pTS-HN-UP4)，如图1所示。将改造的转录质粒与辅助质粒共转染至BHK-21细胞，获得耐热改造的新城疫病毒突变株4株，分别为rTS-HN-P4(对照例)、rTS-HN-PU4(本发明)、rTS-HN-NU4(对照例)和rTS-HN-UP4(对照例)。上述四种突变病毒的构建与拯救方案中，除送至公司合成的序列有差异外，其余操作基本一致。

1.1突变的HN基因序列

将突变的HN基因序列送至公司合成，以含有突变HN序列的T载体为模板，设计特异性引物：上游引物5’-ATGATGAAAGAGAGGCAAAAAATACATGG-3’，下游引物5’-CTGCTTGAACTCACTCGAGTAATGCG-3’(下划线部分为用于Infusion克隆连接的同源序列)。以高保真DNA聚合酶 GXL DNA Polymerase进行改造HN基因的扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA胶回收试剂盒进行特异性目的条带的回收，获得突变的HN基因片段。

1.2TS09-C转录质粒线性化

设计并合成与一对PCR引物用于扩增TS09-C转录质粒中除HN基因以外全部序列(引物5’端引入一段同源序列，使改造的HN基因扩增产物与线性化克隆载体之间具有能够互相同源重组的完全一致的序列)：上游引物5’-AGTGAGTTCAAGCAGTACCAAAGCAGCATACAC-3’，下游引物5’-CCTCTCTTTCATCATTCTCTAACGCAACTTGGCTA-3’(下划线部分为用于Infusion克隆连接的同源序列)。PCR反应体系由5×PrimeSTAR GXL Buffer，dNTP Mixture(2.5mMeach)，上下游Primer(0.2-0.3μM)，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，H2O和模板组成。PCR扩增条件为98℃10sec，60℃15sec，68℃1min/kb，35Cycles。以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将PCR扩增条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，获得TS09-C株转录质粒(除HN基因)线性化产物。

1.3突变株转录质粒的连接与鉴定

按照In-Fusion HD Cloning Kit说明书，将突变的HN基因片段和TS09-C株转录质粒线性化片段进行In-fusion连接，并转化DH5α感受态细胞，涂布抗性LB平板，倒置培养16h后挑取单菌落进行PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒的提取。

1.4突变株转录质粒的酶切鉴定

将鉴定为阳性的转录质粒用Bam HI限制性内切酶进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测条带均与预期一致。转录质粒送公司测序分析，表明成功构建了含有突变HN基因的转录质粒。

1.5突变株病毒的拯救

转染前一天将生长状态良好的BHK-21细胞转至6孔板，保证转染当天细胞密度达到80％左右，HBSS清洗细胞三次后，更换含有2％血清的DMEM培养基，同时加入0.01MOI的痘病毒，37℃孵育1h。利用Lipofectamine 3000转染试剂将突变的转录质粒和分别表达NP、P、L蛋白的三个辅助质粒共转染至BHK-21细胞，质粒的量分别为1.25μg，0.313μg，0.313μg，0.625μg。转染6h后，HBSS清洗细胞三次，更换含有0.4μg/mL TPCK胰酶、2％青链霉素双抗的DMEM，观察细胞病变情况，待细胞出现明显病变并脱落时，反复冻融三次，采用0.22μm孔径的滤器过滤除去痘病毒，在9-11日龄SPF鸡胚中传代3次，采用HA效价检测和RT-qPCR方法鉴定新城疫病毒。鉴定正确的新城疫病毒突变株既可用于后续研究。

实施例2

新城疫病毒突变株的热稳定性试验

将分别感染有4株新城疫病毒突变株的尿囊液，100μL/管，56℃水浴进行热处理，设置3个重复，分别于0、2、5、10、15、30、60、120、180min时取出病毒尿囊液，迅速置于冰上，检测病毒的血凝(HA)效价，统计效价变化情况，得到表1。如表1所示，与母本TS09-C株相比，rTS-HN-P4、rTS-HN-NU4和rTS-HN-UP4株的HA热稳定性均显著下降，只有rTS-HN-PU4的HA热稳定性显著提升。该毒株在56度热处理180min后，HA效价仅下降3log2，而母本TS09-C株已经下降为0。对照LaSota株在热处理5分钟后，已经下降至1log2。因此，4株新城疫病毒突变株中仅有rTS-HN-PU4的HA热稳定性显著提升。进一步测定了4个突变株的感染力耐热性，在56度处理相应的时间后，梯度稀释接种至BHK-21细胞，测定其TCID50效价变化情况，绘制感染力耐热曲线，计算出感染力下降1log10(90％)所需的时间T90。结果表明，rTS-HN-P4、rTS-HN-NU4、rTS-HN-UP4和rTS-HN-PU4的T90分别为4.3、4.0、4.5和25.5min，对照TS09-C和LaSota株的T90分别为12.7和1.5min。因此，在4株突变株中，仅有rTS-HN-PU4株的热稳定性显著提升，比母本TS09-C株提升了2.7倍(25.2/12.7)，比常见的LaSota株提升了17倍(25.2/1.5)。

表1.新城疫病毒突变株的HA耐热性测定结果

+表示病毒具有鸡胚感染性，－表示病毒不具有鸡胚感染性

实施例3

新城疫病毒rTS-HN-PU4株的细胞增殖试验

为分析点突变是否对rTS-HN-PU4株的细胞增殖滴度造成影响，比较了rTS-HN-PU4株与母本TS09-C株在细胞上的增殖情况。将稀释后的两株病毒接种至已长成致密单层的BHK-21细胞，在接种后0，24，48，72、96小时，分别收取细胞上清液。将收取的上清液进行10倍梯度稀释，每个稀释度取100μL接种至含有单层BHK-21细胞的96孔板中，每个稀释度设置3个重复，根据细胞病变情况计算TCID50，绘制病毒的生长动力学曲线。结果如图2所示，rTS-HN-PU4株在感染细胞72h后基本达到平台期，效价为106.86TCID50/ml，与母本TS09-C株生长曲线相似。因此，点突变未对rTS-HN-PU4株的细胞增殖滴度造成影响。

实施例4

新城疫病毒rTS-HN-PU4株的致病性分析

以病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)和脑内致病指数(ICPI)评价rTS-HN-PU4株的致病性。MDT/MLD检测方法：将rTS-HN-PU4株病毒尿囊液进行10倍梯度稀释，接种SPF鸡胚，100μL/枚，连续观察7天，记录鸡胚的死亡时间，计算出MDT/MLD值。ICPI检测方法：将10倍梯度稀释的rTS-HN-PU4株病毒尿囊液接种1日龄SPF雏鸡，10只/组，接种量50μL/只，每天观察一次，并给鸡打分，正常鸡为0，发病鸡为1，死亡鸡为2。共观察8天，计算出ICPI值。结果显示，不同稀释度的病毒接种鸡胚120h均不死亡，rTS-HN-PU4株的MDT/MLD值大于120h，ICPI值为0.00。母本TS09-C株的MDT也为大于120h，ICPI值为0.00。因此，rTS-HN-PU4株保持了母本TS09-C株的弱毒特性。

实施例5

新城疫病毒rTS-HN-PU4株的免疫原性分析

为分析点突变是否对rTS-HN-PU4株的免疫原型造成影响，开展了rTS-HN-PU4株的鸡免疫试验。以滴鼻点眼的方式接种两周龄SPF雏鸡，剂量为106.0EID50/只，同时设置两个对照组，分别为母本TS09-C株和未免疫组。免疫两周后经翅静脉采血，分离血清，测定其血凝抑制抗体水平。结果表明，除空白对照组外，其余两组均为HI抗体阳性。其中TS09-C株免疫组的平均抗体水平为23.6，rTS-HN-PU4组的平均抗体水平为24.8。因此，rTS-HN-PU4株对鸡的免疫原性高于母本TS09-C株，可以作为新城疫耐热活疫苗的候选毒株。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种耐热新城疫病毒突变株及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1851

<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 1

atggacagcg cagttagcca agttgcgcta gagaatgatg aaagagaggc aaagaataca 60

tggcgcttgg tattccggat cgcaatccta ctctcaacgg tggtgacctt agccatctct 120

gcagccgccc ttgcatatag catggaggcc agcacaccta gcgatcttgt aggcataccg 180

actgcgatct ctagagcaga ggaaaagatt acatctgcac tcggttccaa tcaagatgta 240

gtagatagga tatataagca ggtggccctc gaatctccac tggcattgct aaacaccgaa 300

tctacaatta tgaacgcaat aacgtctctc tcttatcaaa tcagtggggc cgcaagtagc 360

agcggatgtg gagcacccat tcatgatcca gattatattg gaggaatagg taaagaactt 420

attgtagatg atgctagcga cgtcacatca tactatccct ctgcgttcca agaacacctg 480

aactttatcc cggcgcctac tacaggatca ggttgcactc ggatgccctc atttgacatg 540

agcgctaccc actactgtta tactcacaat gtgatattat ctggctgcat cgatcactcg 600

cactcaaatc aatatttagc acttggtgtg cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc 660

ttttccactc tgcgttccat caatctggat gacacccaaa atcggaagtc ttgcagtgtg 720

agtgcaaccc ccttgggttg tgatatgctg tgctctaaag tcacagagac tgaagaagag 780

gattataact cagctatccc cacgtcgatg gtacatggaa ggttagggtt cgacggccaa 840

taccacgaga aggacctaga tgtcacaaca ctattcgagg actgggtggc aaactaccca 900

ggagtaggag gcgggtcttt tattgacaac cgcgtatggt tcccagttta cggagggcta 960

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aatgacacat gtccagatga gcaagattat cagattcaaa tggctaagtc ttcatataag 1080

cctgggcggt ttggagggaa acgcgtacag caggccgtct tatctatcaa agtgtcaaca 1140

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gaaggcagag ttctcacagt agggacatct catttccttt atcagcgagg gtcatcatac 1260

ttctcccctg ccctactata tcctatgata gtcagcaaca aaacagccac tcttcatagt 1320

ccttatacat tcaatgcctt cactcgacca ggtagtgtcc cttgccaggc ttcagcaaga 1380

tgccctaact catgtgttac cggagtctat actgatccat atcccttggt cttctatagg 1440

aaccacacct tgcgaggggt attcgggacg atgcttgatg atgttcaagc aagactcaac 1500

cctgtatctg cagtatttga cagcatatcc cgcagtcgca taacccgggt gagttcaagc 1560

agcaccaagg cagcatacac aacatcaaca tgttttaaag ttgtaaagac caataaaacc 1620

tattgtctca gcattgccga aatatccaat accctcttcg gggaattcag aatcgtccct 1680

ttactagttg agattctcaa ggatgatggg gttagagaag ccaggtctag ccggttgagt 1740

caactgcgag agggttggaa agatgacatt gtatcaccta tcttttgcga cgccaagaat 1800

caaactgaat accggcacga gctcgagtcc tacgctgcca gttggccata a 1851

一种耐热新城疫病毒突变株及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。