IPC分类号 : D04H1/728,D04H1/4382,A61L15/28,A61L15/32,A61L15/42,A61L15/40,A61K47/36,A61K47/42,C12N15/87,C12N5/00
专利摘要
本发明公开了仿生纳米纤维材料及其制备方法与应用，涉及医用生物材料技术领域。仿生纳米纤维材料，包括丝素蛋白‑壳聚糖纳米纤维膜和液晶态胶原，一部分液晶态胶原填充在纳米纤维膜的孔隙中，另一部分液晶态胶原包覆于纳米纤维膜的表面。制备方法包括将丝素蛋白‑壳聚糖纳米纤维膜和高浓度胶原溶液复合，然后于醋酸溶液蒸汽中平衡，使胶原自组装配为液晶态胶原。液晶态胶原即可作为丝素蛋白‑壳聚糖纳米纤维膜细胞活化间质，能够黏附大量细胞，能够趋化细胞生长方向，又可形成长束纤维，增强纳米纤维膜的力学性能。其具有良好的力学性、较强的细胞粘附性及无免疫原性，利于细胞进行修复；可应用于敷料、组织工程支架、药物传递体中。
权利要求
1.一种仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，包括：
使第一平板、胶原溶液、丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜以及第二平板按层依次设置；
对所述第一平板或所述第二平板施加平行剪切力，使得一部分所述胶原溶液填充于所述丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的孔隙内，另一部分覆盖于所述丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面得到仿生纳米纤维材料初品，控制初品厚度为2～5mm；
将仿生纳米纤维材料初品置于0.4~0.6mol/L醋酸溶液蒸汽的密闭罐中平衡48~60h，使胶原自组装配成液晶态；然后将其移于含氨气的密闭容器中20~28h以去除醋酸后，自然晾干，得到仿生纳米纤维材料。
2.根据权利要求1所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述第一平板和所述第二平板采用表面光滑的硅晶板或薄玻璃板。
3.根据权利要求1所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液中胶原的浓度为80~120mg/mL。
4.根据权利要求3所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，每1cm
5.根据权利要求3所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，胶原为从动物肌腱上提取得到的胶原。
6.根据权利要求5所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，动物肌腱包括小鼠尾腱、大鼠尾腱或者猪脚肌腱。
7.根据权利要求5所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，从动物肌腱上提取胶原的方法包括：将动物肌腱浸泡于醋酸中，使胶原溶出，进行固液分离得到溶解有胶原的醋酸液，将所述溶解有胶原的醋酸液经透析后真空冷冻干燥得到冻干胶原。
8.根据权利要求7所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，醋酸的质量浓度为0.08~0.15%。
9.根据权利要求7所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，浸泡时间为48~50h。
10.根据权利要求7所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，采用离心的方式进行固液分离。
11.根据权利要求10所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，离心转速为3800~4200rpm，温度为3~5℃，离心时间为25~35min。
12.根据权利要求7所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，透析具体是将所述溶解有胶原的醋酸液装入透析袋，流水透析4~5d，双蒸水透析2~3d，于-85~-75℃下冷冻过夜保存后进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为72~76h。
13.根据权利要求7所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液是将所述冻干胶原溶解于乙酸溶液或盐酸溶液中，3~5℃下磁力搅拌20～24h，间隔超声使其分散均匀，置3~5℃保存备用。
14.根据权利要求13所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述乙酸溶液或所述盐酸溶液的浓度为0.4~0.6mol/L。
15.根据权利要求1或2所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的制备方法包括：
采用高温湿热交联的方式使丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维交联、固化形成丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜。
16.根据权利要求15所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，高温湿热交联的处理温度为115~130℃，压力103～115kPa，时间为15~20min。
17.根据权利要求15所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，进行高温湿热交联之前还包括：将含有丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液通过静电纺丝的方式得到所述丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
18.根据权利要求17所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述含有丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液中壳聚糖和丝素蛋白的质量比为0.23~0.25:1。
19.根据权利要求18所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述含有丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液是将丝素蛋白和壳聚糖溶解于甲酸溶液中，经磁力搅拌后得到。
20.根据权利要求19所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述甲酸溶液的质量浓度为80~98%。
21.根据权利要求19所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，混合电纺液中丝素蛋白和壳聚糖的质量浓度为17~20%。
22.根据权利要求19所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，磁力搅拌时间为3~5h。
23.根据权利要求18所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白是通过蚕丝脱胶、再生得到。
24.根据权利要求18所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白的分子量为10~200Kda。
25.根据权利要求18所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为50~180Kda，脱乙酰度为75~85%。
26.根据权利要求18所述的仿生纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，静电纺丝时调节电压11~16KV，推进速度8~15ul/min，接收距离8~15cm。
27.如权利要求1~26任一项所述的制备方法制得的仿生纳米纤维材料在医学敷料、药物载体、基因载体及细胞支架领域的应用。
说明书
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体而言，涉及仿生纳米纤维材料及其制备方法与应用。
背景技术
随着生物技术的发展，生物材料制备为敷料、支架、药物传递体等仿生医用材料，已广泛应用于损伤或坏死组织、器官的修复和替代。理想的仿生医用材料需具备良好的细胞相容性、可降解性和可塑性以及一定的机械力。用于仿生材料常为人工合成的高分子材料和天然生物材料；人工合成高分子材料虽有较强的可塑性和机械力，但降解速度慢且降解产物呈酸性，易引起周围组织非特异性炎症反应和免疫反应。天然生物材料，如胶原、壳聚糖、透明质酸、丝素蛋白等，无毒、无免疫原性，但不易成型，降解过快，生物力学特性不及人工合成材料。单一适用已不能满足临床治疗需要，复合型材料是生物材料工程学必然趋势。尤其备受关注的胶原作为细胞外基质的主要成分，因其天然的止血性，良好的粘附性，免疫原性低，促进细胞生长，诱导创伤修复等特点，对组织再生和修复有着重要作用。但很多研究采用低浓度胶原为基质进行生物材料构建，忽略了胶原在高浓度状态下可自组装配成胆甾型结构的液晶态。液晶态利于细胞黏附并趋向型生长。同时胶原也存在易生物降解，机械力不足等，限制了其单独作为生物材料的使用。
生物材料因不同的制备工艺而附有不同的生物特性。针对不易塑性的天然生物材料，多采用冷冻干燥、化学交联等，但存在机械力弱、化学毒性的缺陷。静电纺丝技术制备的纳米膜具有比表面积大、高孔性、超细纳米纤维结构等仿生外基质的特点，能够诱导细胞粘附、增殖，主动参与创面愈合过程，在组织损伤、修复治疗中得到广泛关注。用于静电纺丝材料常为人工合成材料与天然材料复合，纯天然材料、无细胞毒性材料复合甚少。且单一静电纺丝制备的纤维膜孔隙率高，表面较为粗糙，细胞不易与之响应，搭载活性基质可为细胞和组织提供更好的仿生环境。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供仿生纳米纤维材料和仿生纳米纤维材料的制备方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供一种仿生纳米纤维材料，包括丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜和液晶态胶原，一部分液晶态胶原填充在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的纤维孔隙中，另一部分液晶态胶原包覆于丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面。
第二方面，实施例提供一种仿生纳米纤维材料的制备方法，包括：将丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜和胶原溶液进行加压复合，使一部分胶原溶液填充至丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的纤维孔隙中，另一部分液晶态胶原覆盖在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面；然后于醋酸溶液蒸汽下，使所述胶原溶液中的胶原自组装配为液晶态胶原。
在可选的实施方式中，制备方法包括：
使第一平板、胶原溶液、丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜以及第二平板按层依次设置；
对第一平板或第二平板施加平行剪切力，使得一部分胶原液填充于丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的孔隙内，另一部分覆盖于丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面得到仿生纳米纤维材料初品，控制初品厚度为2～5mm；
将仿生纳米纤维材料初品置于0.4～0.6mol/L醋酸溶液蒸汽的密闭罐中平衡48～60h，使胶原自组装配成液晶态，然后将其移至含氨气的密闭容器中20～28h去除醋酸后，自然晾干得到仿生纳米纤维材料；优选地，第一平板和第二平板采用表面光滑的硅晶板或薄玻璃板。
在可选的实施方式中，胶原溶液中胶原的浓度为80～120mg/mL；优选地，每1cm
在可选的实施方式中，胶原为从动物肌腱上提取得到的胶原；更优选的，动物肌腱包括小鼠尾腱、大鼠尾腱或者猪脚肌腱。
在可选的实施方式中，从动物肌腱上提取胶原的方法包括：将动物肌腱浸泡于醋酸中，使胶原溶出，进行固液分离得到溶解有胶原的醋酸液，将溶解有胶原的醋酸液经透析后真空冷冻干燥得到冻干胶原；
在可选的实施方式中，醋酸的质量浓度为0.08～0.15％；
在可选的实施方式中，浸泡时间为48～50h；
在可选的实施方式中，采用离心的方式进行固液分离；更优选的，离心转速为3800～4200rpm，温度为3～5℃，离心时间为25～35min；
在可选的实施方式中，具体是将溶解有胶原的醋酸液装入透析袋，流水透析3～5d，双蒸水透析2～3d，于-85～-75℃下冷冻过夜保存后进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为72～76h。
在可选的实施方式中，胶原溶液是将冻干胶原溶解于乙酸溶液或盐酸溶液中，3～5℃下磁力搅拌20～24h，间隔超声使其分散均匀，置3～5℃保存备用；
在可选的实施方式中，乙酸溶液或盐酸溶液的浓度为0.4～0.6mol/L。
在可选的实施方式中，丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的制备方法包括：
采用高温湿热交联的方式使丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维交联、固化形成丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜；
在可选的实施方式中，高温湿热交联的处理温度为115～130℃，压力103～115kPa，时间为15～20min。
在可选的实施方式中，进行高温湿热交联之前还包括：将含有丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液通过静电纺丝的方式得到丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维；
在可选的实施方式中，含有丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液中壳聚糖和丝素蛋白的质量比为0.23～0.25:1；
在可选的实施方式中，含有丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液是将丝素蛋白和壳聚糖溶解于甲酸溶液中，经磁力搅拌后得到；更优选的，甲酸溶液的质量浓度为80～98％；更优选的，混合电纺液中丝素蛋白和壳聚糖的质量浓度为17～20％；进一步优选地，磁力搅拌时间为3～5h；
在可选的实施方式中，丝素蛋白是通过蚕丝脱胶、再生得到；
在可选的实施方式中，丝素蛋白的分子量为10～200Kda；优选地，壳聚糖的分子量为50～180Kda，脱乙酰度为75～85％。
在可选的实施方式中，静电纺丝时调节电压11～16KV，推进速度8～15ul/min，接收距离8～15cm。
上述仿生纳米纤维材料或上述的制备方法制得的仿生纳米纤维材料在医学敷料、药物载体、基因载体及细胞支架领域的应用。
本发明具有以下有益效果：
本仿生纳米纤维材料均以天然生物材料为原材料，具有无毒、低免疫原性、可降解性等特点，充分利用丝素蛋白优异的机械强度，壳聚糖的抗菌性，和胶原的细胞粘附性，三种特性互相补充，构建仿生材料。胶原液晶态呈现典型有序的胆甾型拓扑结构，能更好地促进细胞的黏附、趋化细胞及新合成的细胞外基质生长方向，更有利于组织损伤修复；以静电纺丝技术制备的丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜为骨架，将液晶态的胶原与丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜相结合，液晶态胶原作为骨架的细胞活性间质，不仅弥补了单纯电纺纳米纤维膜与细胞作用弱及细胞生长有序性的问题，同时进一步增强了电纺纳米纤维膜力学性能，使得构成的仿生纳米纤维材料具有良好的机械性、较强的细胞粘附性和取向性。使用时，覆盖在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜外的液晶态胶原粘附大量细胞，高度有序的液晶态结构诱导细胞取向性生长、繁殖，随着胶原逐步降解，细胞可以爬入孔隙内部进行立体式生长，利于细胞进行修复；仿生纳米材料可应用于敷料、组织工程支架、药物传递体中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1制得的仿生纳米纤维材料的SEM图；
图2为实验组细胞粘附率统计图；
图3为不同时间段实验组大鼠伤口愈合情况照片；
图4为实验大鼠愈合率统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的仿生纳米纤维材料及其制备方法与应用。
本发明实施例提供的仿生纳米纤维材料，包括丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜和液晶态胶原，一部分的液晶态胶原填充在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的纤维孔隙中，另一部分的液晶态胶原包覆于丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面。
天然生物材料丝素蛋白具有优异的机械强度，壳聚糖具有抗菌性，可有效抑制细菌繁殖，胶原具有优异的细胞粘附性，胶原液晶态呈现典型有序的胆甾型拓扑结构，能更好地促进细胞的黏附、趋化细胞及新合成的细胞外基质生长方向，更有利于组织损伤修复，以丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜为骨架，将液晶态的胶原与丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜相结合，使得构成的仿生纳米纤维材料具有良好的力学性、较强的细胞粘附性及无免疫原性，使用时，覆盖在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜外的液晶态胶原粘附大量细胞，随着胶原逐步降解，细胞可以爬入孔隙内部进行立体式生长，利于细胞进行修复；可应用于敷料、组织工程支架、药物传递体中。
本实施例提供的仿生纳米纤维材料的制备方法，包括：将丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜和液晶态胶原进行复合，使一部分液晶态胶原填充至丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的纤维孔隙中，另一部分液晶态胶原覆盖在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面。
具体制备步骤为：
S1、静电纺丝制备丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
(1)配制丝素蛋白和壳聚糖的混合电纺液。
将壳聚糖和丝素蛋白的质量比为0.23～0.25:1的混合物溶于质量浓度为80～98％的甲酸溶液中，经磁力搅拌3～5h得到分散均匀的混合电纺液。优选地，获得的电纺液质量分数为17～20％较佳。优选地，本发明提供的各个实施例中，选用的甲酸的浓度均为98％。
具体地，为保证制得的丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的综合性能更好，所用到的丝素蛋白是通过蚕丝脱胶、再生得到。具体做法为：
将家蚕茧去蛹，蚕茧洗净，溶解于0.5％Na2CO3水溶液中煮沸去除过敏原丝胶，干燥后溶解于CaCl2/C2H5OH/H2O(摩尔比为1∶2∶8)三元溶液，溶解后流水透析4～5d，双蒸水透析2～3d，透析液浓缩、冷冻干燥后获得丝素蛋白。其分子量为10～200Kda。
优选地，所用到的壳聚糖的分子量为50～180Kda，脱乙酰度为75～85％。
(2)将混合电纺液进行静电纺丝得到丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
将混合电纺液置于静电纺丝装置中，调节电压11～16KV，推进速度8～15ul/min，接收距离8～15cm进行静电纺丝，得到丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
采用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜，具有极高的比表面积和孔隙率，透气性好。
(3)丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维交联得到丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜。
将丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维至于高压蒸汽灭菌装置中，控制装置温度为115～130℃、压力为103～115kPa，进行高温湿热交联15～20min，以保证纤维交联成膜，并且达到灭菌的效果。
S2、制备高浓度胶原溶液。
(1)从动物肌腱上提取胶原制备冻干胶原。
将动物肌腱浸泡于醋酸中，使胶原溶出，进行固液分离得到溶解有胶原的醋酸，将溶解有胶原的醋酸冷冻干燥得到冻干胶原。
具体地，在本申请中，动物肌腱一般包括小鼠尾腱、大鼠尾腱或者猪脚肌腱。
优选地，为保证不破坏胶原结构，而又能更快将其提取出来，醋酸的质量浓度为0.08～0.15％，本申请各实施例中用到的醋酸的浓度为0.1％。
优选地，为保证完全提取出胶原，浸泡时间为48～50h。
优选地，采用离心的方式进行固液分离以保证具有更好的分离效果，离心后的上清液则为溶解有胶原的醋酸。
更优选的，为保证有较好的离心分离效果，离心分离时，离心转速为4000rpm，温度为3～5℃，离心时间为25～35min。
优选地，为得到纯净胶原，将溶解有胶原的醋酸溶液装入透析袋中，流水透析3-4天，双蒸水透析2-3天。
进一步优选地，为更好实现冷冻干燥，将溶解有胶原的醋酸于-85～-75℃下冷冻过夜保存后进行真空冷冻干燥，冷冻干燥时间为72～76h。
(2)溶解冻干胶制备为胶原溶液。
将冻干胶原溶解于浓度为0.4～0.6mol/L的乙酸或盐酸溶液中，低温磁力搅拌并间隔超声，使其溶解完全得到浓度为80～120mg/mL的胶原溶液。将胶原溶液置于3～5℃的环境下备用。
S3、在外力作用下，将丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜与胶原复合。
将温度为3～5℃的胶原溶液取出，采用超声仪超声20～30min，使胶原分散均匀。
将均匀分散后的胶原溶液平铺于玻璃板或硅晶板上，玻璃板或硅晶板的尺寸大小与所要获得的目标纳米纤维膜大小匹配。采用外力将丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜与胶原溶液复合。
上述外力主要指来自外部的压力，或者平行剪切力，施加平行剪切力是指使两个平板实现相对挤压，且相互“切磋”使两个平板在平行于平板的方向上具有相对运动的趋势。
具体是：
1.使第一平板、胶原溶液、丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜以及第二平板按层依次设置。
2.对所述第一平板或所述第二平板施加平行剪切力实现两个平板相对挤压、切磋，使得一部分胶原溶液填充于所述丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的孔隙内，另一部分覆盖于所述丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的表面得到仿生纳米纤维材料初品；初品厚度为2～5mm。将仿生纳米纤维材料初品置0.4～0.6mol/L醋酸溶液蒸汽的密闭罐中平衡48～60h，使胶原自组装配成液晶态，然后将其移至含氨气的密闭容器中20～28h去除醋酸后，2～3d自然晾干，进一步得到仿生纳米纤维材料。
高浓度胶原以粘稠液的形式负载于丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜上，在将两者复合时，不需要施太大的力，通过人手施较小的力也能使粘稠液轻易渗入丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的孔隙内。
上述的晾干方式可以是低温风干，也可以是常温放置48小时以上自然晾干。
优选地，每1cm
在制备过程中，为确保丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜上能够较为精确负载胶原，可以将一定量的胶原溶液倒入平板容器中，然后在胶原液上铺设与平板容器面积对应的丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜，再在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜上扣另一相同尺寸的平板，扣好后，向上方的平板缓慢施加平行剪切力，使胶原完全负载在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜上。
本发明提供的各个实施例的具体做法是，将胶原溶液平铺在玻璃板面上，丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜覆盖于胶原上，然后将另一块玻璃板扣上，并施加平行剪切力，第一、二平板相对“切磋”，使胶原填充在纳米纤维孔隙中且覆盖于表面，获得仿生纳米纤维材料初品。初品厚度为2～5mm。将仿生纳米纤维材料初品置含0.4～0.6mol/L醋酸溶液蒸汽的密闭罐中平衡48～60h，胶原自组装配成液晶态，然后将其移至含氨气的密闭容器中20～28h去除醋酸后，2～3d自然晾干，得到仿生纳米纤维材料。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的仿生纳米纤维材料的制备方法，具体是：
首先制备高浓度胶原溶液：
抽取大鼠尾腱，置于0.1％醋酸溶液中溶解48h，4000rpm，4℃，离心30min，取上清液，透析7d。将透析液-80℃冷冻过夜保存，置冷冻干燥仪内，冷冻干燥72h获得冻干胶原。将冻干胶原溶解于0.5mol/L乙酸溶液，配制成120mg/mL的溶液，低温磁力搅拌至溶解，采用低温间隔超声法使胶原分散均匀，放入4℃冰箱保存，使用前超声20min，使胶原分散均匀其次制备纺丝液：
提取再生丝素蛋白：将蚕茧洗净，溶解于0.5％Na2CO3水溶液中煮沸去除过敏原丝胶，干燥后溶解于CaCl2/C2H5OH/H2O(摩尔比为1∶2∶8)三元溶液，溶解后流水透析7天。透析液浓缩、冷冻干燥后获得丝素蛋白。
再次配置丝素蛋白、壳聚糖混合电纺液：
将壳聚糖和丝素蛋白质量比为0.23混合物，溶于98％的甲酸溶液，经磁力搅拌3h，溶质充分溶解，获得质量分数为16％电纺液。然后制备丝素蛋白/壳聚糖静纳米纤维：
将装有丝素蛋白-壳聚糖电纺液的注射器，安装到高压静电纺丝装置进行纺丝，调节高压电源电压11KV，注射速率为8ul/min，针尖到接收板的距离为8cm，接收板上获得丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
接着交联、灭菌丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜，将其放高温蒸汽灭菌器中，于121℃下湿热灭菌15min。通过湿热灭菌，丝素蛋白-壳聚糖纤维丝发生交联，增强丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的机械力，同时使其处于无菌状态。
最后制备仿生纳米纤维材料：
将120mg/mL胶原溶液平铺在玻璃板面上，丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜覆盖于胶原上，然后将另一块玻璃板扣上，并对其施加平行剪切力，第一、二平板相对“切磋”，使胶原溶液填充在纳米纤维孔隙中且包覆于表面，每1cm
实施例2
本实施例提供的仿生纳米纤维材料的制备方法，具体是：
首先制备高浓度胶原溶液：
抽取大鼠尾腱，置于0.1％醋酸溶液中溶解50h，3800rpm，3℃，离心25min，取上清液透析7d。将透析液-85℃冷冻过夜保存，置冷冻干燥仪内，冷冻干燥76h获得冻干胶原。将冻干胶原溶解于0.4mol/L乙酸溶液，配制成100mg/mL的溶液，低温磁力搅拌至溶解，采用低温间隔超声法使胶原分散均匀，放入4℃冰箱保存，使用前超声30min，使胶原分散均匀。
其次制备纺丝液：
提取再生丝素蛋白：将蚕茧洗净，溶解于0.5％Na2CO3水溶液中煮沸去除过敏原丝胶，干燥后溶解于CaCl2/C2H5OH/H2O(摩尔比为1∶2∶8)三元溶液，溶解后流水透析7天。透析液浓缩、冷冻干燥后获得丝素蛋白。
再次配置丝素蛋白、壳聚糖混合电纺液：
将壳聚糖和丝素蛋白质量比为0.25混合物，溶于98％的甲酸溶液，经磁力搅拌3h，溶质充分溶解，获得质量分数为17％电纺液。然后制备丝素蛋白/壳聚糖静纳米纤维：
将装有丝素蛋白-壳聚糖电纺液的注射器，安装到高压静电纺丝装置进行纺丝，调节高压电源电压16KV，注射速率为15ul/min，针尖到接收板的距离为15cm，接收板上获得丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
接着交联、灭菌丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜，将其放高温蒸汽灭菌器中，于115℃下湿热灭菌20min。通过湿热灭菌，丝素蛋白-壳聚糖纤维丝发生交联，增强丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的机械力，同时使其处于无菌状态。
最后制备仿生纳米纤维材料：
将100mg/mL胶原溶液平铺在玻璃板面上，丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜覆盖于胶原溶液上，然后将另一块玻璃板扣上，并对其施加平行剪切力，第一、二平板相对“切磋”，使胶原溶液填充在纳米孔隙中且包覆于表面，每1cm
实施例3
本实施例提供的仿生纳米纤维材料的制备方法，具体是：
首先制备高浓度胶原溶液：
抽取小鼠尾腱，置于0.1％醋酸溶液中溶解49h，4200rpm，5℃，离心35min，取上清液,透析7d。将透析液-75℃冷冻过夜保存，置真空冷冻干燥仪内，冷冻干燥74h获得冻干胶原。将冻干胶原溶解于0.6mol/L乙酸溶液，配制成80mg/mL的溶液，低温磁力搅拌至溶解，采用低温间隔超声法使胶原分散均匀。放入4℃冰箱保存，使用前超声25min，使胶原分散均匀。
其次制备纺丝液：
提取再生丝素蛋白：将蚕茧洗净，溶解于0.5％Na2CO3水溶液中煮沸去除过敏原丝胶，干燥后溶解于CaCl2/C2H5OH/H2O(摩尔比为1∶2∶8)三元溶液，溶解后流水透析7天。透析液浓缩、冷冻干燥后获得丝素蛋白。
再次配置丝素蛋白、壳聚糖混合电纺液：
将壳聚糖和丝素蛋白质量比为0.24混合物，溶于98％的甲酸溶液，经磁力搅拌4h，溶质充分溶解，获得质量分数为17％电纺液。然后制备丝素蛋白/壳聚糖静纳米纤维：
将装有丝素蛋白-壳聚糖电纺液的注射器，安装到高压静电纺丝装置进行纺丝，调节高压电源电压14KV，注射速率为10ul/min，针尖到接收板的距离为12cm，接收板上获得丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维。
接着交联、灭菌丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜，将其放高温蒸汽灭菌器中，于130℃下湿热灭菌18min。通过湿热灭菌，丝素蛋白-壳聚糖纤维丝发生交联，增强丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜的机械力，同时使其处于无菌状态。
最后制备仿生纳米纤维材料：
将80mg/mL胶原溶液平铺在玻璃板面上，丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜覆盖于粘胶原溶液上，然后将另一块玻璃板扣上，并对其施加平行剪切力，第一、二平板相对“切磋”，使胶原溶液填充在纳米孔隙中且包覆于表面，每1cm
实验例
将实施例1制得的仿生纳米纤维材料进行各项性能测试，具体过程如下：
(1)对胶原液晶相复合纳米纤维膜的形态检测
取一小块制得的胶原液晶相复合纳米纤维膜贴于导电胶并固定在样品台上，在金箔中喷金约10s，于扫描电压5.0kV条件下扫描电镜观察其形貌。结果如图1所示。SEM观察纳米纤维直径较小且较为均一，孔隙较多，胶原均一散布在丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维孔隙中。
(2)胶原液晶相复合纳米纤维膜细胞粘附性检测
将附有纳米纤维膜(丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维膜SF-CS、实验例1提供的仿生纳米纤维膜SF-CS-COL分别置于24孔板中，每个时间节点设置3个平行样本，空白爬片(TCP)做对照。75％乙醇浸泡2h，吸出，晾干，用PBS漂洗3次；最后加入1mL空白培养基浸泡2h后吸出，置37℃，5％CO2培养箱中过夜晾干；加入1×105个/mLNIH3T3细胞悬液200μL接种后1h，3h，5h分别检测实验组和对照组的细胞粘附率，设平行组3孔，吸出培养液，按照公式(1)计算细胞粘附率R(％)。式中C0为种植细胞数，C1为悬浮细胞数。
公式(1)：细胞粘附率R(％)＝[C0-C1)/C0]×100％
将以上每组3孔求平均值记为粘附率，结果如图2所示。从图2中可看出，本实施例提供的仿生纳米纤维膜的细胞粘附率明显高于其他两组。
(3)胶原液晶相复合纳米纤维膜对伤口愈合作用考察
采用重约200～250g的雄性SD大鼠作为实验动物，随机分5组，每组3只平行试验，裁剪大小1.2cm×1.6cm的纳米纤维膜包括丝素蛋白-壳聚糖纳米纤维(SF-CS)和胶原复合纳米纤维膜(SF-CS-COL)和凡士林纱布(VG)。将5组大鼠背部脱毛，消毒，在背部脊柱两侧制造3个1.0cm×1.5cm皮肤全层损伤创面，按照顺序(左前，右前，左后，右后)依次贴上VG、SF-CS-COL与SF-CS，术后第0、3、7、11、14、20d，观察创面外观，拍照，结果如图3所示。测量创面面积，采用公式(1)计算愈合率，结果如图4所示。
创面愈合率＝(原始创面积-伤后n天残余创面面积)/原始创面积×100％
创面愈合大体观察结果显示(图3)术后3d创面肿胀，VG组出现明显渗出液，术后7d时创面缩小，SF-CS-COL组创面鲜红，结痂轻薄，创面收缩速度最快。VG组创面结痂较厚，有坏死血凝块出现。术后20dSF-CS-COL组创面完全愈合，新生毛发覆盖，其他组未完全愈合。愈合率统计结果显示(图4)7d后SF-CS-COL组的创面愈合率均高于其他组，其中第11d和第20d，与VG组相比有统计学差异(P＜0.05)。结果表明SF-CS-COL较SF-CS、VG组均有明显的促进伤口愈合能力。
综上所述，本发明提供的仿生纳米纤维材料及其制备方法具有以下特点：(1)采用静电纺丝技术及胶原自组装配工艺制备的胶原液晶相复合纳米纤维膜，具有极高的比表面积和孔隙率，透气性好；液晶相胶原作为纳米纤维膜的活化基质，其特有的拓扑结构利于初期细胞的黏附和取向性生长。(2)以天然生物材料为原料，无毒、无免疫原性，充分利用丝素蛋白的机械力、壳聚糖的抑菌性及胶原止血、黏附性，将三种材料的优势有机结合，使得胶原液晶相复合纳米纤维膜具有较高的生物相容性、较强的抑菌性和机械力，非常适用于皮肤、肌腱、软骨等组织损伤修复。(3)此外此胶原液晶相纳米纤维膜还具有梯度的降解性，具有缓释功能。最初覆盖纳米纤维膜表面的液晶相胶原黏附足够的细胞，随着胶原的降解，细胞逐步爬入丝素-壳聚糖纳米纤维内进行生长、繁殖，在逐步合成天然细胞外基质同时，丝素-壳聚糖纳米支架逐渐降解至创伤愈合，不需要更换材料，避免造成二次损伤。(4)胶原液晶相纳米纤维膜的梯度降解性，可作为药物载体，缓释药物成分，达到持续、长久修复。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
仿生纳米纤维材料及其制备方法与应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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